[المرحلة الثانية [ األحياء المجهرية -العملي وزارة التعليم العالي والبحث العلمي جامعة الموصل كلية العلوم - قسم علوم الحياة األحياء المجهرية المرحلة الث

النسخ

1 وزارة التعليم العالي والبحث العلمي جامعة الموصل كلية العلوم - قسم علوم الحياة األحياء المجهرية المرحلة الثانية العملي التقويم العلمي د. أديبة يونس شريف أنمار أحمد الطائي مدرس مساعد إعداد شبابة عبداللطيف بهجت مدرس مساعد 1

2 ت ه المحتويات الموضوع 4002 م رقم الصفحة ارشادات عامة... 7 دور األحياء المجهرية في حياة اإلنسان... 8 المجهر واكتشافه...11 عزل البكتريا من البيئة...12 أ. طريقة القطرة المعلقة ب.الفلو ار الطبيعية للجلد Hanging drop Slide Normal Skin Flora طرق نقل وعزل البكتريا تحت ظروف معقمة تصبيغ البكتريا أ. تحضير المسحة ب.الصبغة البسيطة 17...Simple Stain ج.الصبغات التفاضلية ( التفريقية ) صبغة ك ارم صبغة السبور...22 الصبغة الصامدة للحمض 4- صبغة الكبسول االسواط )الصبغة السالبة( والحركة...28 طرق د ارسة الحركة أ. فحص الحركة باستخدام القطرة المعلقة ب. ج. فحص الحركة باستخدام U-Shaped tube ظاهرة العج...22 السيطرة على نمو االحياء المجهرية )التعقيم والتطهير( أوال : الطرق الفيزياوية

3 ثانيا : الطرق الكيمياوية...36 ثالثا : الطرق الميكانيكية...41 االوساط الزرعية...41 طريقة تحضير األوساط الزرعية...44 أنواع البيئات الغذائية طرق الحصول على م ازرع نقية...47 التحضين الهوائي التقدير الكمي للنمو البكتيري أ- ب- والالهوائي الطرق المباشرة...52 الطرق غير المباشرة التخافيف...58 تمارين في التخفيف...52 تأثير أ- العوامل البيئية على نمو البكتريا تشخيص البكتريا...63 ب- ج- د- ه- و- ز- ح- ط- ي- ك- اختبا ارت اختبار اختبار IMViC تخمر السكريات TSI الكشف عن إنتاج األنزيم المحلل للجيالتين الكشف عن اختبار انزيم Gelatinase Oxidase أنت ازع مجموعة األمين من الحامض األميني الفنياللنين Phenylalanin-Deaminase اختبار اخت ازل النت ارت...75 اختبار انزيم الكشف عن اختبار انزيم اليوريز انزيم التجلط Urease Catalase Coagulase اختبار تحلل النشا...81 ل-اختبار حساسية البكتريا للمضادات الحياتية )طريقة م- ن- اختبار االخت ازل )Kirby Bauer 84...Reductase Test تقدير كفاءة المطه ارت

4 س- تشخيص البكتريا باألنظمة التجارية السريعة المصادر References مالحق األشكال

5 الصور واالشكال ت الموضوع استخدام البكتريا في التقنيات الحياتية مجهر ليفنهوك المجهر الضوئي استخدام الزيت مع العدسة الزيتية خطوات تحضير القطرة المعلقة طريقة نقل البكتريا من مزروع سائل طريقة تلقيح الوسط المغذي السائل طريقة تلقيح مائل األكار المغذي من طبق بتري طريقة تلقيح مائل األكار من مزرعة مائلة الفرق بين الحركة الب ارونية والحركة الحقيقية طريقة تحضير المسحة التصبيغ البسيط صبغة ك ارم اهم التغي ارت في خطوات صبغة ك ارم الفرق بين تركيب جدار بكتريا الموجبة والسالبة لك ارم السبور في شريحة لصبغة ك ارم تصبيغ السبور سبو ارت بكتريا رقم الصفحة Bacillus cereus سبو ارت البكتريا المسببة لمرض الك اززtetani Clostridium الصبغة الصامدة للحمض خاليا بكتريا مرض السل الطريقة الرطبة لتصبيغ الكبسول تصبيغ الكبسول بالطريقة الرطبة صبغة الكبسول بطريقة هس صورة لمستعم ارت ترتيب االسواط Klebsiella pneumoniae اللزجة 5

6 ت الموضوع اختبار الحركة في وسط نصف صلب ظاهرة العج جهاز الموصدة طريقة التعقيم بالترشيح اشكال صب االوساط الزرعية وسط ماكونكي وسط المانيتول انواع تحلل الدم على وسط اكار الدم الوسط الخاص ببكتريا السل media( )lowenstein - jensen الفرق بين مستعم ارت بكتريا السل البقري والبشري طريقة النشر طريقة التخطيط. Streaking طريقة صب االطباق تحديد متطلبات االوكسجين للبكتريا وعاء التحضين الالهوائي طريق اريت للتحضين الالهوائي طبق رقم الصفحة Brewer الالهوائي طريقة تحضير شريحة بريد شريحة Micrometer شريحة العد )الهيموسايتوميتر( ابعاد شريحة العد طريقة تحضير شريحة العد كيفية تعداد الخاليا طرق اج ارء التعداد الحي التعداد الحي بطريقة صب االطباق باستخدام التخافيف العشرية انواع البكتريا حسب تحملها لدرجة الح اررة مدى درجة الحموضة لبعض االحياء المجهرية نتائج اختبار االندول من اليمين الى اليسار 6

7 ت الموضوع ميكانيكية اختبار االندول درجة الحموضة في اختباري اختبار المثيل االحمر اختبار الفوكس بروسكاور رقم الصفحة MR, VP ميكانيكية اختبار استهالك الست ارت نتائج اختبار استهالك الست ارت ختبا ارت IMViC تخمر السكريات وانتاج الغاز اختبا ارت تخمر السكريات مكونات وسط اختبار TSI TSI اختبار الجيالتين اختبار االوكسديز اختبار الفنياللنين اختبار اخت ازل النت ارت اختبار اليوريز اختبار الكتاليز اختبار التجلط اختبار تحلل النشا من قبل بكتريا طريقة كربي الختبار الحساسية اختبار االخت ازل تقدير كفاءة المطه ارت نتائج ال Bacillus subtilis) API 20E لبكتريا Pseudomonas aeruginosa الموجبة لالختبار( 7

8 إرشادات عامة العديد من األحياء المجهرية التي سنتعامل معها خالل هذا المختبر قد تكون ممرضة لإلنسان لذلك هناك بعض التعليمات الضرورية لمنع أي احتمال لالصابة بها يرجى ق ارءتها قبل البدء بالدرس: -1 يجب ارتداء الصدرية عند دخول المختبر لتالفي التلوث واالصباغ. 2- ضع الحقائب الكتب على مكان بعيد عن منطقة العمل. اغسل اليدين بالماء والصابون ثم الديتول قبل وبعد االنتهاء من العمل. ينظف مكان العمل باستخدام االسفنجة والديتول أو أي مطهر متوفر قبل وبعد العمل. تجنب االكل والشرب والتدخين في جميع االوقات داخل المختبر وقلل الحركة والكالم اثناء العمل. تجنب وضع االقالم أو تبلل الالصق في الفم. اعتني بنظافة المجهر وعدساته. عناية خاصة بمكان العمل. حافظ على نظافة المختبر. المواد المطلوبة: أ- صدرية. ب- ج- د- ه- و- دفتر مختبر. قلم تأشير )يكتب على الزجاج(. ورق عدسات. مطهر. مقدحة. ي- صابون أو أي منظف قاصر فالش. عقم وجفف واع د االدوات إلى مكانها بعد االنتهاء. 8

9 علم االحياء المجهرية االحياء المجهرية كائنات تتواجد بشكل خاليا مفردة أو Microbiology Microorganisms متجمعة و البكتريا تشمل: bacteria fungi البدائيات protozoa الفايروسات صغيرة للغاية ال ترى بالعين المجردة. الطحالب التي قد يصل طولها إلى عدة امتار. لو viruses دور االحياء المجهرية في حياة االنسان: مضار االحياء المجهرية : الفطريات جميع هذ الكائنات تشترك بكونها ما عدا بعض الحاالت مثل mushroom وبعض استعرضنا االوبئة واالم ارض التي مرت بها البشرية والتي غيرت تاري شعوب باكملها لنجد ان هذ الكائنات قتلت من الناس اضعاف ما قتل بسبب الحروب. ذلك: ومن امثلة * عدد الوفيات المتسبب عن مرض االنفلون از ) ( كان اكثر من عدد القتلى في الحروب )الحرب العالمية الثانية االولى * الطاعون pertusis) plaque (Yersinia ) 25 مليون( في العصور الوسطى. في العالم. من خالل السيطرة على الجرذان. * الجدري )مرض فايروسي( ادى إلى موت اكثر من الحرب الكورية الذي تسبب بموت اكثر من حرب فيتنام( مجتمعة. 3/1 اما االن فال يتجاوز عدد سكان المصابين به ال سكان اوربا ماليين مريض. وهو من االم ارض القوية والتي تم السيطرة عليه من خالل ب ارمج عالمية للتلقيح والقضاء على المضيف الوسطي اضافة إلى. * فساد االغذية. فوائد تعد 1- االحياء المجهرية: المسؤولة عن بقاء الكائنات الحية االخرى بما فيها االنسان على قيد الحياة. اذ تقوم البكتريا بتحويل غاز النايتروجين الذي يعد الجزء المسؤل عن بناء اهم الجزيئات في الجسم مثل البروتينات... DNA الكيميائية المناسبة لالستهالك من قبل النبات. تقوم البكتريا بتحويل هذا الغاز إلى الصيغة 9

10 2- كل الكائنات تحتاج إلى االوكسجين. ولو تم استهالك هذا الغاز من قبل كل الكائنات الحية قد يستنفذ خالل 21 سنة ما لم يعوض. االحياء المجهرية هي المسؤولة االولى عن تعويض االوكسجين )وتشاركها النباتات في ذلك(. 3- تنفرد االحياء المجهرية بقدرتها على تحليل العديد من المواد في الطبيعة. مثال الكم الهائل من الكربوهيد ارت الموجودة على سطح االرض كالسيليلوز الذي من الصعب هضمه من قبل االنسان أو الحيوان. و لوال وجود االحياء المجهرية لت اركمت كل السيقان واالو ارق على وجه االرض لتبقى كما هي في البيئة. اضافة إلى ذلك هنالك الماليين من هذ الكائنات في معدة الماشية واالبقار تعمل على هضم السليلوز النتاج الطاقة وبالتالي توفر لنا مصدر من البروتين. 4- تلعب دور في تحليل الملوثات في ميا المجاري التربة و الغا ازت تدعى هذ العملية bioremediation وهي عملية االستفادة من االحياء المجهرية للتخلص من المركبات السامة التي قد تؤدي إلى تشوهات خلقية حدوث السرطان اوحتى الموت. 5- تحلل الكائنات الميتة إلى مواد عضوية كما تساعد في تعرية الصخور وتحرير العناصر منها. 6- تساهم في انتاج الوقود والنفط من المتحج ارت. وهي عملية طويلة االمد تتم بوجود مواد عضوية في اعماق االرض وتحت درجات ح اررية عالية وظروف الهوائية وضغط عال حيث تقوم البكتريا باكسدة هذ المواد وتحولها إلى نفط خام. 7- تستخدم االحياء المجهرية لصناعة الخبز الخل الجبن االدوية.. ال. وفي السنوات االخيرة استخدمت التقنية الحياتية النتاج العديد من المواد المهمة مثل االنسولين واالنترفيرون )شكل 1(. يعتقد ان البكتريا نشأت والول مرة من كيان حياتي معين حينما كان كوكب االرض خال من االوكسجين وملىء بالب اركين وظروف ح اررية عالية. تدل المتحج ارت على ان عمر االحياء المجهرية هو بحدود بليون سنة. 11

11 المجهر وأكتشافه احياء صغيرة ال ترى بالعين المجردة. بسيطة مكبرة يصل تكبيرها إلى 2-11x. ثم في عام لذلك لم تكتشف اال بعد اكتشاف عدسات الوقت من قبل العالم هوك الذي تمكن من الحصول على تكبير سجل اكبر انجاز في ذلك.211 x 1676 استطاع العالم ليفنهوك ان يصنع اول مجهر قوة ذو تكبير 311x. استخدم ليفنهوك مجهر البسيط لفحص عينات من االد ارر االسنان )شكل واخي ار في عام.)2. ال الدم. وفي العديد من هذ العينات الحظ اجسام صغيرة متحركة البعض منها يعرف االن باالبتدائيات والبعض االخر بكتريا سماها جميعا ب."animalcules" قام بعد ذلك بتقديم هذ المالحظات الدقيقة إلى الجمعية الملكية في بريطانيا. هذا الحدث اشبه بنزول االنسان من المجاهر المختلفة. يعتبر المجهر المركب على القمر. كان منذ ذلك الوقت توالت االكتشافات النواع عديدة compound microscope أو المجهر الضوئي bright field microscope لفحص العينات حجم الذي من اهم مستلزمات مختبر االحياء المجهرية.يستخدم هذا المجهر له تصل وحركة الكائنات المجهرية. )شكل قوة التكبير إلى 1111 x )3-1 يحتوي على نوعين من العدسات: العدسات العينية.(10x) ocular lens -2 العينية العدسات الشيئية objective lens (4x, 10x, 40x, 100x). x ان وهي كافية لفحص شكل هذ العدسات تعمل معا لتعطي تكبي ار يساوي حاصل ضرب تكبير العدسة تكبير العدسة الشيئية. اما المكثف condenser والشريحة فليس له عالقة بالتكبير بل لتوضيح االضاءة. resolving power بعضهما. الذي يقع بين المصدر الضوئي فائدة المجهر ال تقتصر على التكبير بل تتحدد بقدرة وهي التمييز وتعرف بانها اقل مسافة بين شيئين ممكن رؤيتهما منفصلين عن تعتمد على نوعية العدسات قوة التكبير تتحدد قوة التمييز عند التكبير العالي بالطول الموجي للضوء. قصير كانت قوة التمييز اعلى. الضوئية تساوي لتوضيح جزيئة الفايروس. 0.2 micrometer و طريقة تحضير الشريحة.كذلك اذكلما كان الطول الموجي وعلى هذا االساس ان الحد االعلى لقوة التمييز في المجاهر وهي تكفي لد ارسة المظهر العام للخلية ولكن ال تكفي

12 للحصول على اعلى قوة تمييز باستخدام العدسة الزيتية يستخدم احد انواع الزيوت المستخرجة من خشب نبات oil immersion lens 100x cedarwood oil ليحل محل الهواء بين الشريحة والعدسة فائدة هذا الزيت تكمن في ان معامل انكسار الزيت يساوي معامل انكسار الزجاج وبالتالي يمنع تشتت أو تغيير مسار االشعة الضوئية أي انه يعمل على تجميع الحزمة الضوئية المارة خالل العينة ( شكل 4 (. * يجب ان يكون الزيت ارئق خال من التضبب بعض االج ارءات الهامة لصيانة وحماية المجهر: * عند نقل المجهر من مكان إلى اخر يرفع المجهر من الذ ارع بيد وتوضع اليد االخرى تحت القاعدة. * يحفظ في دوالب مغلق بعيدا عن االتربة. * تنظف العدسات قبل وبعد االستخدام بورق تنظيف العدسات وال ازيلين االستيون + كحول. أو Xylene * تحذير: االسيتون لوحد مذيب قوي قد يذيب المادة الالصقة للعدسات لذلك يحذر من استخدامه. كما يمكن استخدام cotton swab بدال من ورق العدسات. 12

13 عزل البكتريا من البيئة الغذاء ال أ- Isolation of bacteria from the environment. كل ما حولنا مليء بالحياة فهناك احياء في الهواء حياة ال نعرف عنها اال القليل طريقة القطرة المعلقة Hunging Drop Slide في التربة احياء تنظر الينا كفريسة لها. * كل متر مكعب من الهواء يحتوي على مئات االالف من البكتريا العطاس االنفلون از يتحرر من الفطريات ال في الماء. 11 الجدري ماليين جرثومة. عن طريق الهواء. تمكنت من عزل بكتريا من عينة هواء اخذت عن بعد عند ال عجب ان تنتشر االم ارض مثل السل يذكر ان احد الصواري التي اطلقتها روسيا ميل. 41 nutrient agar المواد المطلوبة: * مجهر ضوئي loop * * شريحة القطرة المعلقة Hanging Drop Slide Swab * * مزرعة بكتريا في وسط مغذي سائل * ديتول * وسط مغذي سائل nutrient broth ووسط مغذي صلب طريقة العمل: 1- تعقيم االيدي والمناضد بالمطهر قبل البدء بالعمل. 2- تنظيف شريحة القطرة المعلقة بالماء والصابون وتجفف جيدا مع الغطاء. 3- تتبع الخطوات الموجودة في )الشكل ( افحص تحت قوة التكبير 11 ثم حول على قوة التكبير االعلى. ثم سجل ما تشاهد. * يجب االس ارع في فحص العينة وذلك الن التاخير قد يؤدي إلى تكاثف الماء المحصور بين الغطاء والشريحة وبالتالي عدم وضوح الرؤية اضافة إلى تباطؤ حركة البكتريا مع مرور الوقت. 13

14 ب- الطبيعية الفلو ار الطبيعية للجلد Norrmal skin flora االحياء المجهرية التي تتواجد بشكل طبيعي على الجسم أو فتحاته تدعى الفلو ار Normal flora تعتبر هذ الكائنات تعايشية المضيف بل احيانا تلعب دو ار هاما لصالحه. بسبب تنافسها مع االحياء الممرضة على المواد الغذائية انزيمات أو مواد مثبطة للكائنات الغريبة على الجسم. commensals حيث تمنع الكائنات المضرة النها ال تضر من مهاجمة الجلد اضافة الى ان بعضها قد ينتج التعرف على هذ االحياء الموجودة طبيعيا على الجلد غاية في االهمية النها كثي ار ما تصادفنا كملوثات في الهواء الجلد التي تتناثر باستم ارر وتبقى في الجو(. -1 الحيوانات. Staphylococcus epidermidis -2 كروية من اهم انواع هذ البكتريا: )على خاليا وعنقودية التجمع )تحت المجهر( تتواجد طبيعيا على جلد االنسان وبعض Staphylococcus aureus على االقل االشخاص من %21 )بشكل طبيعي( وهي ال تضر المضيف ولكنها إذ تسبب التسمم الغذائي الجروح. او Micrococcus luteus -3 الملوثة للهواء. يحملون تكون هذ الجرثومة خاصة في فتحات االنف عند دخولها ممرضة كروية تتواجد على الجلد لبعض االشخاص وهي غير ممرضة. Propionbacterium acnes -4 عصيات ال هوائية )يعتقد انها تسبب propionbacterium granulosum -5 المواد: -1-2 القطن. %71. كحول.cotton swab -3 محلول 4- الملح الفسلجي المعقم حب الشباب عصيات غير ممرضة. %NaCI( saline إلى داخل الجسم وهي احد الج ارثيم بسبب عزلها من هذ المناطق(. 1.2 في الماء(. 14

15 اطباق 5- طريقة العمل:.nutrient agar -1 تمسح منطقة الجلد بقطعة قطن مشبعة بالكحول %71 بتركيز -2-3 من االحياء المجهرية غير المتوطنة organisms( (Transient من ا الفلور تترك لتجف. ترطب ال الطبيعية. swab بالسالين ويمسح الجلد في منطقة محددة لمدة دقيقة ولتطهير المنطقة يفتح الطبق تحت ظروف معقمة ويلقح التخلص من المسحة يحضن الطبق في الحاضنة لمدة سطح االكار بواسطة بوضعها في بيكر يحتوي على ديتول. ساعة 24 عند درجة ح اررة 37-6 تفحص االطباق وتدرس انواع المستعم ارت واشكالها ما الوانها والتي ال تشكل جزء ثانية. مسحة القطني ويتم م. قوامها.. اما لد ارسة الفلو ار في الهواء يترك الطبق مفتوح في المختبر لمدة نصف ساعة ثم يغلق ويحضن بنفس الطريقة. 15

16 ال طرق نقل وعزل البكتريا تحت ظروف معقمة تتواجد البكتريا في الطبيعة في بيئات مناسبة لها من درجة ح اررة و PH اما في المختبر. تدعى فتنمى البكتريا على مواد تدعى االوساط الزرعية. االداة التي تستخدم لنقل البكتريا من مكان إلى اخر loop ب و رطوبة وهي عبارة عن سلك من البالتين أو الكروم + النيكل حيث تتميز هذ المعادن بانها تسخن بسرعة وتبرد بسرعة. طريقة العمل: بعد اش ارف التدريسي. غسل وتعقيم اليدين والمنضدة تتبع الخطوات المبينة في ( االشكال 2-6 ( تحت 16

17 تصبيغ البكتريا Bacterial Staining لو فحصنا البكتريا تحت المجهر بشكلها الطبيعي وبدون تصبيغ لشاهدنا اجسام صغيرة حية وشفافة ودقيقة واحيانا متحركة )كما شاهدنا في طريقة القطرة المعلقة(. كذلك saline يمكن فحص البكتريا بصورتها الطبيعية بعد تعليق الخاليا في المحلول الفسيلوجي ثم تؤخذ قطرة من العالق وتوضع على شريحة نظيفة ثم يوضع الغطاء وتفحص. هذ الطريقة تدعى ب wet mount ممكن ان نشاهد البكتريا واحيانا بعض الحبيبات داخل الكائنات المجهرية. * مالحظة: عند فحص عالق من البكتريا بالطرق اعال نالحظ ان حركة البكتريا نوعان: - الحركة الب ارونية Brownian movement 1 هي حركة غير حقيقية للبكتريا تظهر نتيجة تذبذب او اهت ازز البكتريا تصادم نتيجة جزيئات المحلول مع خاليا البكتريا وهي تحصل بين الجزيئات ضمن المحلول. 2- حركة البكتريا: وهي حركة ناتجة عن امتالك بعض االنواع من البكتريا على اعضاء الحركة او االسواط flagella البكتريا من مكان الى اخر)شكل 11 (. ان شفافية الخاليا وحركتها المستمرة تجعل من الصعب د ارسة الخاليا البكترية بشكل مفصل لذلك نلجأ الى تصبيغ البكتريا لكي تبدو الخاليا بشكل اوضح وبشكل ثابت يسمح لنا بالفحص المطول. Smear Preparation تحضير المسحة أ- اول واهم خطوة في طريق التصبيغ هو تحضير المسحة Smear تحضير المسحة وفائدة كل خطوة: وفيما يلي خطوات تنظيف الشريحة بالماء والصابون ال ازلة االوساخ والدهون العالقة وتجفف بواسطة قلم التاشير ترسم دائرة صغيرة أو مربع على احد جهات الشريحة وذلك لتحديد مكان عينة البكتريا على الشريحة. في حالة اخذ عينة بكتريا من وسط سائل يعقم ال loop ثم تنقل قطرة من الوسط السائل -3 )بعد رجه( وتوضع ضمن الدائرة المرسومة تفرش على شكل طبقة رقيقة وتترك لتجف في الهواء. 17

18 loop اما في حالة اخذ عينة من وسط صلب الى المرسومة و يعقم ال قطرة من ماء الحنفية loop -4 فينقل جزء من المستعمرة بواسطة ال وتخلط جيدا وتفرش بشكل طبقة رقيقة ضمن الدائرة ثم تبرد على حافة الوسط الصلب. تترك لتجف بالهواء لمدة) 11-5 دقائق( مع م ارعاة ان تكون المسحة رقيقة لكي تصبغ الخاليا بشكل متساو. تثبت المسحة بتمرير 3 الشريحة م ارت فوق لهب بنزين بحيث الترتفع ح اررة الشريحة عند لمسها باليد بعد كل مرة تمرر على اللهب وهي اهم خطوة في تحضير المسحة إذ تعمل على: تثبيت أو التصاق العالق بالبكتريا لكي ال نفقدها خالل الغسل عند التصبيغ. إذا كانت البكتريا مرضية تفقد ام ارضيتها أي تفقد خطورتها وتصبح غير قادرة على االصابة. تبقى البكتريا محافظة على شكلها وحجمها عند اج ارء التثبيت بالصورة الصحيحة. :SMEAR هو تحضير مجفف لخاليا البكتريا على الشريحة الزجاجية في نهاية عملية التثبيت تصبح الشريحة جاهزة للتصبيغ. 11( )شكل ب- الصبغة البسيطة (Positive and negative stains) Simple Stain تعد طريقة التصبيغ البسيط من اسرع واسهل طرق تصبيغ البكتريا. سميت بهذا االسم الننا نستخدم نوع واحد من االصباغ في خطوة واحدة فقط. ان معظم الصبغات التي تستخدم في االحياء المجهرية تعد امالح من نوعين: 1- امالح حامضية وهي التي يكون فيها االيون الحامل للصبغة أو اللون (chromophore( سالب الشحنة (anion( مثال: - sodium+ eosinate الصبغة في هذ الحالة هي االيوسين. 2- امالح قاعدية يكون فيها الكروموفور موجب الشحنة )cation( مثال: methylene blue+ chloride- قاعدة مثل ال الصبغة في هذ الحالة هي المثلين االزرق. النوع االول من االصباغ هي الحامضية بمعنى ان الكروموفور الحامضي يتحد مع NaOH لتكوين مركب ملحي هو الصبغة. 18

19 النوع الثاني من االصباغ هي القاعدية إذ تتفاعل مع حامض مثل ال ليعطي HCI المركب الملحي أو الصبغة. إذا االصباغ الحامضية هي التي تحمل شحنة سالبة )على الكروموفور( والقاعدية هي التي تحمل شحنة موجبة )على الكروموفور ايضا(. اما البكتريا فقد تحتوي بداخلها على العديد من المكونات الحامضية )سالبة الشحنة( مثل الحوامض النووية السكريات المتعددة الحامضية بروتينات ال كما تحتوي ايضا على مكونات ذات طبيعة قاعدية )موجبة الشحنة(. ولكن من المعروف ان الحصيلة النهائية Net charge للشحنات على جسم البكتريا ككل هي الشحنة السالبة أي تتصرف البكتريا بصورة عامة كجسم سالب تجا الصبغات. لنرى ما يحصل عند تفاعل خلية البكتريا مع االصباغ اعال : 1- Bacterial cell Outer surface of most cells is negatively charged االشكال البيضوية هي خاليا بكتريا 2- + خلية بكتريا كروموفور موجب خلية مصبوغة (Cation) )تجاذب( 3- + خلفية مصبوغة خلية بكتريا )تنافر( كروموفور سالب خلية بكتريا (anion) 19

20 إذا االصباغ القاعدية Positive Stains مثل Methylene blue Crystal و violet, basic fuchsin.ال تنجذب إلى الخاليا البكتريا وبالتالي تصطبغ بها. االصباغ الحامضية negative stains الخلية البكتيرية ومن ثم ترفضها البكتريا لتصطبغ الخلفية فقط. المواد المستخدمة: مزرعة لبكتريا 1. Bacillus subtilis اما ذات الشحنة السالبة تتنافر مع الشحنة السالبة على )عصوية الشكل( بعمر 24 مزرعة لبكتريا صبغة قاعدية staphylococcus )كروية عنقودية( بعمر 24 methylene blue, crystal violet ساعة. ساعة. وصبغة حامضية nigrosin.4,ملقط ورق ترشيح قلم تأشير و عروة زرع. طريقة العمل: positive stain تنظيف الشريحة بالماء مالحظة: ولا صابون حتى الش ارئح غير المستعملة يجب تنظيفها النها مطلية بمواد حافظة. بواسطة قلم التأشير ارسم دائرتين في وسط الشريحة. بواسطة ال loop loop يعقم ال 4- انقل قطرة ماء وضعها وسط كل دائرة. ثم يبرد. عصوية وامزجها جيدا مع قطرة الماء. إذا كانت المزرعة صلبة انقل كمية قليلة جدا من مستعمرة المت اربطة مع بعضها للحصول على خاليا مفردة. العملية نفسها لمزرعة بكتريا كروية. لبكتريا هذ العملية تعمل على تفكيك اف ارد المستعمرة يعقم ال loop -5 الماء. بواسطة ال loop -6 لتجف في الهواء لغرض التثبيت. مرة اخرى و كرر اما إذا كانت مزرعة البكتريا سائلة فال داعي لقطرة يتم فرش عالق البكتريا ضمن الدائرة على شكل طبقة رقيقة. ثم تمرر فوق لهب بنزين باالستعانة تغمر الشريحة باحد الصبغات القاعدية مثل )12-7 تترك بملقط كما هو مبين في الشكل المثلين االزرق لمدة دقيقة واحدة.)شكل تغسل الشريحة بماء الحنفية وتجفف بوضع الشريحة بين ورقتي ترشيح والضغط الخفيف عليهما. افحص تحت المجهر وارسم ما تشاهد. ما هي المعلومات التي حصلت عليها من هذ الطريقة 21

21 طريقة العمل: Negative stain -1-2 ضع قطرة ماء القطرة عكرة. اضف حملة على شريحة نظيفة وامزج معها جزء قليل من البكتريا الى ان تصبح loop -3 لكي تكون طبقة رقيقة. جفف في الهواء وافحص تحت المجهر. ما الفرق بين الطريقتين لكل بكتريا. مالحظة: عند فحص الش ارئح ج- العدسة الزيتية. الصبغات التفاضلية )التفريقية( مالحظة: من صبغة حامضية مثل نكروسين وامزجها مع الخليط اعال المصبوغة يفضل البدء بالعدسة الشيئية ثم x11 x41 Differential stains واخي ار عند فحص قطرة عالق بكتريا سواء على شريحة اعتيادية mount( )wet أو بطريقة القطرة المعلقة الحظنا شكل البكتريا و ترتيبها حركتها )ان كانت سبحية ثنائية عنقودية. ال (. حجمها ولكن من مساوئ هذ التحضي ارت الحية هي ان الشريحة سريعة الجفاف تحت تأثير ح اررة المصدر الضوئي الحية. للمجهر اضافة إلى خطورة تلوث اليدين بالبكتريا ممكن تالفي هذ االخطاء باستخدام طرق التصبيغ حيث تقتل البكتريا عند تحضير المسحة خالل عملية التثبيت بالح اررة أو بفعل االصباغ القاتلة من التصبيغ ممكن االكتفاء بغسل الشريحة بالماء والصابون. بالشريحة لفت ارت اطول. 1- صبغة ك ارم Gram Stain للبكتريا. لذلك عند االنتهاء واخي ار ممكن االحتفاظ سميت هذ الصبغة بالصبغة العظيمة النها من اهم واكثر الصبغات استخداما ان التصنيف الحالي للبكتريا يشمل التي تكتشف سنويا جنس مع 5111 يذكر نوع اضافة إلى االعداد الجديدة لذلك اعتمدت هذ الصبغة كخطوة اولى في تشخيص البكتريا ومنذ اكتشافها من قبل العالم Christian Gram البكترية إلى مجموعتين كبيرتين هما: 1883 عام -1 بكتريا موجبة لصبغة ك ارم G+ Staphylococcus aureus )البنفسجية اللون( مثل والعصيات( rods ) مثل تصنف هذ الصبغة االجناس المكو ارت) cocci (. Bacillus subtilis مثل 21

22 2- بكتريا سالبة لصبغة ك ارم G )وردية أو حم ارء( مثل, coli. Escherichia Pseudomonas aeruginosa (rods), (coccobacilli) لهذ الصبغة اهمية في تصنيف وتشخيص البكتريا. خطوات التصبيغ: 1- تحضر المسحة. 2- تغمر الشريحة بصبغة ال crystal violet 3- تغسل بالماء الجاري. البنفسجية لمدة دقيقة واحدة. 4- يضاف المحلول المثبت )mordant) Gram's iodine لمدة دقيقة واحدة. 5- اغسل بالماء الجاري. 6- اضف القاصر decolorizer ملونة. 7- اغسل بالماء الجاري. 8- اضف الصبغة المعاكسة )ايثانول %25( لمدة نصف دقيقة. لحد نزول اخر قطرة counterstain )السف ارنين( لمدة نصف دقيقة..crystal violet 2- اغسل بالماء الجاري جفف بين طبقتين من ورقة الترشيح افحص. لو الحظنا مخطط صبغة ك ارم )شكل 14-13( لتبين لنا: 1- في الخطوة االولى وعند اضافة الصبغة االولية stain( (primary وهي صبغة قاعدية أي ان شحنتها موجبة لذلك ستصبغ جميع انواع البكتريا )الموجبة لصبغة ك ارم والسالبة لها( باللون البنفسجي. 2- عند اضافة المثبت أو اليود سيكون اليود معقد مع بلو ارت الصبغة complexcv-i( )crystal violet-iodine تنحصر جزيئات هذا المعقد بين شبكة الببتيدوكاليكان ضمن مكونات الجدار بحيث يصعب ا ازلتها خاصة في حالة البكتريا الموجبة لصبغة ك ارم )السبب هو سمك جدار هذ الخاليا كما سنبين فيما بعد(. 4- عند اضافة القاصر ( االيثانول ) ي ازل اللون البنفسجي من البكتريا السالبة لصبغة ك ارم الن طبقة الببتيدوكاليكان تكون اقل سمكا من نظيرتها في جدار البكتريا الموجبة اضافة إلى احتواء جدار البكتريا السالبة لصبغة ك ارم نسبة عالية من الدهون كما مبين في الرسم التفاعل الموجب أو السالب لصبغة ك ارم له عالقة بطبيعة الجدار في كال النوعين. )شكل 15 ( يبين اهم الفروقات بين جدار البكتريا الموجبة والسالبة لصبغة ك ارم. 22

23 -2 صبغة السبور )Schaeffer-fulton method( Spore staining بعض انواع البكتريا لها القدرة على التحول إلى اجسام عالية المقاومة للظروف البيئية الصعبة تدعى السبو ارت الداخلية وهي عبارة عن خاليا خاملة تنتج بعملية endospore sporulation )سبو ارت تنتج داخل الخلية البكتيرية(. عند نفاذ بعض المواد الغذائية الرئيسية مثل الكاربون والنايتروجين. حالما تستلم الخاليا الخضرية هذا الحافز تمر بعملية تحول تستغرق حوالي 6-8 ساعات ينتج عنها سبو ارت داخلية. هذ الت اركيب تعتبر اكثر انواع الحياة مقاومة للظروف الصعبة والتي ال تتحملها الخاليا الخضرية مثل الح اررة والجفاف المركبات الكيمائية السامة االشعة فوق البنفسجية وحتى الغليان لعدة ساعات وبسب هذ المقاومة العالية تتواجد هذ الت اركيب في كل مكان في التربة الطعام االجهزة الطبية المستشفيات في الهواء ال.. هناك خمسة اجناس فقط مكونة للسبو ارت وهي Bacillus--- rod-shaped-1 Clostridium rod-shaped - 2 البكتريا العصوية. المطثيات -3 soil Sporosarcina cocci,found in بكتريا الكروية 4- rod-shaped Sporolactobacillus عصيات الحليب المكونة للسبور -5 ananerobic Desulfolomaculum rod-shaped, العصيات الالهوائية بعض هذ االنواع قد تكون ممرضة لالنسان مثال 1- botulinum Clostridium تسبب مرض التسمم البوتيوليني botulism وهو مرض ناتج عن تلوث الخضروات واالطعمة المعلبة بالخاليا الخضرية التي تنتج سموم قاتلة. ففي حالة عدم تعقيم هذ االطعمة بطريقة صحيحة خالل عملية التعليب فان هذ السبو ارت تنمو وتنتعش تحت ظروف الهوائية لتنتج سموم تؤدي إلى الشلل. Gas ganarene التي تسبب موت االنسجة Clostridium perfringens -2 tetanus تسبب مرض الك ازز Clostridium tetani 3- Bacillus anthracis-4 التي تسبب مرض الجمرة الخثبية.anthrax مقاومة هذ الت اركيب للظروف الصعبة تعود إلى. * ان غالف السبور متعدد الطبقات ويحتوي على مادة الى ا ازلة الماء من السبور dipicolinic acid هذ المادة تؤدي ولذلك يصبح خامل ايضيا و ذومقاومة عالية 23 dehydration

24 م م للجفاف والح اررة. اضافة إلى ذلك فان اغلفة الجدار المتعددة تحمي السبور من تأثير االشعاع والمواد الكيميائية. هذ الخواص غير موجودة في الخاليا الخضرية. * قلة الماء الحر في السايتوبالزم. * احتواء بعض السبو ارت على انزيمات مقاومة للح اررة thermostable enzymes مالحظة ال يعد السبور طريقة تكاثرية وانما لحيوية البكتريا والحفاظ على النوع بدليل ان كل خلية خضرية تعطي سبور واحد. عند االنبات يعطي السبور خلية خضرية واحدة ان لشكل السبور وموقعه أهمية في تشخيص البكتريا المكونة له. شكل السبور قد يكون بيضوي أو كروي. اما موقع السبور فقد يكون: 1- شبه نهائي )subterminal( -2 نهائي )terminal( مثال ذلك بكتريا Clostridium tetani المسببة لمرض الك ازز إذ يعتبر شكل البكتريا العصوي وبداخله السبور الكروي والتي تشبه مضرب الطبل )drum-stick( هي صفة تشخصية لمرض الك ازز. كما هو مبين في الصورة الحقا. وسطي.)central( معلومات هامة عن السبور: عملية البسترة )التسخين بدرجة ثانية( غير كافية للقضاء على السبو ارت. لمدة نصف ساعة أو 71.6 لمدة 15 بسبب تعدد اغلفة السبور فانها التصطبغ بالصبغات االعتيادية مثل صبغة ك ارم أو الصبغة البسيطة ولكن تظهر في هذ الصبغات على شكل اجسام شفافة غير مصبغة وعاكسة للضوء )شكل 16(. لهذ الت اركيب القدرة على البقاء حية لمئات السنين بل لالف السنين أو اكثر. اخر ما سجل كان من قبل باحث من كاليفورنيا حيث وجد سبو ارت حية في نحلة متحجرة منذ 25 مليون سنة! القضاء على السبو ارت يعتبر من المهمات الصعبة عند تعقيم مصانع تعليب االغذية والمستشفيات

25 Bacillus subtilis المواد: 1- مزرعة لبكتريا بعمر اسبوع. 2- صبغة الملكايت االخضر ( aqueous5% محلول مائي تركيز %5(. 3- صبغة السفر انين. 4- ش ارئح نظيفة. 5- حمام مائي. طريقة التصبيغ: )شكل 17( 1- تحضر مسحة مثبتة للبكتريا اعال. 2- تغطي بورقة ترشيح مشبعة بصبغة الملكايت االخضر وتوضع فوق حمام مائي لمدة 5 دقائق مع م ارعاة عدم جفاف الصبغة وذلك بتقطير المزيد من الصبغة كلما اقتضت الحاجة. 3- تبرد الشريحة ثم تغسل بالماء. 4- تضاف الصبغة المعاكسة وهي السف ارنين لمدة 2 دق. 5- تغسل بالماء تجفف وتفحص. )شكل 12-18( - 3 الصبغة الصامدة للحمض Acid Fast stain تعد هذ الطريقة من طرق التصبيغ التفريقي المهمة لتفريق جنس ال Mycobacterium عن بقية االجناس اذ ينفرد هذا الجنس باحتواء على كمية من معقد دهني acids( )Mycolic على سطح الخاليا يعطي السطح خاصية شمعية وبالتالي من الصعب تصبيغ هذ الخاليا بالطرق االعتيادية. ممكن تالفي صعوبة التصبيغ في هذ الخاليا باستخدام الح اررة لتليين المكونات الدهنية والشمعية على الجدار ثم تسهيل دخول الصبغة الى الخاليا. هذا النوع من الخاليا حالما تصطبغ يصعب ا ازلة الصبغة منها بالمواد القاصرة مثل الكحول المحمض ولذلك تدعى الصامدة للحمض. هذ الصبغة تستخدم في تشخيص عصيات السل التي تعود لهذا الجنس اذ ان هناك نوعان ممرضان لالنسان وهما: السل Tuberculosis Mycobacterium tuberculosis Mycobacterium leprae الجذام leprosy 25

26 كغيرها من الصبغات التفريقية يستخدم فيها نوعين من االصباغ: االولية )carbolfuchsin( الحم ارء. والصبغة المعاكسة blue( )methylene الزرقاء. اما القاصر في هذ الطريقة فهو )%3-1 حامض الهيدروكلوريك في %25 كحول ) و الكحول المحمض هو قاصر قوي جدا. في هذ الطريقة الصبغة الحم ارء تدخل الى الخلية باستخدام الح اررة. اضافة الى ان الفينول )وهو جزء من محلول الصبغة ) يسرع في اخت ارق الصبغة. المواد: مسحة من عينة قشع لمريض مصاب بالسل. صبغة الكاربول فوكسين الحم ارء صبغة المثلين االزرق. كحول محمض. حمام مائي ورق ترشيح ش ارئح زجاجية. طريقة العمل: )شكل 21 ( توضع ورقة ترشيح مشبعة بصبغة الكاربول فوكسين على المسحة ثم توضع الشريحة فوق حمام مائي لمدة 5 دقائق مع م ارعاة عدم جفاف الصبغة. تبرد الشريحة وترفع ورقة الترشيح ثم تغسل بماء الحنفية. يضاف الكحول المحمض لقصر الصبغة لمدة ثانية. تغسل الشريحة ثم تضاف الصبغة المعاكسة وهي المثلين االزرق لمدة دقيقة ثم تغسل وتجفف و تفحص. مالحظة: تستخدم هذ الصبغة لتشخيص عصيات السل)شكل 21( جنس ال و leprosy Nocardia التي تسبب اصابات في الجلد و الرئة. الجذام و.Glycocalyx والتي تتخذ شكل شبكي خارج جدار الخلية صبغة الكبسول )الصبغة السالبة( (Negative stain) Capsule stain العديد من البكتريا تغلف نفسها بمادة تشبه الجيالتين تدعى هذ الطبقة جالتينية وذات معالم واضحة يطلق عليها مصطلح capsule إذا كانت والتي يمكن تمييزها مجهريا باستخدام الصبغة السالبة اما إذا كانت هذ الطبقة غير منتظمة قابلة للذوبان رخوة يطلق عليها اسم تكون سكريات متعددة مثل Slime layer dextran, glucan يمكن تخليص وظيفة هذ الطبقات بما يلي: البكتريا التي تنتج أي من هاتين الطبقتين

27 تساعد البكتريا على تثبيت نفسها على السطوح المختلفة مثل االسنان جذور النباتات االمعاء الدقيقة الصخور وحتى على خاليا بكترية اخرى. مثال بكتريا Streptococcus mutans والتي تثبت نفسها بقوة من خالل الكبسول ثم تنمو على شكل طبقة )Biofilm( أي تجمعات من الخاليا تحيط نفسها بالسكريات المتعددة إذ تقوم هذ البكتريا باستخدام السكروز في الغذاء لبناء مادة الكبسول هذا يسهل التصاق انواع اخرى من البكتريا لتنتج جميع االنواع حوامض تؤدي إلى تسوس االسنان هذا يفسر عالقة تناول االغذية السكرية بالتسوس. لحماية البكتريا من عملية االلتهام )phagocytosis( التي تقوم بها بعض كريات الدم البيضاء كوسيلة دفاعية للجسم. ويذكر ان انتاج الكبسول هي صفة و ارثية وكغيرها من الصفات قد تتعرض إلى طف ارت و ارثية ينتج عنها اف ارد غير مكونة للكبسولة. الخاليا المنتجة للكبسولة تكون ممرضة اكثر من غير المنتجة لها مثل Streptococcus pneumoniae microcapsule 81 نوع من التي لوال انتاجها للكبسول لما تمكنت من ان تسبب ذات الرئة. طبقة رقيقة تحمل البصمة الخاصة أو الهوية لنوع البكتريا مثال هناك Streptococcus pneumoniae على هذ الطبقة. )شكل 23-22( حسب الطبيعة المستضدية المحمولة الطريقة االولى Capsule stain )الطريقة الرطبة( : 1- ضع قطرة من مزرعة بكتريا سائلة او حملة من مزرعة صلبة مع قطرة ماء وامزج جيدا. 2- نضع قطرة من صبغة النيكروسين او الحبر الهندي في وسط شريحة نظيفة وتخلط مع البكتريا ثم تغطى بغطاء الشريحة. 3- افحص. الطريقة الثانية Capsule stain )الطريقة الجافة( 1- ضع قطرة من محلول % 6 كلوكوز على احدى نهايتي شريحة زجاجية نظيفة. 2- انقل قطرة من مزرعة البكتريا السائلة وامزجها مع قطرة الكلوكوز جيدا للحصول على معلق متجانس. 3- اضف قطرة من صبغة النيكروسين وامزجها جيدا "ايضا" على غشاء رقيق باستعمال نهاية شريحة انشر المزيج على الشريحة للحصول اخرى

28 الطريقة الثالثة جفف بالهواء. ثبت المسحة باضافة الكحول المثيلي. جفف في الهواء الساخن. اصبغ بصبغة الكريستال البنفسجية لمدة دقيقة واحدة. اغسل بالماء وافحص وسجل النتيجة. Capsule stain )شكل )الصبغ بطريقة ه Hiss method ).) معلومات هامة: من عالق امزج قطرة البكتريا في محلول الملح الفسيولوجي مع قطرة من المصل الطبيعي على سطح شريحة زجاجية نظيفة. اترك المسحة تجف بالهواء. ثبت بالتسخين. اغمر الشريحة بمحلول صبغة الكريستال البنفسجية لمدة دقيقة واحدة ثم اغسل بمحلول كبريتات النحاس % 20 افحص وسجل النتائج. * الكبسولة غير ضرورية لحيوية الخلية * للحصول على كبسولة واضح يفضل عينات دم قيح او اد ارر و )شكل 25(. جفف. ممكن از التها دون ان يؤثر ذلك على حياة الخلية. عزل البكتريا من الجسم أو من حاالت مرضية مثل 28

29 االسواط والحركة Flagella and motility تمتلك االنواع المتحركة من البكتريا زوائد خيطية طويلة تتكون من بروتين Flagellin القاعدي تدعى االسواط أو.Flagella basal body ترتبط هذ الزوائد بجسم البكتريا عند الجسم هذ الت اركيب رقيقة و رفيعة جدا بحيث يصعب رؤية سوط مفرد واحد مباشر تحت المجهر اال بعد معاملته بمواد كيمياوية. هذ العملية وخبرة عالية قد يحتاج نجاحها تك ارر خطوات التصبيغ ال كثر من مرة. البكتريا كما يلي: 26(. )شكل القطبية 1- polar أي تترتب االسواط في احد اقطاب البكتريا أو كالهما. ا تترتب تحتاج إلى مهارة السواط على lophotrichous أي تتمركز مجموعة من االسواط في احدى نهايات الخلية. -2 peritrichous أي االسواط تحيط بالخلية البكتيرية. -3 اما اهمية هذ االسواط اضافة إلى الحركة يمكن ان تستخدم في تصنيف البكتريا و في بعض الحاالت مثل Helicobacter Pylori المسببة لقرحة المعدة تمتلك اسواط متعددة وقوية في احدى نهايات الخلية الحلزونية للبكتريا. تلعب االسواط في هذ البكتريا دو ار في اخت ارق الطبقة المخاطية اللزجة المبطنة للمعدة. 29

30 معلومات هامة عن االسواط: * البكتريا التي تمتلك اسواط هي: All spirilli Half the bacilli Few of the cocci * حركة البكتريا تتم بدو ارن السوط باتجا عقارب الساعة و دو ارن الجسم عكس عقارب الساعة. خلية/ثا مثل ان دو ارن االسواط يحرك البكتريا خالل الوسط السائل بسرعة تقارب ال 61 مرة طول 4.4mm/minوهذا Pseudomonas وaeruginosa Thiospirillum 5.2mm/Min يعادل ضعف سرعة اسرع حيوان وهو Cheetah سرعة له 111 كم/ساعة أي ما يعادل 25 مرة طول طول جسمه.ثا. الذي تبلغ اقصى طرق د ارسة الحركة: أ- فحص الحركة باستخدام القطرة المعلقة Hanging Drop Method )كما مر سابقا(. ب- فحص الحركة عن طريق إستخدام األنبوب الزجاجي على شكل حرف U U -:U-shaped tube وفي هذ الطريقة يستخدم انبوب زجاجي على شكل حرف يحتوي يحتوي على وسط نصف صلب )نسبة االكار فيه ربع النسبة االعتيادية علما ان النسبة االعتيادية هي %1.5(. يمكن معرفة ان كانت البكتريا متحركة وذلك بتلقيح احد الطرفين بالبكتريا المعينة بطريقة الطعن من ال Stabbing باستخدام Needle loop شكل 27(. ج- ظاهرة العج ابرة التلقيح بدال و يحضن بدرجة ح اررة 37 م لمدة 24 ساعة وتسجل النتيجة) كما في :- وهي احد اشكال حركة البكتريا والتي ينفرد بها جنس Swarming Proteus على االوساط الصلبة حيث تكون الخاليا على حافة المستعمرة نشيطة الحركة ثم تتوقف وتنمو و تتكاثر لتعطي جيل اسرع وانشط ليتحرك بعيدا مرة اخرى وهكذا ( الشكل 22-28(. 31

31 السيييييطرة علييييح نمييييو االحييييياء المجهرييييية Disinfection & Sterilization السيطرة على نمو االحياء المجهرية هو بقتل الخاليا أو خلق ظروف بيئية تمنعها من التكاثر. صحي وخالي من الميكروبات هذا المجال * التعقيم والسبو ارت منعها من التكاثر. كما انها مفتاح للتطبب االصح.. يجب التذكير ببعض المصطلحات المهمة مثل: :sterilization الفيروسات هو التطهييييير والتعقيييييم وممكن تحقيق ذلك اما كال الحالتين ضرورية من اجل غذاء ال قبل الدخول في ا ازلة أو تحطيم كل انواع الحياة مثل البكتريا )الخاليا الخضرية الفطريات معقمة فذلك يعني انها خالية من أي كائن حي. * التطهير عكس التعقيم :disinfection هو بطرق فيزيائية وكيماوية. عندما يقال ان مادة ما ا ازلة جميع أو معظم االحياء المجهرية الممرضة. أي على فان التطهير قد يبقى بعض الميكروبات غير الممرضة أو اعداد قليلة من االحياء الممرضة غير كافية الحداث المرض أو )disinfectants( عادة تكون أي biocides الحداث تقتل االحياء اينما تكون سواء على المناضد أو االرضيات الحية عند ذلك تدعى تدعى الجلد المطه ارت.germicides.antiseptic :Decontamination * هو التغسيل أو استخدام الح اررة أو المطه ارت. والمنظفات االصابة المواد المطهرة قاثتلة للحياة ولكن تستخدم بت اركيز كافية وغيرها من االسطح غير اما إذا استخدمت على خاليا حية مثل تقليل أو تقليص اعداد الميكروبات الممرضة وذلك باستخدام ان عمليات الغسل والجلي باستخدام الصابون تحقق لنا السيطرة على الميكروبات غير المرغوبة والفيروسات العمليات اليومية لمنع انتشار االم ارض. تقسم طرق التعقيم إلى: أوالا- أ- الطرق الفيزيائية الح اررة physical methods :Heat -1 الح اررة الجافة: وتقسم الى: والتي تشمل: وهي من اهم التلهيب المباشر الحرق Incineration Direct flaming الح اررة 2- الرطبة وتشمل: 31

32 م م م أ( البسترة ب( التندلة الغليان ج( د( الموصدة ب- االشعاع ثانيا- الطرق الكيمياوية pasteurization Tyndalization boiling autoclave :radiation ثالثا- الطرق الميكانيكية Ionizing Radiation UV radiation Microwave chemical methods mechanical methods أوال : الطرق الفيزياوية أ- الح اررة :Dry Heat :Heat 1- الح اررة الجافة وهي الطرق التي تستخدم الح اررة الجافة بدرجات تت اروح بين م. يستخدم اللهب المباشر أو هيت ارت كهربائية. هذ الطريقة تؤدي إلى Denaturation 1- سحب من الخاليا Dehydration 2- اكسدة الخاليا إلى رماد 3- تغير معالم جزيئات البروتين تغير غير رجعي من م ازيا هذ الطريقة هي امكانية استخدامها لتعقيم المواد الجافة )Powders( والزيوت باالضافة إلى الزجاجيات. اما مساوئها فان الح اررة الجافة تحتاج وقت اطول لقتل االحياء المجهرية فمثال التعقيم خالل ساعة ونصف بدرجة ح اررة 211 م يعادل 15 دقيقة ح اررة رطبة بدرجة 121 اهم الطرق التي تستخدم الح اررة الجافة: 1- التلهيب المباشرة لتعقيم ال وذلك الن تغلغل الح اررة الرطبة اسرع من الح اررة الجافة. من loop علما ان لهب بنزين Bunsen burner الحرق في بعض المناطق. Incineration قد يصل إلى لحرق الجثث السرنجات اللفافات المالبس الملوثة وتستخدم لهذا الغرض اف ارن غازية أو كهربائية بدرجة

33 م 3- االف ارن: بدرجة لمدة 4-2 ساعة لضمان قتل السبو ارت تستخدم االف ارن في المختب ارت لتعقيم االدوات المقاومة للح اررة والمواد التي ال يجوز تعقيمها بالح اررة الرطبة مثل االدوات المعدنية التي تصدأ بالبخار الزيوت )التي يصعب تغلغل البخار إلى داخلها المساحيق )التي ال يجوز ان تترطب(. كما يمكن استخدامه لتعقيم الزجاجيات. ال يجوز تعقيم مواد بالستيكية قطن خشب ورق أو سوائل تتبخر في الدرجات العالية. 2- الح اررة الرطبة :Moist heat ان وجود الرطوبة يزيد من التاثير القاتل للح اررة على الخاليا الحية. فالح اررة الرطبة لها قدرة اخت ارق عالية وبالتالي تتخثر البروتينات بدرجات ح اررة اقل من الح اررة الجافة. وكما ذكر سابقا فان الح اررة الجافة تؤدي إلى سحب الماء من الخاليا مما يتطلب درجات ح اررة اعلى لتخثير الربوتينات. من اهم طرق التعقيم بالح اررة الرطبة هي: أ- البسترة :pasterurization وهي عملية تعريض المشروبات مثل الخل والحليب والعصائر إلى درجة ح اررة 62 م لمدة نصف ساعة للقضاء على االحياء المجهرية الممرضة والفعالة في فساد هذ االغذية وبنفس الوقت الحفاظ على الطعم والقيمة الغذائية له. عملية البسترة تزيد من عمر الخزن للمادة الغذائية وتحمي المستهلك من االم ارض مثل السل الذي تسببه البكتريا Mycobacterium tuberculos التيفويد Salmonella typhi. اما الطرق الحديثة للبسترة تستخدم abortus وحمى مالطا Brucella High flash pasteurization )Temperature Short Time (HTST حيث تعرض المادة الغذائية لدرجة ح اررة 27 درجة لمدة 15 ثانية. هذ الطريقة تثبط فعالية % من الخاليا الخضرية. السبو ارت تقاوم هذ العملية أي ان الحليب المبستر هو غير المعقم بل قد يحتوي بحدود خلية / مل ولهذا يتلف الحليب المبستر عند الخزن لفترة طويلة. ظهر حديثا في االسواق حليب مبستر ومعقم ممكن خزنه لمدة 3 اشهر وذلك بتعريضه إلى درجة Ultra High Temperature أي بدرجة درجة لعدة ثواني ثم تبريد بسرعة واخي ار من السهل ايضا بسترة االقمشة والمواد المطاطة مثل اقنعة التخدير وذلك بتنظيم درجة ح اررة ماء الغسيل إلى 81 م لمدة ربع ساعة. 33

34 م * مالحظة ان عملية البسترة وكما ذكرنا سابقا تقتل كافة الخاليا الخضرية ومعظم البكتريا الرمية saprophytes تقاوم البسترة والتي تدعى العالية. البعض منها وال تقتل السبو ارت. بعض البكتريا الرمية قد thermoduric thermophilic أي المحتملة لدرجات الح اررة أي محبة للح اررة. ب- التندلة :Tyndalization هي احدى طرق التعقيم وهي تستغرق ثالثة ايام تستخدم لتعقيم االوساط التي تتلف بالح اررة العالية. يتم تعريض الوسط في اليوم االول إلى بخار متدفق بدرجة ح اررة 111 م لمدة دقيقة وذلك لقتل الخاليا الخضرية اما السبو ارت فهي تقاوم هذ الدرجة لذلك يوضع الوسط في الحاضنة إلى اليوم التالي للسماح لعملية انبات السبو ارت إلى خاليا خضرية. تعاد العملية في اليوم الثاني )التعريض لبخار الماء ثم التحضين( وذلك لقتلب ما تبقى من الخاليا الخضرية والسبو ارت. مرة اخرى تكرر العملية في اليوم الثالث لضمان قتل جميع االحياء المجهرية. ج- الغليان :Boiling طريقة تقليدية تستخدم بشكل واسع في المستشفيات والبيوت. وهي من طرق التطهير اكثر من التعقيم حيث يتم الغليان لمدة نصف ساعة تقتل فيها البكتريا الخضرية غير المكونة للسبو ارت مثل بكتريا السل والعنقوديات تستخدم لتعقيم بعض االغذية والمفروشات وااللبسة الخاصة بالمرض. من مساوئها هو اعادة تلوث المادة بعد ا ازلتها من الغليان. د- الموصدة :Autoclave )شكل ) 31 وهو جهاز يشبه وعاء الضغط الذي يستخدم للطب في اساس عمله في هذا الجهاز يتم تسخين الماء في وعاء محكم السد للحصول على درجة ح اررة اعلى من 111 عند تسخين الماء يتكون ينحصر البخار داخل الوعاء ليرتفع الضغط ويصبح اعلى من الضغط الجوي. ومن المعلوم ان بخار الماء تحت الضغط الجوي االعتيادي ال تتعدى درجة ح اررته ال 111 م وكلما استطعنا رفع الضغط إلى اعلى من الضغط الجوي في وعاء الموصد المحكم السد سنحصل على درجات ح اررة اعلى كما يلي: 34

35 POUND PER SQUARE INCH صفر Temperature (degrees centigrade steam pressure) ب عند تشغيل الجهاز يجب فتح صمام خاص يتواجد على الجهاز لطرد الهواء الموجود داخل الجهاز ليحل محله بخار نقي وذلك الن درجة ح اررة البخار النقي اعلى من درجة ح اررة البخار المخلوط مع الهواء. ثم يغلق الصمام ليرتفع الضغط داخل الوعاء وترتفع درجة الح اررة إلى الدرجة المطلوبة )121 درجة( وبضغط.PSI 15 - دور الضغط في هذا الجهاز هو لرفع درجة الح اررة فقط. التعقيم بالموصدة هو من اهم الطرق للقضاء على السبو ارت بسبب القدرة العالية لهذ الدرجة الح اررية ال خت ارق الخاليا. تستخدم هذ الطريقة في التعقيم لالوساط الزرعية )ما عدا االوساط التي تتاثر بالدرجات الح اررية العالية( الزجاجيات اتالف االوساط المزروعة بالبكتريا.. ال. االشعاع :Radiation يعرف االشعاع بانه الطاقة المتحررة من فعالية ذرية يمر من خالل المادة بسرعة فائقة. ومنت المعروف ان االشعاع يؤثر على جميع الخاليا الحية. سنذكر نوعين من هذ االشعاعات: 1- اشعاعات التاين: من امثلتها اشعة الفا كاما صفاتها: أ- طول موجي قصير جدا ) ( نانومتر. X-rays ب- قدرة اخت ارق عالية جدا لالجسام الصلبة. ج- مكلفة وتحتاج إلى اجهزة خاصة. عند مرور هذ االشعاعات خالل الخاليا بعض الذ ارت تمتص الطاقة لتفقد الذرة الكتروناتها وتتحول إلى ايون موجب. االلكترون المتحرر يتحد مع ذرة متعادلة ويعطي االيون السالب. )أي ينتج زوج من االيونات موجب وسالب(. 35

36 هذا التغير في التركيب يؤدي إلى تغي ارت في االواصر الكيمياوية وبالتالي يتغير التركيب الجزيئي للخاليا. واذا كانت جرعة التشعيع كافية قد تؤدي إلى قتل الخاليا.مثال عن هذا النوع من االشعاعات هو اشعاع كاما الذي يؤدي الى اض ارر بايولوجية بانتاج جزيئات نشطة مثل -O أو -OH superoxide الحر عندما تنتقل الطاقة إلى االحياء المجهرية. تستخدم لتعقيم المواد الحساسة للح اررة مثل االجهزة الطبية واالدوية كالبنسلين وتعتبر بديل للتعقيم ب.ethylene oxide ممكن استخدامها لتعقيم االجهزة بعد التغليف. ممكن استخدام اشعاع كاما للتعقيم أو للبسترة اعتمادا على الجرعة المستخدمة. التعقيم قد يؤثر على طعم المنتوج لذلك للبسترة حيث يقتل االحياء الممرضة مثل السالمونيال في اللحوم دون تغير واضح في الطعم كذلك يستخدم االشعاع في تعقيم التوابل وحتى الحبوب والخض اروات والفواكه للقضاء على الحش ارت واالحياء الممرضة. ومن المفاهيم الخاطئة لدى الكثير ان االطعمة المشععة قد تحتوي على االشعاعات أو مواد مسرطنة بينما تشير الدالئل العلمية على انها غير مضرة وصالحة لالستهالك. carcinogen 2 -االشعة فوق البنفسجية ال :U-V radiation الطول الموجي لالشعة فوق البنفسجية نانوميتر يؤثر على البيورينات والبيرميدينات )كالهما موجود في الحوامض النوووية ) حيث تمتص اشعاع DNA RNA U-V عند الطول الموجي 261 نانوميتر. ونشير هنا إلى انه اطوال موجية قصيرة شديدة التاثير من هذا االشعاع تصدر من الشمس ولكنها تمتص من قبل طبقة االوزون في الغالف الجوي قبل وصولها إلى االرض. االطوال الموجية القصيرة هذ تعتبر قاتلة لالحياء المجهرية ومضرة للكائنات الحية االخرى ولذلك كان هناك قلق بسبب تلف طبقة االوزون. مثال على هذا النوع من االشعاع الضوءالقاتل للج ارثيمlamp Germicidal والذي يصدر اطوال موجية قصيرة واشد ضر ار. توضع في غرف مغلقة لتعقيم الهواء عند خلو الغرفة من االشخاص. هذ االطوال الموجية تحرق الجلد وتحدث اض ارر في العيون. يخترق الزجاج الماء أو أي مادة غير الهواء. لهذا السبب يستخدم ال االسطح والهواء. كما توجد وحدات U.V U.V u.v خاصة لمعالجة الميا ايضا. ال فقط لتعقيم 36

37 :Microwave -3 هذا النوع من االشعاع ال يقتل الميكروبات بصورة مباشرة وانما من خالل الح اررة التي تصدر عنه. بعض االحياء المجهرية تقاوم هذا االشعاع عند تسخين الغذاء بصورة غير متجانسة. ثانيا -الطرق الكيماوية :Chemical methods 1- الكحول )االيثانول وااليزوبروبانول(: ان المحاليل المائية )المخففة( لهذ الكحوالت وبت اركيز %81-61 تقتل الخاليا الخضرية للبكتريا والفطريات بينما ليس لها تاثير على السبو ارت وبعض الفيروسات. يعزى تأثيرها القاتل إلى تجلط االنزيمات وبعض البروتينات الضرورية وذلك بسبب قابلية البروتينات على الذوبان والتلف في المحاليل المائية للكحوالت )أي المخففة( اكثر من تلفها في الكحوالت النقية. لذلك يكون تاثير الكحول قاتل في الت اركيز %81-61 اما الت اركيز العالية فتعمل على سحب الماء من الخاليا )أي يكون مثبط لنمو الخاليا( يسبب الكحول و ايضا تلف لالغشية الخلوية. : 2 -الفينول acid( )phenol carbolic وهو من اول المطه ارت التي استخدمت بت اركيز لتعقيم االرضيات في المستشفيات والمختب ارت اما االن فاستخداماته اصبحت %5-2 محدودة بسبب ارئحته القوية وتاثير قاتل على االحياء المجهرية. Lysol فالمطهر مثال %12-5 يحتوي على مركبات فينولية فعالة. تستخدم االخيرة بت اركيز حيث تقتل البكتريا الخضرية وحتى بكتريا السل بينما تقاومه بعض انواع الفيروسات. الكلور قاتل لكل انواع االحياء المجهرية والفيروسات. مهيج للجلد :Chlorine -3 Na-hypochlorite واالغشية المخاطية. تستخدم المركبات التي تحرر الكلور مثل لتطهير ميا المسابح وبت اركيز اقل لميا الشرب. هذ المحاليل متوفرة وقليلة الكلفة. المحلول المطهر يحضر بتخفيف القاصر االعتيادي )Na-hypochlorite%5.25( بنسبة 1:111 بالماء وهذا يساوي )PPM511( كلور. اليحطم السبو ارت اما االحياء المجهرية تقتل خالل ½ او اقل. ساعة * مالحظة: ان هذا التركيز يعادل مئات االضعاف التركيز الالزم لقتل االحياء المجهرية ولكنه ضروري لضمان تعقيم سريع وفعال. اضافة إلى ذلك فان وجود مواد 1:111 عضوية )ملوثة( يتطلب استخدام نركيز 1:11 بدال من وذلك الن 37

38 ل) االوزون قوي وفعال الكلور. االلديهايدات: المواد العضوية والشوائب تتفاعل الكلور الحر وبالتالي تقلل من التاثير القاتل له يستخدم اما كغاز الكلور ين اكسدة مكونات الخلية وتحطم الخاليا الخضرية. أو hypochlorite( )Na or Ca - :Ozone وهو سبب هو احد اشكال االوكسجين )O3( غير المستقر وهو عامل مؤكسد يتحلل بسرعة الكثير من البلدان تستخدمه في تطهير ميا الشرب بدال من :)OPA) Orthophaladehyde و formaldehyde glutaradehyde يحطم االحياء المجهرية والفيروسات وذلك نتيجة اليقاف نشاط الربوتينات والحوامض النووية اكثر المحاليل استخداما هو %2 محلول قاعدي من مادة glutaraldehyde تغمر لمدة والفايروسات. مركب الذي يستخدم في تعقيم بعض المواد الطبية الحساسة للح اررة حيث ساعة للقضاء على كل اشكال الحياة بضمنها السبو ارت OPA هذ المادة سامة لذلك يتطلب غسل المواد المعقمة قبل االستعمال اما فهو من المطه ارت الجيدة. وهو قيد الد ارسة كبديل ل.glutaraldehyde :formaldehyde يتوفر بشكل غاز أو محلول مائي %37 يدعى فورمالين. قاتل فعال لكل اشكال الحياة وخالل دقائق يستخدم لقتل البكتريا واضعاف الفيروسات في تحضير اللقاحات. مسرطنة :(Eto) Ethyleneoxide استخداماته محدودة بسبب ابخرته المخرشة واحتمالية كونه مادة مادة معقمة فعالة يحطم كل انواع االحياء المجهرية. بضمنها السبو ارت والفايروسات بتفاعله مع البروتين وهو غاز قابل الخت ارق االقمشة االجهزة الطبية بشكل جيد يستخدم لتعقيم االطباق البالستيكية الماصات والسرنجات يستخدم جهاز مغلق يشابه الموصدة للتعقيم ب Eto اذ يخلط الغاز مع كونه قابل لالنفجار( يستغرق 12-3 ساعة وهو مادة مطفرة )مسرطنة(. CO

39 مالحظات عن التعقيم والتطهير: -1 تعبر محاليل الكلورين من المطه ارت الفعالة للمنازل والمختب ارت. خلط 3 11 سم من القاصر مع محلول مزيل للبكتريا واالوساخ سم. -2 الح اررة الرطبة من المنظفات في لتر من الماء ممكن تحضير من للحصول على تقتل االحياء المجهرية من خالل تكسير الحوامض النووية وتغيير معالم البروتينات )denaturation( وتكسير االغشية الخلوية.cell membranes -3-4 تعتبر المواد الكيمياوية فيي معظم االحيان مطهرة النها ال تقتل السبو ارت. المطهر معتمد على التركيز الزمن االلديهايدات مثل الفورمالديهايد للسبو ارت. الح اررة و ووجود مواد عضوية. glutaraldehyde يخترق غاز 5- البروتينات. Eto وان تاثيرها تعقم وتطهر النها قاتلة المواد البالستيكية المغلفة وهو يحطم كل انواع الحياة بتفاعله مع المعقمات والمطه ارت معقمات او مطه ارت للخاليا الحية 1- كحول االيثانول او البروبانول %85-61 بالماء 2- مركبات تحتوي phenol )هكساكلوروفين ت اريكلوسان كلورو ازيلينول كلورهكسادين( 3- المنظفات )خاصة مركبات االمونيوم الرباعية (. 4- بيروكسيد الهيدروجين )%3( 5- مركبات اليود )مثل البنتاين( 6- نت ارت الفضة الجلد المستخدمة وتأثيرها على الميكروب استخداماتها لصناعة الصابون ومواد التجميل ولا معط ارت. لصناعة الصابون الجلد الجلد تستخدم على العين لالطفال الرضع لمنع االصابة بالعمى التي تسببها Neisseriae gonorrhoeae تأثيرها على الميكروب يذيب الدهون ويتلف البروتيناتdenaturation يحطم الغشاء الخلوي تتفاعل مع الدهون المفسفرة phospholipids للغشاء الخلوي مادة مؤكسدة مادة مؤكسدة ترسب البروتين 39

40 استخداماتها مطهر ومعقم لالجهزة الطبية ومعدات معامل االلبان واالغذية تأثيرها على الميكروب يذيب الدهون ويتلف البروتينات.denaturation لتطهير االجهزة الطبية ومعدات معامل االغذية وااللبان. لتطهير معدات تنقية الميا لتطهير ادوات معامل االلبان واالغذية ومعدات الميا مادة قاتلة للطحالب. لتعقيم احواض المسابح ولتطهير معدات الميا. معقم للمواد الحساسة للح اررة ( البالستك( )محاليل %8-3 لتطهي ارالسطح(وغاز الفورمالين كمعقم معقمات ومطه ارت عالية الكفاءة. البخار مادة معقمة تطهير االجهزة واسطح المختب ارت تطهير اسطح المختب ارت تطهير ميا الشرب لتطهير اسطح المختب ارت تتفاعل مع الدهون المفسفرة )phospholipids) للغشاء الخلوي مادة مؤكسدة مادة مؤكسدة ترسيب بروتين الخاليا مادة مؤكسدة يتحد مع مخلفات الحامض االميني التايروسين يتحد مع مجموعة السلفهيدريك عامل مؤكسد فعال تلف البروتينات denaturation معقمات او مطه ارت لالسطح غير الحية -1 محاليل %)بالماء ) لكحول االيثانول او االيزوبروبانول 2- منظفات االمونيوم الرباعية 3- غاز الكلورين 4- مركبات الكلور هيبوكلو ارت الصوديوم )القاصر( وثاني اوكسيد الكلورين وكلو ارمين. 5- كبريتات النحاس 6- غاز اوكسيد االثيلين 7- الفورمالديهايد 8- كلوتا ارلديهايد)محلول %2( 2- بيروكسيد الهيدروجين 11- مركبات اليود 11- ثاني كلوريد الزئبقيك 12- االوزون 13- مركبات الفينول الكحوالت بيروكسيد الهيدروجين مركبات اليود تعمل كمطه ارت او حتى كمعقمات حسب التركيز و الفترة الزمنية وطريقة االستخدام. 41

41 ثالثا-الطرق الميكانيكية وهي طرق تعتمد ميكانيكية الترشيح للتعقيم :Mechanical methods حيث تستخدم مرشحات غشائية تتكون cellulose من مركبات مثل خالت السليلوز acetate نت ارت السليوز الخزف الصيني.. وغيرها. المرشحات غالبا ما تكون مواد خاملة cellulose nitrate وحجم ثقوبها اقل من اصغر فيروس معروف. مثال مرشحات البكتريا chemically inert.micrometer تكون بحجم تستخدم هذ الطريقة لتعقيم المحاليل الحساسة.)31 للح اررة مثل المحاليل البروتينية والسكرية. )شكل ال هنالك ايضا مرشحات للهواء HEPA( )High Efficiency Particulate Air التي 1.3 تزيل %22-27 من تقريبا االحياء المجهرية من الهواء اكثر من قطرها.Micrometer تستخدم هذ المرشحات الهوائية في غرف المستشفيات خاصة في غرف ومختب ارت مرضى السل. تستخدم هذ الطريقة لتعقيم المحاليل الحساسة للح اررة مثل المحاليل البروتينية والسكرية. ال 41

42 االوساط الزرعية تدعى Culture Media المادة أو المواد الغذائية المستخدمة لنمو وتكاثر االحياء المجهرية مختبريا باالوساط الزرعية Culture media ويجب ان يحتوي الوسط على جميع االحتياجات الغذائية الضرورية للنمو وتوفر الطاقة والوحدات االساسية لبناء اج ازء الخيلة وت اركيبها. واهم N هذ الوحداتهي الكاربون C )الطاقة( النيتروجين ماء) %21-71 ( الغني بالعناصر المعدنية مثل النحاس والخارصين والكوبلت كما يحتوي الوسط على امالح "Na,K,Ca,Mg" وفيتامينات ومساعدات النمو والدواريء )buffers( التي تمنع أي تغير PH واضح في درجة حموضة الوسط الوسط وذلك عن طريق تفاعلها مع الحوامض أو القواعد ليبقى PH الوسط بحدود التعادل. من امثلة الدواريء بعض االمالح خاصة KH2PO4 + NaOH KNaHPO4 + NaOH K2HPO4 + HCI KNaHPO4 + H2O (مع القاعدة) KNa2PO4 + H2O (مع الحامض) KH2PO4 + KCI الفوسفاتية منها: ويمكن للكاربونات و المواد العضوية كالبروتينات تعمل ان )الببتون( كدواريء. حيث ان الفعاليات الحيوية لبعض االحياء المجهرية قد تؤدي إلى زيادة كمية الحوامض أو القواعد. وظيفة الداريء هي لمنع هذا التغير السريع في الوسط الغذائي. تقسم االوساط حسب حالتها الفيزيائية إلى: البيئات السائلة Liquid Media وتشمل: -1 الوسط المغذي nutrient broth, glucose broth, tryptic soy broth, brain هذا النوع من البيئات يستخدم لالغ ارض التالية: heart infusion 1- لتنمية االحياء بكميات كبيرة. 2- لد ارسة التخمر.Fermentation. 3- للختبا ارت البايوكيميائية Biochemical tests تستخدم بيئة thioglycolate broth لتنمية البكتريا الالهوائية أو قليلة االحتياج -4 للهواء anaerobic and microaerophilic الحتوائه على مادة الصوديوم ثايوكاليكوليت sodium thioglycolate الذي يتفاعل مع جزيئة االوكسجين وا ازلته وبهذا يؤثر على خفض جهد االكسدة واالخت ازل في الوسط. 42

43 م م م م -2 البيئات الصلبة Solid media تحضر هذ البيئات باضافة مواد مصلبة للوسط مثل االكار البيئة الغذائية السائلة. البحرية agar :Agar مادة متعددة السكريات polysaccharide Geledium spp ال يتحلل بيولوجيا من اهم خصائصه: واستهالكه كمادة غذائية. والجيالتين إلى تستخلص من نوع من الطحالب أي ان معظم االحياء المجهرية غير قادرة على تكسير ال يتحطم بالدرجات الح اررية العالية كذلك من الممكن تعقيمه بالح اررة العالية للموصد.( 121( يذوب بدرجة 3-28 ح اررة ويتجمد بدرجة 45 ح اررة -4 الغرفة. يضاف بنسبة )%2-1.5(. اما الجيالتين: بعضها باواصر ببيتدية من خصائصه: هو عبارة عن مادة بروتينية تتكون من 15-1 يتحلل بيولوجيا من قبل بعض البكترية المنتجة ال نزيم وال يتميع بدرجة ح اررة حامض اميني مرتبطة مع.Gelatinase يتميع بدرجة 2-26 ح اررة -3 ويتجمد عند الدرجات الح اررية الواطئة. يضاف إلى الوسط بنسبة )%15-11( وقد تزداد إلى )21- ح اررة الجو. مثال على االوساط الصلبة االكار المغذي Nutrient Agar %25( عند درجة اكار الدم Blood Agar اكار الدم المطبوخ Chocolate Agar اما فوائدها: لد ارسة صفات المستعم ارت للبكتريا واالعفان. لعزل الكائن بصورة نقية من الم ازرع المختلطة. لخزن الم ازرع. د ارسة بعض التفاعالت تصب البيئات الصلبة في اطباق أ- ب- اكار عميق االكار المائل الكيموحيوية. Petri Dish Deep Agar Slant Agar في انابيب اما على هيئة لتنمية االحياء المجهرية الالهوائية. لحفظ الم ازرع ود ارسة بعض الصفات البايوكيميائية 43

44 -3 البيئات شبه الصلبة Semi Solid Media SIM -1 يستخدم هذا النوع من البيئات لد ارسة حركة البكتريا وتنمية البكتريا الالهوائية مثال وتقسم االوساط الز ارعية حسب طبيعة مكوناتها إلى: االوساط الصناعية :Synthetic Media -2 الكمية. االوساط الطبيعية :Non-Synthetic Media وهي االوساط التي فيهال مكونات معلومة والبيض والبطاطا و مصل الدم مثال ذلك وسط Nutrient Broth خالصة الخميرة المتكون من خالصة اللحم وهي اوساط مكوناتها طبيعية مثل الحليب Beet Extract المرق المغذي والببتون Peptone Yeast Extract هي االخرى من اكثر المكونات شيوعا واستخداما. هذا النوع من البيئات يكون معقد التركيب وغني بالفيتامينات والمغذيات. الببتون :Peptone هو عبارة عن بروتين حيواني )لحوم أو كا ازئين( أو نباتي )فول الصويا أو بذور القطن( معامل بانزيمات هاضمة )مثل التربسين(. االنزيمي خليط من البتيدات والعضوية. الحوامض االمينينة كربوهيد ارت ينتج عن عملية الهضم اضافة إلى مواد عضوية اضافة الببتون إلى الوسط الز ارعي يوفر كل المتطلبات المعدنية الضرورية للكائن الحي مثل الفسفور الكبريت الكربون العضوي والنتروجين. 44

45 م م طريقية تحضيير االوسياط الزرعيية Preparation of Culture Media بإذابة يتم وزن معلوم من الوسط في الماء المقطر اعتمادا على التعليمات الموجودة على علب االوساط الزرعية الجاهزة وقد تستخدم الح اررة فقط في تحضيرة االوساط الزرعية الحاوية على االكار Magnetic stirrer اال ضبط بعد بالتالي نضبط الهيدروجيني تحضير الذابة جميع مكونات الوسط ويمكن استخدام جهاز المحرك المغناطيسي لتسهيل هذ الخطوة. الوسط PH adjustment PH يؤخذ حجم قليل من البيئة ويضبط االس الهيدروجيني لها الحجم الكلي للوسط قبل تعقيمه. 5 نأخذ مثال : PH مللتر و من الوسط الغذائي ونضعها في بيكر ونضيف قطرة من الدليل "وهو عبارة عن مواد كيميائية تتغير الوانها بتغير الوسط" باستخدام إذا كانت البيئة قاعدية تسحح باستخدام HCl عياري 1.1 عياري 1.1 NaOH واذا البيئة حامضية تسحح ثم نحسب كمية الحامض أو القاعدة الالزمة لمعادلة من البيئة ثم نستخرج كمية الحامض أو القاعدة الالزمة لمعادلة حجم البيئة )الوسط الزرعي( إذا سم 3 5 سم كمية الحامض سم س 3 41 سم = س من البيئة مل فمثال: قياس الPH يكون اما باستخدام جهاز PH-Meter أو باستخدام PH - Paper معظم االوساط الزرعية يكون االس الهيدروجيني قريب من التعادل. ثم يسخن الوسط الزرعي لحد الغليان تغلق فوهة الدورق بسداد قطني ويعقم بجهاز الموحد )121 لمدة 15 دق( أو إذا احتوى الوسط على مواد تتحطم بالح اررة فمن الممكن ان يعقم بعملية التندلة أو الترشيح. واخي ار يبرد إلى درجة 51.) 32 فيصب بأحد االشكال المبينة في )الشكل 45

46 م م انواع البيئات الغذائية 1 -البيئات الغنية :Enriched media الوسط اضافة إلى المكونات الرئيسية مثل الدم المصل الكلوكوز بنسبة التعقيم. االوساط: أ- ب- ج- بعض انواع البكتريا تحتاج إلى مواد اضافية في السائل الخلبي بنسبة %11 %2 أو حيث تضاف هذ المواد إلى البيئات االعتيادية بعد تعقيمها بجهاز النها مواد بروتينية أو سكريات تتلف في درجات التعقيم العالية من امثلة هذ بيئة اكار الدم :blood agar تستخدم لتنمية انواع من البكتريا التي تحتاج إلى بروتينات وفيتامينات موجودة في الدم يحضر من اضافة الدم إلى وسط االكار المغذي بعد تعقيمه وتبريد إلى درجة وسط اكار الدم المطبوخ المغذي وهو بدرجة. ح اررة 51 chocolate agar: influenzae بيئة.Haemophilus : Thayer-martin يضاف الدم إلى وسط االكار يستخدم لتنمية بعض البكتريا المعقدة مثل تستخدم لتنمية مكو ارت السيالن Neisseria.gonorrhoeae -2 البيئات االنتقائية وذلك بسبب. أ- ب- غياب الموارد : selective media هي االوساط التي تسمح بانواع معينة فقط للنمو المغذية الضرورية والحرجة التي تجعل الوسط غير مناسب لنمو بعض االحياء المجهرية وليس جميعها. وجود مواد مثبطة لنمو انواع من االحياء المجهرية مثل Crystal NaCL violet,antibiotics وسط ماكونكي 1- الصف ارء و مثال: MacConkey Agar bile salts هذا الوسط يحتوي على امالح التي تسمح للبكتريا المعوية السالبة لصبغة ك ارم بالنمو بينما تثبط البكتريا الالمعوية الموجبة لصبغة ك ارم. crystal violet ويسمح ل ان وجود امالح الصف ارء هو الذي يجعل هذا الوسط انتقائي النه يثبط G+ بالنمو. -G 46

47 وسط Mannitol Salt Agar هذا الوسط يحتوي %7.5 ملح الطعام NaCl الذي يمنع كل انواع البكتريا ما عدا جنس العنقوديات.Staphylococccus االوساط التفريقية :Differential media تحتوي هذ االوساط على مواد تجعل بعض البكتريا تظهر بشكل يختلف عن االنواع االخرى وتسمح بالتفريق بين نوع واخر مثال ذلك وسط ماكونكي هذا الوسط يحتوي على سكر الالكتوز و دليل االحمر المتعادل neutral red بعد نمو البكتريا المعوية على هذا الوسط قسم منها يخمر سكر الالكتوز مثل Escherichia coli لتنتج حامض يغير لون الدليل بحيث تبدو المستعم ارت بلون وردي غامق مثل بكتريا )شكل 33(. ماكونكي ووسط proteus mirabilis تظهر مستعم ارتها شاحبة اللون قسم من البيئات تكون انتقائية وتفريقية في نفس الوقت مثل وسط اما وسط.EMB MSA فهو ايضا انتقائي وتفريقي في نفس الوقت حيث يحتوي على دليل الفينول االحمر. الوسط مهم للتفريق بين بكتريا Staphylococcus aureus المخمرة للمانيتول عن بقية انواع العنقوديات غير المخمرة له حيث تحول االولى الوسط من االحمر إلى االصفر )الحامضي( اما الثانية فتنمو دون تغير لون الوسط )شكل 34(. وسط اكار الدم يعتبر من االوساط الغنية والتفريقية في نفس الوقت حيث انه اضافة إلى كونه وسط غني فانه يميز بين انواع البكتريا الممرضة اعتمادا على قدرتها على تحليل الدم باف ارزها انزيم يسمى فمثال بكتريا Hemolysin Streptococcus pneumoniae تحل الدم جزئي ( Alpha )hemolysis حيث تظهر منطقة مخضرة حول المستعمرة. بينما بكتريا Streptococcus pyogenes شفافة حول المستعمرة تسمى ال تحلل الدم نهائيا مثل النوع من التحلل تحلل الدم تحلل كامل اذ تظهر منطقة.Beta hemolysis Staphylococcus epidermidis gamma hemolysis )الشكل 35(. انواع اخرى من البكتريا يدعى هذا

48 بعض االوساط قد تكون غنية وانتقائية حسب الحاجة. باضافة إلى مثال البنسلين الوسط يجعل الوسط انتقائيا للبكتريا السالبة لصبغة ك ارم. االوساط الخاصة ا: media special اوساط الغ ارض خاصة تستخدم -4 لعزل و تنمية مجموعة معينة واحيانا التفريق بين نوعين من البكتريا مثال ذلك وسط ( شكل 36( الخاص بتنمية Lowenstein-jensen media بكتريا السل والذي يحتوي على صبغة الملكايت االخضر التي تثبط نمو كل انواع البكتريا ما عدا بكتريا السل. هذا الوسط يستخدم لتنمية بكتريا السل. وبنفس الوقت تفرق بين السل البشري والسل البقري ( شكل 37( طرق الحصول علح مزارع نقية: المزرعة النقية :Pure Culture وهي التي تحتوي على خاليا نوع واحد من الكائنات الحية الدقيقة اما المزرعة المختلطة Mixed Culture هي التي تحتوي على نوعين أو اكثر من الكائنات الحية الدقيقة. وعادة التوجد البكتريا في م ازرع بصورة نقية في بيئاتها الطبيعية فلد ارسة انشطة وخواص خاليا النوع البكتيري الواحد يتطلب وجودها بصورة نقية وهناك عدة طرق للحصول على المز ارع النقية وعادة يتبع للحصول على المزرعة النقية طرق سهلة يتم فيها الزرع على البيئات الصلبة التاحة الفرصة لخاليا االنواع البكتيرية المختلطة والموجودة في صور مختلطة ان تنمو على سطح االكار متباعدة عن بعضها بدرجة تسمح ألن ينتج عن نمو كل خلية مفردة مستعمرة فردية تختلف في عن مواصفاتها االنواع االخرى فينا يلي اهم الطرق للحصول على م ازرع نقية للبكتريا: طريقة النشر Spread Method )شكل 38 (: -1 المواد المطلوبة: مزروع بكتيري سائل العمر ساعة )نوع بكتريا أو اكثر( كحول اثيلي )ايثانول( % ناشر زجاجي على شكل حرف L. 4- اطباق وسط TSA ماصات أو سرنجات معقمة. -5 طريقة العمل: 48

49 -1-2 باستخدام قلم التأشير يكتب اسم الطالب واسم البكتريا. 5-1 ينقل أ- ب- ج- د- ه- طبق بتري. سم 3 من المزروع السائل بواسطة السرنج أو ماصة معقمة إلى وسط يغمر الناشر في بيكر حاوي على ايثانول وبحذر يمرر فوق لهب بنزين. على سطح االكار. ينشر المزروع بواسطة الناشر بشكل متجانس على سطح الوسط. يبرد يعاد غمر الناشر في الكحول ثم يلهب ويترك تقلب االطباق وتوضع في الحاضنة. تفحص المستعم ارت. طريقة التخطيط المزروع ينقل ( شكل )39 :Streak Plate Method البكتيري بواسطة اللوب المعقم. يرفع الطبق )الموجود بشكل مقلوب على المضدة إلى االعلى( ثم يتم تخطيط حملة اللوب على المنطقة )1( وبشكل تقريبا ثلث الطبق. أي ان الغطاء إلى االسفل والطبق Zigag تعقم اللوب وتبرد ثم نقطع منطقة )1( بخط واحد ويستمر على شكل مسافة ثلث طبق اخرى. واخي ار يعقم اللوب وتقطع المساحة )2( بخط واحد مستمر إلى الثلث االخير. تقلب االطباق وتحضن بدرجة على مساحة Zigzag م. 37 على -3 طريقة صب االطباق Pouring Plate Method شكل :)41( وهي احد طرق الحصول على م ازرع نقيه واحد طرق تعداد البكتريا كما سيتوضح فيما بعد. 49

50 التحضيييين الهيييوائي وال هيييوائي Aerobic and Anaerobic Incubation يتباين مستوى االوكسجين في البيئات المختلفة في الكرة االرضية على سبيل المثال يحتوي الهواء الجوي على اوكسيد الكاربون 51 %21 من غاز االوكسجين والباقي نتروجين )خامل( اما في البيئات المائية فتكون قابلية ذوبان االوكسجين ضعيفة. و ثاني وسرعان ما تستفيد هذ الكميات القليلة من قبل الكائنات الحية المائية لذلك تنشا بيئات خالية نسبيا من االوكسجين و مع ذلك قد تتواجد بعض االحياء حسب احتياجها لالوسجين إلى المجاميع التالية كما هو مبين في : ( شكل )41 :Obligate aerobic bacteria )a( اوكسجين(. من امثلتها بكتريا. يحصل على الطاقة من التنفس الهوائي. وهي البكتريا التي ال تعيش بدون الهواء %21( Pseudomonas fluorescence تحتوي على انزيمي ال هذا النوع من البكتريا catalase and.superoxide dismutase :anaerobic bacteria )b( أو التخمر. وهي البكتريا التي تحصل على الطاقة من التنفس الالهوائي ال تتكاثر بوجود االوكسجين بل تموت في حالة وجود من امثلتها بكتريا Clostridium botulinum المعقمة بصورة صحيحة. حيث التي تسبب التسمم الغذائي خاصة في المعلبات غير تنبت المعلبة إلى خاليا خضرية تنتج سموم خارجية. :Facultative aerobic bacterria )c( تحصل على الطاقة من التنفس الهوائي )بوجود عادة السبو ارت في ظروف الهوائية داخل االغذية تنمو بوجود االوكسجين وبغيابه أي انها اختيارية. O2( أو من عمليات التخمر )بغيابه(. يكون النمو افضل في الظروف الهوائية مما هو في التخمر وذلك الن كمية ATP )الطاقة( تعيش في االمعاء. تكون اكثر من أي عملية اخرى. مثال ذلك نالحظ انتشار النمو في جميع االنبوبة سطح االنبوبة يعزى إلى قدرة البكتريا على التنفس. Escherichia coli :Microaerophilic bacteria )d( ال التي اما النمو الكثيف على وهي التي تحتاج إلى كميات قليلة من االوكسجين )2- %11( للتنفس الهوائي اما الت اركيز االعلى من ذلك تكون مثبطة لها. Spirillum volutans تسبب القرحة. التي تعيش في البيئات المائية و تنتج كميات قليلة من انزيمي من امثلتها بكتريا Helicobacter pylori التي catalase and superoxide.dismutase

51 Aerotolerant bacteria )e( الغ ارض الطاقة. هي مخمرة اجبارية مثال ذلك بكتريا انتاج االجبان و تستطيع النمو بوجود االوكسجين ولكن التستفاد منه Lactobacillus Streptococcus pyogenes التي تستخدم في الي تسبب التهاب اللوزتين. يطلق عليها احيانا مصطلح مخمرة مجبرة ولذلك النمو غي كثيف على السطح. طرق الحصول على ظروف الهوائية: Deep agar -1 : الطبقات السطحية منه تحتوي على كميات من االوكسجين اكثر من الطبقات السفلى وتقل هذ الكميات كلما اخترقنا االكار إلى االسفل. 2 -الوسط المغذي السائل: ممكن ا ازلة االوكسجين منه وذلك بتسخين الوسط إلى درجة الغليان لمدة عشر دقائق لطرد االوكسجين اضافة إلى استخدام الب ارفين المعقم بعد التلقيح لغزل الهواء عن الوسط. 3- اضافة مواد مختزلة لمنع تهوية الوسط بتيا ارت الحمل مثل: الكلوكوز او أي سكر اخر حامض الثايوكاليكوليك الذي يحتوي على مجموعة االوكسجين. عوامل مختزلة مثل حامض االسكوربيك اللحم المطبوخ... مسامير. SH حرة تتحد مع 4- jar :Anaerobic هو عبارة عن وعاء محكم السد ممكن خلق ظروف الهوائية بدخله إما بسحب االوكسجين منه بواسطة vacuums واستبداله بخليط من نيتروجين وثاني اوكسيد الكربون )كالهما يسرع نمو بعض االحياء المجهرية(. يمر الهيدروجين عند دخوله إلى الوعاءعلى مصدر بالتني )عامل يسرع من تفاعل الالوكسجين المتبقي داخل الوعاء مع الهيدروجين لتكوين الماء(. أو ممكن استخدام اكياس ال pack( )gas الجاهزة بعد اضافة 11 مل من الماء إلى محتويات هذا الكيس ليتحرر غاز الهيدروجين وثاني اوكسيد الكربون. يتفاعل االوكسجين المحصور داخل الوعاء مع الهيدروجين المتحرر من الكيس لتكوين الماء وخلق ظروف ال هوائية كما هو مبين في ( شكل.)42 5- tube :Wright's ممكن ايضا خلق ظروف ال هوائية داخل الوسط الطلب )المائل( باستخدام بلو ارت ال pyrogallol التي تتاكسد في الوسط بوجود هيدروكسيد الصوديوم. 51

52 م م بعد تلقيح البكتريا على سطح المائل توضع طبقة من القطن ثم طبقة من بلو ارت pyogallol واخي ار يضاف 1 سم ³ من 11 ثم تغلق بسداد محكم تقلب % NaOH وتحضن.)شكل 43( 6- dish :Brewer s anaerobic petri هذا النوع من االطباق والمبين مصمم بحيث يحتوي الغطاء على جسر يحجز سطح الوسط عند غلق الطبق ويمنع دخول الهواء إلى داخل الطبق. يستخدم وسط اكار خاص بهذ الطريقة Brewer s anaerobic agar الذي يحتوي على تركيز عالي من thioglycolate acid الذي يحتوي في الوسط.)شكل )44 7- تنمية البكتريا الالهوائية مع بكتريا هوائية في نفس الطبق )مع ترك مسافة بينهما لمنع الثلوث( وسد الطبق سد محكم! في هذ الحالة ستقلل البكتريا الهوائية من oxygen tesion لتسمح للبكتريا الالهوائية بالنمو. العمل في المختبر: 1- تحيد متطلبات البكتريا لالوكسجين: * توضع انابيب لوسط دقائق. Tryptic soy agar * تبرد االنابيب إلى درجة تقريبا 45 في حمام مائي بدرجة الغليان لمدة عشر باستخدام ماء الحنفية. تلقح االنابيب بالبكتريا. * باستخدام االبرة المعقمة وذلك بغرزها بعمق داخل االنبوبة. تمزج البكتريا مع الوسط بحذر )بين ارحة اليدين(. ثم برد االنبوبة وبسرعة باستخدام ماء الحنفية. سجل اسم البكتريا واسم الطالب ثم حضن بدرجة ح اررة 37 لمدة 24 ساعة. الحظ مناطق النمو وحدد نوع البكتريا حسب احتياجاتها لالوكسجين. 2- تنمية البكتريا في ظروف الهوائية: * يسخن الوسط المغذي السائل Tryptic soy broth يبرد ثم يلقح بالبكتريا. لمدة 5 دقائق لطرد االوكسجين. * تحت ظروف معقمة يضاف طبقة من الزيت أو شمع الب ارفين المعقمين. ثم تحضن االنانبيب بدرجة ح اررة 37 واق أر النتيجة: + : )تعكر الوسط(. - : انعدام النمو )التعكر(. لمدة 48 ساعة. افحص النمو )تعكر الوسط السائل( 52

53 التقدير الكمي للنمو البكتيري Quantitative measurements of bacteria growth من الضروري احيانا للباحث ان يعرف عدد الخاليا في عينة ما كان يكون عدد 3 البكتريا الموجودة في نموذج مثل ) 1 سم ) من الحليب أو ماء الشرب. اوالا: ثانيا:. ال الطرق المباشرة Direct Methods Breed count -1-2 طريقة بريد. )counting chamber ) Haemocytometer McFarland Turbidity -3-4 الطرق غير المباشرة انابيب ماكفارالند. قياس درجة التعكر. Indirect Methods Plate count Dry weight -1-2 طريقة العد باالطباق. الوزن الجاف. Filter membranes -3 طريقة الترشيح. أو مستحضر تجاري باستخدام شريحة العد. اوالا: الطرق المباشرة 53 Direct Methods تعداد بريد 1- Breed count 45(. )شكل تستخدم هذ الطريقة لتعداد االحياء المجهرية في منتجات االلبان. السهلة والسريعة وكاالتي: ارسم على شريحة نظيفة مربع مساحته ) 1 سم ) في منتصف الشريحة. رج عينة البكتريا ثم انقل سم standard loop جفف. 3- وهي من الطرق اما بوسطة ماصة معقمة ومدرجة أو بواسطة وانشر العالق ضمن المساحة المحددة بواسطة اللوب. ثبت بالتسخين )عند تقدير البكتريا في الحليب ي ازل الدهن اوال بال ازيلول ثم يثبت الساليد بالكحول %25 اضف صبغة 4- Methylene Blue لمدة دقيقة ثم يترك ليجفف بالهواء(. لمدة نصف دقيقة ثم اغسل 3 معدل عدد خاليا البكتريا في ) 1 سم ) من العينة األصلية: ان المسافة بين كل قسم من الشريحة الميكرومترية واآلخر = وان معظم المجاهر فيها قطر المجال تحت العدسة الزيتية يساوي 16 قسم أي μ11 احسب جفف

54 161µ = 11µ مساحة المجال تحت العدسة الزيتية = )ط 2 نق ) 2 )81( μ = = مايكرون 2 عدد المجاالت في ) 1 سم ) = 2 1 سم μ ملم 1 سم( μ 2 μ ( = μ هناك أي ان مجال في كل مجال بكتريا واحدة سيكون هناك سم مساحة على الشريحة أي لو كان في كل بكتريا في كل سم لكل مل من العينة االصلية. ( شكل )46-2 من العينة أي استخدام الهيموسايتوميتر لتعداد خاليا البكتريا Counting chamber (Hemocytometer) وهي طريقة سريعة للتعداد المباشر لخاليا البكتريا (Hemocytometer) شكل )47( الشريحة. إضافة إلى المجهر الضوئي. ويستخدم فيها شريحة خاصة ممكن تعداد العدد الكلي للبكتريا المعلقة في سائل ما وذلك بوضع عمق السائل بين الغطاء والشريحة مساوي إلى )1.1 مقسم إلى مربعات صغيرة ثم أصغر فأصغر. أي أن في ملم ² طريقة العمل:- المليمتر المربع الواحد هناك 411 ملم(. على العالق أما سطح الشريحة فهو وان أصغر مربع مساحته تبلغ )1/411( مربع صغير. شكل )48( يخفف عالق البكتريا بتخافيف عشرية ويتم اختيار التخفيف الذي يبدو قليل التضبب. اغسل شريحة الهيموسايتوميتر والغطاء وجفف بقطعة قماش نظيفة. 3- ضع الغطاء فوق الشريحة. 54

55 55-4 الحسابات: رج أنبوبة العالق قطارة أو سرنجة. لمجانسته ثم انقل قطرة من العالق باستخدام ماصة باستور أو 5- ضع فتحة الماصة بحذر لتالمس حافة الغطاء المالمس لحافة الشريحة لتدخل القطرة بالخاصية الشعرية. ليتوزع تلقائيا على المربعات في الشريحة. في هذ الخطوة سيدخل حجم )1.1( شكل 3 سم.)42( -1 توضع الشريحة تحت قوة التكبير الصغرى ونبدأ بالتعداد. في حالة تعداد البكتريا في المربعات الصغيرة. * لنفرض تم حساب عدد البكتريا في مساحة. 111 بما أن مساحة المربع السغير الواحد هي إذن مساحة مربع صغير وكان العدد = /411 ملم مربع صغير / /4 ملم = = أما في الملمتر المربع الواحد سيكون هناك = ولكن هناك عمق في الشريحة الحجم = المساحة 2111 العمق )ملم ) = = أي أن العدد اذن في الملم ملم سم خلية هو في 2 خلية لكل ملم خلية. من العالق لذلك يجب حساب العدد في وحدة حجم وليس من الملم الواحد هناك )11( م ارت هذا العدد عدد البكتريا في الملم المكعب الواحد للعينة األصلية هو: 3 خلية / ملم = بما أن الكلي للبكتريا 3 1 سم = )mm( ملم لتحويل الملمتر المكعب إلى في كل سم )مللتر( مكعب يجب ضرب العدد مل من العينة األصلية = أما إذا كان العالق مخفف فيضرب الرقم خلية/مل معكوس التخفيف وبذلك يصبح قانون حساب عدد الخاليا بهذ الطريقة: ليصبح العدد

56 عدد البكتريا / 1 مالحظات هامة: 3 سم من العينة األصلية = معدل عدد الخاليا في المربع الواحد معامل 6 الشريحة )4 11 ) معكوس التخفيف )ان وجد(. * عند إدخال عالق البكتريا في الشريحة المقسمة قد تستقر بعض الخاليا على الحدود ما بين المربعات مما قد يؤدي إلى احتمال تعدادها مرتين وبالتالي قد يؤثر ذلك على العدد الكلي. لتالفي هذا الخطأ يتم حساب الخاليا على الحدود العليا واليمنى وتهمل الخاليا على الحدود السفلى واليسرى كما مبين في الشكل. )51( ثانيا: الطرق غير المباشرة التعداد الحي Indirect Methods (Plate Count) Viable Count في طرق التعداد المباشر يتم تعداد الخاليا يهمنا ان نعرف اعداد الخاليا الحية. مستعم ارت. وتعتمد طريقة العد باالطباق الحية والميتة ولكن في معظم الحاالت والخلية الحية هي التي تستطيع ان تنمو Plate Count لتكون وتتكاثر على اساس ان كل خلية حية توضع في وسط مغذي صلب وتحت ظروف مناسبة تنمو وتتضاعف لتعطي مستعمرة. عدد المستعم ارت التي تظهر على الطبق بعد التحضين يمثل عدد الخاليا الحية في العالق او العينة االصلية. هناك طريقتان الج ارء هذ الطريقة: ( شكل )51.Spread Plate Method.Pour Plate Method -1-2 الطريقة االولى في Spread plate ينشر ان اليتعدى وسط االكار باستخدام ناشر زجاجي معقم. عند ذلك تعد المستعم ارت. اما في طريقة صب االطباق سم Pour Plate من التخفيف المناسب شرط ثم يحضن لحين ظهور المستعم ارت فينقل حجم معين )1.1 إلى طبق معقم فارغ ثم يصب الوسط ويمزج جيدا بتدوير على شكل حرف "8". ليبرد ويحضن يتم اختبار االطباق التي تظهر فيها سم ) 31 من الضروري جدا اج ارء تخافيف عشرية )11/1 التخفيف االول باضافة سم من العينة مع سم مستعمرة. ثم يترك 111/1 ( ممكن اج ارء من المذيب. 56

57 ممي ازت هذ الطريقة: وجود عدد قليل جدا من الخاليا الحية لكل تعطي تقدير دقيق األعداد الحية فقط 3 سم ليس هناك وسط مغذي معين لكل انواع البكتريا. و من العينة في هذ الطريقة. ممكن الكشف عن اما مساوئها: فالوسط المستخدم قد البكتريا وقت التحضين والفترة الزمنية أيضا لها تاثير على اعداد البكتريا. بعض المستعم ارت قد تكون صغيرة يصعب رؤيتها وعدها. على نتائج دقيقة. يالئم ال اضافة إلى ان لتالفي عمل مكر ارت لحصول والفترة الزمنية الالزمة لتحضير الطبق هي )24( ساعة لكي يتسنى لكل خلية أن تنمو إلى مستعمرة. مالحظة: إضافة إلى صعوبة تنمية كل أنواع البكتريا على وسط معين. نظ ار لصعوبة تعداد أكثر من )311( مستعمرة يفضل إج ارء تخافيف للعينة التي يتوقع فيها أعداد عالية من البكتريا أما في حالة اندماج خليتين بكتريتين أو أكثر المسبحيات( لتعطي مستعمرة واحدة فإن ما يتم )CFU( بدال من خلية لكل ثم ينقل حجم معين محسوبا إلى الطبق. تعداد يدعى )وهي حالة طبيعية في بكتريا Colony Forming Unit 3 سم. يتم اختيار األطباق التي تحتوي على )311-31( مستعمرة وتهمل األطباق التي يظهر فيها أقل من )31( مستعمرة ألسباب إحصائية. )311( مستعمرة المواد المطلوبة: -1 فتهمل ألنها صعبة التعداد لت ازحمها. مزرعة لبكتريا Escherichia coli -2 ست أنابيب تحتوي كل منها على )2( أما األطباق التي تظهر فيها أكثر من بعمر )24( ساعة. 3 سم ماصات معقمة. ست أطباق بتري معقمة. وسط اآلكار المغذي )511 3 في سم ) من دورق معقم. السالين المعقم. 57

58 م طريقة العمل: أنقل )1( سم أو السالين المعقم. من المزرعة البكتيرية إلى أنبوبة تحتوي على )2( ترج األنبوبة لمجانسة العالق. 3 سم 1- )11/1( أي ( 11.) -2 أنقل )1( من الماء المقطر سيكون التخفيف في هذ األنبوبة هو 1-3 سم من التخفيف )11 ) إلى أنبوبة أخرى تحتوي على )2( 3 سم -3 المعقم سيكون 2- التخفيف في هذ األنبوبة هو )11 (. 6- )11 ) حسب عكورة المزرعة األصلية. أ- بعد تحضير التخافيف يتم التعداد بأحد الطريقتين: ب- طريقة النشر: -1-2 يصب وسط اآلكار المغذي في ثالثة أطباق معقمة. تترك إلى أن تبرد وتجمد جيدا أنقل )1( سم -4 السالين من وهكذا إلى أن تصل إلى تخفيف 4- من التخفيف )11 ) إلى الطبق بعد كتابة التخفيف واسم البكتريا على ظهر الطبق بواسطة قلم التأشير. التخافيف األخيرة. يعقم الناشر الزجاجي بالتلهيب الكحولي. سطح اآلكار ويترك لمدة خمسة دقائق. لمدة )48-24( ساعة. طريقة صب األطباق: وهكذا بالنسبة إلى بقية يبرد ثم ينشر عالق البكتريا على يقلب ويحضن بدرجة 37 ح اررة شكل )52(: -1-2 بعد تحضير التخافيف أعال ينقل ) ( إلى طبق بتري معقم وفارغ. يبرد وسط اآلكار المغذي في الدورق إلى درجة سم يصب الوسط في األطباق. تدور األطباق باليد على شكل رقم "8" تترك األطباق إلى أن يجمد الوسط. تترك وتحضن كما في الطريقة السابقة. أو إلى األمام م 3 من التخافيف األخيرة الخلف يمين ويسار. بعد االنتهاء من فترة التحضين يتم اختيار األطباق التي تحتوي بين )31-311( مستعمرة. أما األطباق التي تحتوي على اقل من )31( مستعمرة تهمل ألنها ال تعطي نتائج دقيقة فقد تحدث أخطاء خالل نقل العالق أو ظروف في التحضين غير مناسبة من PH درجة ح اررة ال.

59 عليها أما األطباق التي تحتوي على أكثر من )311( مستعمرة.)TNTC( Too Numerous To Count -5-6 عدد الخاليا/ يتم تعداد أعداد المستعم ارت في األطباق المناسبة. يطبق القانون التالي: 3 1 سم من العينة األصلية = عدد المستعم ارت )في حالة نقل فتهمل ايضا اذ يطلق معكوس التخفيف سم ) التخافيف Dilutions لتحضير التخافيف: 1- لتحضير التخافيف تستخدم المعادلة اآلتية: حجم العينة حجم العينة + حجم المذيب الجزء الكل التخفيف = امثلة محلولة: مثال- الحل: مثال الحل: :- 1 التخفيف= ما هو تخفيف العينة الناتج عن اضافة )مذيب( 3 سم 2 منها إلى 1 سم 3 من 2+ 1\1 11\ = = :-2 ما هو تخفيف الناتج عن اضافة السالين سم من العينة إلى \1 1 11\ التخفيف = = = السالين من سم 3 59

60 - س 1 س 2 س 3 س 4 تمارين في التخفيف مزرعة بكتيرية تحتوي على أ- 8.2 خلية / 11 التي تحصل عليها عند نشر: سم سم 3. كم تتوقع عدد المستعم ارت ب سم - \ أ- وضح ثالث طرق لعمل سم 1 ب سم \ 1 ج- 3 5 سم \ 1 بين طريقتان للحصول على تخافيف المذيب. 11\1 سم 2.1 باستخدام 3 سم 2.2 و 3 المخطط ادنا يبين عملية حيث وضع أ- ب- ج- د سم تخفيف اللبن قبل التعداد بطريقة صب االطباق. على مكررين )طبقين( من االنابيب أي األطباق ضمن المدى الصحيح للتعداد ماهو معدل عدد الخاليا في االطباق ماهو التخفيف النهائي لكل من ماهو عدد الخاليا / سم.B, C, D A, B, C and D 3 ما في عينة اللبن االصلية من س 5 - مزروع للبكتريا Escherichia coli بعمر 18 ساعة يحتوي على 11 2 /سم كيف يمكن تخفيف المزروع للحصول على مستعم ارت قابلة للعد وضح بمخطط 3 61

61 م -1-2 تأثير العوامل البيئية في نمو البكتريا The Effect of environmemntial factors on bacterial growth يعتمد نمو الكائنات المجهرية على نوعين من العوامل: العوامل الذاتية أي الو ارثية: وهي التي تحدد كيفية تصرف الكائن تجا بيئته وهي المسؤولة عن التباين في القد ارت بين نوع واخر في نفس البيئة. العوامل البيئية التي تؤثر على سرعة وكمية النمو الضوء الماء الضغط مصادر ال PH C وتشمل عوامل فيزيائية مثل الح اررة أو كيميائية مثل وجود بعض السموم في الوسط الغذائي الطاقة N,O االحماض االمينية على شكل شبكة متداخلة من المتطلبات يؤثر البعض منها على االخر. ان د ارسة وفهم هذ وتسهل لنا اكتشاف وتطوير طرق جديدة 4 هي كل هذ العوامل تكون العوامل تساعدنا على تفسير توزيع االحياء المجهرية في البيئة للسيطرة عليها أو تنشيطها. من العوامل البيئية التي تلعب الدور االهم على فعالية االحياء المجهرية عوامل: الح اررة O2-3.PH -2 الماء 1- تأثير درجة الح اررة :Effect of temperature وهي من العوامل المهمة ان لم تكن االهم التي تتحكم في كل تفاعل كيميائي داخل الخلية الحية وبالتالي على تكاثر الخلية. لكل كائن مجهري هناك مدى لدرجات الح اررة للنمو بعضها ينمو بدرجات ح اررية منخفضة )صفر م( بينما البعض االخر تنمو بدرجات عالية جدا قد تصل تتعدى درجة الغليان )111 االحياء المجهرية بما يسمى (. وممكن التعبير عن المدى الح ارري لنمو Cardinal temperature 1- درجة الح اررة الدنيا.Minimum temperature وهي اقل درجة يستمر فيها النمو والفعاليات الحيوية 2- درجة الح اررة المثلىtemperature. Optimum مدى ضيق من درجات الح اررة ما بين الدنيا والقصوى يكون فيها النمو االفضل واالسرع.. 3- درجة الح اررة القصوى Maximum temperature 61

62 م م م م اعلى درجة يحصل فيها النمو أي زيادة عنها يتوقف النمو ولو استمرت درجة الح اررة اكثر يتوقف نشاط االنزيمات الحوامض النووية وتموت الخلية. )التعقيم(. لذلك فان الح اررة من العوامل المهمة في السيطرة على النمو االحياء المجهرية ممكن تقسيم االحياء حسب تحملها لدرجات الح اررة إلى: ( شكل 53( Mesophiles المحبة لدرجات الح اررة المعتدلة تنمو بدرجات ح اررة بين م المثلى لها بين م. تنمو بمدى يمكنها التواجد على اجسام الحيوانات النباتات االنسان مثال: التي تفضل النمو في درجة ح اررة من اما االنواع مئوية Escherichia coli المتواجدة في التربة فالمثلى لها 31 )للتربة درجة ح اررة اقل من الجسم(. لذلك فان الجسم ولكي يتغلب على االحياء المجهرية الممرضة يعطي ايعاز لرفع درجة الح اررة )الحمى( 45 ليوقف نمو البكتريا. ولكن لو ارتفعت درجة ح اررة الجسم إلى تؤثر على حياة قد المصاب. المحبة لدرجات الح اررة الواطئة - 5-( 15 م ) والدرجة المثلى اقل من psychrophiles هي الكائنات التي تسطيع النمو بدرجات منخفضة قد تصل االنجماد. 15 مثال عليها -2 بعض انواع pseudomonas بعض انواع هذ المجموعة ينمو في المناطق المنجمدة. البعض االخر تنمو جيدا في الغذاء المخزون في الثالجة لتؤدي إلى فساد االغذية ولكن هناك انواع مفيدة فمثال انتاج اغلى انواع cheese( Roquefort (blue االجبان يعتمد على الكائن المجهري )الفطر( Penicillium roqueforti منخفضة. الذي يفضل النمو بدرجات ح اررة المحبة لدرجات الح اررة العالية تنمو بدرجات ح اررة بين 81 او اكثر والمثلى لها 45-3 Thermophiles 51 - ما بين 45 تتواجد في التربة القريبة من ال اربكين والينابيع الساخنة. هناك نوع من البكتريا المحبة 113 لدرجات اعلى Hyperthermophilic حيث عزلت حديثا بكتريا تعيش بدرجة ح اررة بل حتى بعض اف ارد هذ المجموعة بدرجات ح اررية عالية إلى الحد الذي يستخدم بعض الباحثين لعزلها. العديد منها مكونة للسبو ارت. هذا التحمل لدرجات الح اررة Autoclave العالية يعود إلى نوعية احتوائها انزيمات ثابتة ح ارريا.Thermostable 62

63 م Refrigeration retards food spoilage becauseit limits growth of mesophiles. * * تقريبا ان التبريد يؤخر من تلف االغذية النها تحدد نمو البكتريا المحبة لدرجات الح اررة المعتدلة.. 37 هناك تباين بدرجة ح اررة مناطق مختلفة من الجسم فالقلب اما المناطق االخرى تتباين الدماغ الجهاز الهمضي فيها درجات الح اررة لهذا السبب بعض البكتريا تسبب المرض في مناطق محددة من الجسم وال تؤثر على مناطق اخرى. مثال: Hansen s disease (leprosy) االقدام االصابع( Mycobacterium leprae يصيب المناطق الباردة من الجسم )االذن 31 والكثر من -2 الجسم لرفع درجة الح اررة )بادخال مسبب المالريا( لعالج السفلس. تأثير درجة الحموضة :Effect of (PH) اليدين عاما استخدم تحفيز العامل االهم االخر هو تركيز ايون الهيدروجين الموجب والذي يعبر عنه ب H/1+( حيث يحدد النشاط االنزيمي خاصة االنزيمات البروتوبالزم. وعندما تساوي قيمة ال log -( PH الواطئة تعني ت اركيز عالية من الخاصة بالنمو بناء مادة H+ يتبعها ت اركيز واطئة من -OH OH PH و+ H فان ذلك يعني التعادل. المتعادل )2-5( اما الفطريات تنمو بمدى )6-2(. معظم االبتدائيات والبكتريا تفضل ال ( شكل )54 بصورة عامة تقسم االحياء المجهرية تبعا لتحملها PH صفر PH المحبة للحموضة 1- Acidophiles المحبة لدرجة الحموضة المعتدلة -2 Neutrophiles المحبة للقاعدية 3- Alkalophiles االحياء المجهرية التي تسبب ام ارض في الجهاز الهضمي يجب ان تتكيف لتحمل البيئة الحامضية للمعدة مثال Shigella, Escherichia coli لمدة ساعتان على االقل كما اظهرت الد ارسات ان خلية لها القدرة على تحمل 2.5 PH Shigella قد تتمكن من المرور خالل المعدة لتسبب الديزنتري )أي قاومت حموضة المعدة( مثال اخر Helicobacter pylori المسببة للقرحة تكسر اليوريا مع الماء لرفع ال كما PH يلي: 63

64 NH4++ OH- ولتنمية االحياء المجهرية في المختبر من المهم السيطرة على معالجة ت اركم الحوامض التي تنتجها اثناء النمو. كيميائية تدعى الدواريء NH3 + H2O PH.Buffers يجب الوسط. الحوامض والقواعد تتعادل باستخدام مواد تشخيص البكتريا Identification of Bacteria إن نمو وتكاثر البكتريا ينتج عن تمثيل المواد الغذائية في الوسط باالستعانة ببعض االنزيمات التي تعطي الكائن المجهري هويته )قدرته على استهالك المواد المتوفرة في الوسط الغذائي(.وجود أو انعدام هذ األنزيمات هو الذي يحدد إمكانية استخدام المواد الخام )المواد الغذائية( والمتوفرة في البيئة واالستفادة منها كمصدر للطاقة. ال أو بناء الت اركيب الخلوية وبذلك تتحكم األنزيمات بالتغي ارت البايوكيمياوية التي تحصل داخل الخاليا وخارجها مثل نوع السكر المستهلك األمينية أو البروتينات يعتمد التي تجرى تتضمن هذ اإلج ارءات: نوع التنفس )هوائي او الهوائي( وقابليتها على تحلل الدهون. تشخيص البكتريا )Identification( على القدرة على تكسير األحماض مجموعة من الفحوصات العملية لتحديد التصنيف العلمي )االسم العلمي( الذي تنتمي إليه العزلة المجهولة. عزل البكتريا على البيئات المختبرية المناسبة وبشكل نقي Culture(.)Pure د ارسة الشكل المظهري للمستعم ارت )حجم البكتريا. تصبيغ االختبا ارت البايوكيمياوية. التنميط السيرولوجي. التنميط العاثي. شكل لون قوام ال (. بعد عزل البكتريا بشكل نقي وتصبيغها بصبغة ك ارم أو الصبغة الصامدة للحامض أو غيرها حسب نوع اإلصابة هناك مجموعة من االختبا ارت البايوكيمياوية للتفريق بين المجاميع المتقاربة فيما بينها في البكتريا المعوية الصفات المورفولوجية والفسيولوجية مثال: Enterobacteriaceae وهي مجموعة من البكتريا تتواجد في أمعاء اإلنسان وبعض اللبائن األخرى. خالياها عبارة عن عصيبات قصيرة سالبة لصبغة ك ارم 64

65 غير مكونة للسبو ارت. يعتبر تشخيص هذ البكتريا من األولويات الضرورية لتشخيص بعض األم ارض الالتي تنتقل عن طريق الميا أو الغذاء. -1 ممكن تقسيم هذ المجموعة إلى ثالث أقسام: )الممرضة( 2 -)الممرضة أحيانا ( :Pathogens مثل أف ارد جنس.Salmonella, Shigella :Occasional Pathogens مثل أفر اد جنس Proteus,.Klebsiella 3 -)الفلو ار الطبيعية لءمعاء( Normal Intestinal flora مثل جنس Enterobacter,.Escherichia كما يمكن تقسيمها حسب قدرتها لتخمير سكر الالكتوز: Escherichia coli Enterobacter aerogenes Lactose fermenters Klebsiella pneumoniae Salmonella typhimurium Shigella dysenteriae enteric Proteus vulgaris Lactose nonfermenters Pseudomonas aeruginosa Alcaligenes faecalis Corynebacterium xerosis Micrococcus luteus Streptococcus lactis Staphylococcus aureus Nonenteric Bacillus cereus 65

66 م اختبارات المعوية: IMViC وهي مجموعة من أربعة اختبا ارت بايوكيمياوية تستخدم للتفريق بين أف ارد البكتريا Indole production test فحص انتاج االندول. :I Methyl Red Test: M فحص المثيل االحمر. Voges Proskauer test فحص فوكس بروسكاور. :V For easier pronounciation لسهولة التلفظ. :I Citrate utilization test فحص استهالك الست ارت. :C -1 اختبار إنتاج األندول :Indole Production test )Tryptophanase( الغرض من االختبار: التحري عن انواع البكتريا المنتجة النزيم محلل الحامض االميني التريبتوفان الموجود في الوسط ليعطي االندول حامض البايروفيك واالمونيا. البكتريا تستخدم حامض البايروفيك واالمونيا كمتطلبات للنمو اما االندول فيت اركم في الوسط. الوسط المستخدم:ماء الببتون Pepton water وهو وسط سائل يحتوي على: 21 ببتون )غني بالحامض االميني التربتوفان( غم. كلوريد الصوديوم 5 غم 1 PH= 7 4 ماء مقطر لتر )Semisolid Indol Motility( او وسط SIM وهو وسط نصف صلب يلقح بطريقة الطعن.)Stabbing( يلقح أحد األوساط أعال بالبكتريا ثم يحضن بدرجة ساعة. لمدة الكاشف: Kovac s Reagent والذي يتكون من: سم كحول اميلي او ايزواميلي غم 3 سم P- dimethylaminobenzaldehyde حامض الهيدروكلوريك المركز تضاف خمسة قط ارت من أحد الكواشف بعد انتهاء فترة التحضين. يستدل على إنتاج األندول بظهور نتيجة انتاج حمر اء حلقة األندول من الوسط وتفاعله مع الكحول المحمض 66 P- Dimethylaminebenzaldehyde وبالتالي تكوين معقد مع األحمر اللون )النتيجة

67 الموجبة( مثال: 67. Escherichia مثال: coli.enterobacter aerogenes أما النتيجة السالبة فهي عدم ظهور اللون األحمر شكل )55(.)56( -2 اختبار المثيل األحمر الغرض من االختبار: من النواتج النهائية الحامضية.. :Methyl Red Test Escherichia coli لتحديد قابلية البكتريا على أكسدة الكلوكوز وانتاج ت اركيز عالية كذلك للتمييز بين األنواع المؤكسدة للكلوكوز مثل وaerogenes Enterobacter بالرغم من أن جميع اف ارد البكتريا المعوية تستهلك الكلوكوز )كمصدر للطاقة( إال أنها تختلف فيما بينها في النواتج النهائية وحسب األنظمة األنزيمية )التي تمتلكها كل بكتريا(. معظم أجناس البكتريا المعوية تحول الكلوكوز إلى حامض وقد تستمر في إنتاجها للحوامض العضوية وبت اركيز عالية من حامض االكتيك Lactic Acid Formic Acid حامض الخليك إضافة إلى بعض الغا ازت مثل تدعى هذ العملية التخمر المختلط Acetic Acid حامض السكسنيك حامض الفورميك.Succinic Acid, CO2 H2 والناتجة من تفكك حامض ال.Formic Acid Mixed Acid fermentation فهي ايضا تستهلك السكر ولكن بإنتاج مواد متعادلة )نواتج نهائية( بعملية تدعى. أما األجناس األخرى butandiol fermentation شكل.)57( معظم أجناس البكتريا المعوية تنتج وفي الم ارحل المبكرة للتحضين نواتج نهائية عبارة عن حوامض عضوية. إلى انخفاض ولكن في حالة ال coli Escherichia أو أقل 4.4 الوسط إلى PH بينما بكتريا ال مثال تستقر هذ النواتج لتؤدي وaerogenes Enterobacter تحول هذ الحوامض أنزيميا إلى نواتج متعادلة في نهاية فترة التحضين المتعادلة قد تكون Acetoin (acetylmethylcarbinol) Ethanol تقريبا. 6 إلى PH الوسط المستخدم: وسط ماء الببتون والكلوكوز والفوسفات هذ النواتج تؤدي إلى ارتفاع ال Glucose phosphate ) MR VP medium ( peptone water ويتكون من: ببتون امالح الفوسفيت ثنائية البوتاسيوم كلوكوز ماء مقطر وهو وسط سائل يحتوي على % 11 غم غم 3 سم 1 لتر ( يعقم بالترشيح( 5 غم/لتر كلوكوز

68 ا) 7.6 =PH يحضن في درجة الكاشف صبغة المثيل االحمر كحول االيثانول ماء مقطر 28 لمدة م :Methyl Red وهو أفضل كاشف ويتكون من: ساعة غم 3 سم سم PH يتحسس لهذ القيمة من الحامضية )4.4( أما عند ال 6 PH توجد بعض الحوامض ولكن تركيز أيون الهيدروجين يكون واطئ لذلك يعطي اللون األصفر )النتيجة السالبة لالختبار(. النتيجة الموجبة: مثل بكتريا المالمسة للهواء وعند رج األنبوبة يتحول االوكسجين. مثال بكتريا.Enterobacter aerogenes تحول لون الوسط إلى اللون االحمر خاصة في الطبقات العليا Escherichia coli الوسط كله إلى اللون االحمر حسسب كمية شكل )58(. اختبار 3- :Voges Proskauer الغرض من االختبار: تخمر البيوتاندايول للكشف عن البكتريا التي تستهلك الكلوكوز بطريقة Butandiol fermenters butandiol, acetoin الوسط. حيث يتكون في الوسط مركبات ال وقليل من الحوامض العضوية مما يؤدي إلى انخفاض بسيط في ينتج عن تخمر الكلوكوز بهذ الطريقة مركب PH Acetyl Methyl Carbinol Acetoin والذي قد يتأكسد ليعطي الوسط المستخدم يحضن بعد التلقيح لمدة من الكاشف: Diacetyle أو يختزل إلى.Butyelenglycol المعروف MR VP medium Glucose phosphate peptone water ساعة. 48 Barritt s reagent O'meara reagent أو alchoholic alpha-naphthol %41 و KOH Acetyl Methyl Carbinol يجب أوال أن يتأكسد إلى الكاشف يحتوي على خليط diacetyl alpha-naphthol ومجموعة الكواندين ستكون ظهور اللون الوردي بعد النتيجة الموجبة: guanidine 15 دقيقة من إضافة الكاشف. اللون الوردي مثال البكتريا للكشف عن مركب وهذا يحصل بوجود لموجودة في ببتون الوسط(.. Enterobacter aerogenes النتيجة 68

69 بكتريا النتيجة السالبة: عدم ظهور اللون الوردي أي بقاء لون الوسط أصفر شاحب مثال Escherichia coli شكل.)52( :Citrate Utilization test -4 الغرض من االختبار: للكشف عن البكتريا القادرة على استهالك )تخمر( الست ارت كمصدر للكاربون واالمونيا كمصدر وحيد للنيتروجين. عند غياب الكلوكوز أو الالكتوز بعض البكتريا لها القدرة على استخدام الست ارت كمصدر كاربوني للحول على الطاقة. هذ القدرة تعتمد على وجود أنزيم Citrate permease الذي يقوم بنقل الست ارت من الوسط إلى داخل الخاليا حيث تكسر جزيئات الست ارت بأنزيمات داخل الخاليا لالستفادة من الكاربون كمصدر للطاقة. ينتج عن هذ العملية ثاني أوكسيد الكاربون الذي يتفاعل مع الصوديوم والماء ليعطي كاربونات الصوديوم القاعدية. وبذلك ترتفع درجة الPH للوسط مما يؤدي إلى تغير لون الكاشف )الموجود ضمن مكونات الوسط( الوسط: Bromothymol Blue Simmons Citrate Agar من األخضر إلى األزرق. التعادل. هذا الوسط هو الوحيد ضمن اوساط اختبا ارت ضمن مكونات الوسط. اسم الدليل داخل الوسط هو وهو وسط صلب مائل اخضر في حالة IMViC Bromothymol Blue Indicator الذي يحتوي على الكاشف الذي يكون لونه اخضر في الوسط المتعادل ازرق بالقاعدي اصفر بالحامضي. النتيجة الموجبة: تحول لون الوسط من االخضر إلى اللون االزرق كما في بكتريا.Enterobacter aerogenes النتيجة السالبة: يبقى لون الوسط أخضر كما في حالة بكتريا Escherichia coli شكل )61( و شكل )61(. ويبين الشكل )62( ملخص الختبا ارت. IMViC 69

70 اختبار تخمر السكريات Sugar Fermentation يعتبر هذا االختبار من االختبا ارت الهامة في تشخيص وتميز االنواع البكتيرية. يعرف التخمر بانه عبارة عن تفاعالت بايوكيمياوية ينتج عنها طاقة. البكتريا على تخمير السكريات ونوع المركبات الناتجة عن هذ العملية البكتريا. الطريقين: التنفس 1- وان قدرة مفيد جدا في تشخيص االحياء المجهرية التي تستخدم المركبات العضوية كمصدر لطاقة قد تلجأ إلى احد :Respiration -2 أ- ب- ينتج عنها ثنائي اوكسيد التخمر وهي عملية استهالك كلي )اكسدة( للمصدر العضوي الكاربون الكاربون وماء. وتتم تحت ظروف هوائية. :Fermentation وهي عملية )التحتاج إلى اوكسجين تتباين النواتج النهائية حسب نوع البكتريا مختلفة اذ ثنائي اوكسيد الكاربون وهيدروجين تنتج حوامض وميثان. الهوائية( تخمر جزئي كحوالت غا ازت الديهايد السكريات وخاصة الكلوكوز هي من المركبات االكثر شيوعا التي تستخدمها االحياء المجهرية المخمرة اضافة إلى مواد اخرى مثل الحوامض العضوية االحماض االمينية.ال. ومن الجدير بالذكر ان استهالك احد السكريات يتطلب مجموعة من االنزيمات انزيمات خارجية: انتجتها. : :)exoenzymes( انزيمات داخلية :)endoenzymes( كال النوعين يعمالن كعا حسب نوع السكريات. على االنتشار عبر غشاء الخلية وهي التي تعمل خارج الخلية التي وهي التي تعمل داخل الخلية. في حين السكريات االحادية قادرة الوحدات االكبر مثل السكريات الثنائية أو المتعددة تتطلب انزيمات خارجية لتكسيرها إلى وحدات اصغر أو انزيمات قاجرة على نقلها عبر الغشاء إلى داخل الخلية )permeases( بعد دخولها إلى الخلية تتعرض إلى انزيمات داخلية تحولها إلى وحدات اصغر. طريقة العمل: -1 تحضر اوساط زرعية سائلة Ex: Phenol Red Carbohydrate Broth نوع واحد من السكريات مثل الكلوكوز )سكر احادي( السكروز )سكريات ثنائية( نشا وكاليكوجين )سكريات واكار متعددة(. المالتوز تحتوي على الالكتوز 71

71 م 2- يجب ان يحتوي الوسط على دليل الفينول االحمر للكشف عن تخمر السكر حيث يعطي في الوسط الحامضي اللون االصفر وفي الوسط القاعدي اللون الوردي وفي المتعادل اللون االحمر. 3- للكشف عن انتاج الغا ازت يضاف إلى الوسط انبوب درهام مقلوب قبل التعقيم. وهو عبارة عن انبوبة صغيرة تعمل على: Durham Tube بشكل أ- توفير ظروف الهوائية بداخلها. ب- لحصر الغا ازت الناتجة عن التخمر كما هو مبين في الشكل )63( وشكل. )64(. 4- تلقح هذ االنابيب لمدة 24 ساعة وبدرجة ح اررة 37 * عند تحضير وسط السكريات يعقم الوسط السائل )قبل توزيعه على االنابيب واضافة )Durham Tube بالموصدة بدرجة ح اررة 121 م لمدة 15 دقيقة. اما محلول السكر فيعقم بطريقة الترشيح ثم يضاف الى الوسط المغذي السائل. يتم توزيع فيما بعد على االنابيب وبداخل انابيب درهام معقمة. 71

72 اختبار :)TSI(Triple Sugar Iron Agar اختبار مهم جدا يفرق بين اجناس البكتريا المعوية. اسم االختبار يدل على اسم شكل )65(. الوسط أي االكار الحاوي على 3 انواع من السكريات. %1 %1 يحتوي هذا الوسط على % 1.1 سكر الدكستروز )الكلوكوز( سكروز الكتوز اضافة الى مركب كبريتات الحديدوز وكاشف الفينول االحمر اضافة الى ان الوسط غني بالفيتامينات. يكون هذا الوسط على شكل مائل )Slant( يتم تلقيحه على شكل طعنه تتبع بتخطيط السطح المائل. يستخدم للكشف عن االختبا ارت التالية: تخمر السكريات: الحظ ان هذا الوسط يحتوي على نسب معينة من 3 سكريات كما -1 مبين اعال. خالل الساعات االولى من التحضين تبدأ البكتريا المخمرة للكلوكوز بخفض ال للوسط إلى اقل من نتيجة لذلك يتحول لون الوسط وبسبب احتوائه على 6.8 PH الدليل الفينول االحمر إلى اللون االصفر. وفي حالة كون البكتريا مخمرة للكلوكوز فقط يصبح الوسط المائل اصفر بالقاعدة )Butt( واحمر على السطح المائل نتيجة لتعرضه للهواء مما يؤدي إلى اكسدة الببتون الموجود في الوسط وتكوين امينات قاعدية لتعادل كمية الحامض المنتج سابقا ثم تحويله إلى القاعدي بعد 24 ساعة حضانة. اما إذا كانت البكتريا لها انزيمات خاصة بتخمير السكريات الالكتوز أو السكروز أو كالهما ستقوم بمهاجمة هذ السكريات بعد نفاذ الكلوكوز لذلك يصبح الوسط كله )المائل والقاعدة( اصفر. الكشف عن الغا ازت: البكتريا التي تحرر كميات كبيرة من غاز ثنائي اوكسيد الكاربون -2 تكون فقاعات هوائية في الوسط ممكن مالحظتها على اسفل أو جانبي الوسط بل قد تؤدي إلى تشقق االكار أو اندفاعه إلى االعلى في حالة انتاج البكتريا بكميات هائلة من الغا ازت. 3- الكشف عن غاز كبريتيد الهيدروجين: بعض البكتريا لها القدرة على تحرير غاز كبريتيد الهيدروجين الذي يتفاعل بدور مع كبريتات الحديدوز )في الوسط( لينتج ارسب H2S اسود اسفل االنبوبة شكل )66(. FeSO4 + H2 + S FeS + SO3 + H2O ارسب اسود الكشف عن انتاج االنزيم المحلل للج تين Gelatinase 72

73 م م الجيالتين هو بروتين ناتج عن التحلل الجزئي للكوالجين )وذلك بغلي الكوالجين وهو احد انواع االنسجة ال اربطة( في الماء يتحول إلى خليط ذائب من الببتيدات المتعددة )الجالتين(. عند تحلل البروتين بواسطة انزيم Gelastinase إلى الحوامض االمينية بذلك يفقد خاصيته الغروية أي يتحول إلى السيولة ويبقى بهذا الشكل حتى بعد التبريد. الحوامض االمينية الناتجة تستخدم من قبل بعض البكتريا كمادة غذائية هذا االنزيم احيانا يكون فعال بدرجة ح اررة 22 بدال من 37. تستطيع بعض االحياء المجهرية الدقيقة ان تحلله بانتاج انزيم خارجي حال للبروتينات Enzyme( )Proteolytic يدعى Gelatinase انتاج هذا االنزيم احيانا يرتبط بام ارضية البكتريا حيث تستخدمه لتحطيم االنسجة ال اربطة )الكوالجين( وبالتالي تنتشر في جسم المضيف. المواد: -1 مزرعة سائلة لبكتريا. Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis 2- وسط الجيالتين المغذي )انابيب(. طريقة العمل: 1- تلقح االنابيب بالبكتريا بطريقة الوخز او الطعن )باستخدام االبرة(. 2- تحضر االنابيب بدرجة ح اررة 35 م لمدة ساعة. 3- توضع االنابيب في الثالجة لمدة نصف ساعة أو في ماء مثلج لمدة 5 دقائق. 4- امسك االنابيب بحذر بشكل مائل ثم الحظ سطح الوسط إذا كان على شكل سائل يعتبر االختبار موجب اما إذا بقي الوسط بشكل صلب اسوة بانبوية السيطرة )وسط غير ملقح( يعتبر االختبار سالب شكل )67(. 73

74 الكشف عن انزيم االوكسيديز تلعب أنزيمات ال Oxidase Test Oxidase دو ار هاما في عملية نقل اإللكترونات خالل التنفس Cytochrome إن أنزيم الهوائي. Cytochrome Oxidase يسرع عملية أكسدة )المختزل( H2O2 بوساطة األوكسجين الجزيئي )O2( لينتج عن هذ العملية تكوين H2o أو أي أن البكتريا التي تمتلك أنزيم Cytochrome Oxidase هي موجبة لالختبار. البكتريا الهوائية والالهوائية االختيارية المحبة للكميات القليلة من الهواء Microaerophilic تكون منتجة Neisseria Pseudomonas النزيم.Oxidase يستخدم هذا االختبار في تمييز جنسي و الموجبة لالختبار عن أف ارد العائلة المعوية السالبة له. Cytochromeوالذي C اذا أنزيم Cytochrome Oxidease يؤدي إلى أكسدة مادة N, N, N, N tetramethyl-p-phenyldiamine ( بدور يؤكسد 1% مادة: من التي تستخدم ككاشف لهذا االختبار. )dihydrochloride الكاشف أعال عبارة عن صبغة وردية اللون )في حالة االخت ازل( وتتأكسد لتعطي اللون البنفسجي )في حالة التأكسد( بوجود أنزيم ال Oxidase واألوكسجين. إلج ارء هذا االختبار تنمى البكتريا على وسط صلب مثل Tryptic Soy Agar ساعة ثم تنقل مستعمرة واحدة على ورقة ترشيح مشبعة بمادة الكاشف )TSA( لمدة 24 بوساطة عيدان خشبية. الكشف الموجب هو تحول لون الورقة من الوردي الفاتح إلى غامق إلى اللون األسود خالل )11-31( ثانية شكل )68(. 74

75 م اختبار انتزاع مجموعة االمين من الحامض االميني الفني لنيين Phenylalanine Deamination وهو اختبار للتحري عن البكتريا المنتجة النزيم الذي يزيل مجموعة االمين من الحامض أهمية االختبار: هناك االميني Phenylalanine Deaminase.Phenylalanine 3 اجناس من الكتريا المنتجة لهذا االنزيم وهي Proteus, Morganella,.Providencia هذ الخاصية تستخدم البكتريا المعوية. ميكانيكية االختبار: لتسهيل تشخيص هذ االجناس وتمييزها عن بقية اجناس NH 2 CH 2 CHCOOH Phenylalanase eeeeeeeee CH 2 CHCOOH + NH 3 Phenylpyruvic Acid عند ا ازلة مجموعة االمين من الحامض االميني Phenylaninie Phenylaphyruvic Acid الوسط المستخدم: واالمونيا. Phenylalnine agar ينتج حامض وهو عبارة عن وسط صلب بشكل مائل حيث تلقح البكتريا بالتخطيط على السطح المائل ثم يحضن بدرجة اسم الكاشف: 24 لمدة 37 %11 Ferric Chloride والذي يتكون من: Ferric Chloride (anhydrous) Distilled water ساعة. بعد فترة التحضين يتم الكشف باضافة 11 غم سم 11-5 التفاعل ممكن استخدام اللوب لمزج البكتريا مع المحلول. النتيجة الموجبة ظهور اللون االخضر الداكن خالل قطرة على سطح المائل. 5 1 دقائق الشكل )62 لتسريع.) 75

76 اختبار إلى نتريت اختزال النترات Nitrate Reduction Test الغرض من هذا االختبار هو للكشف عن قابلية البكتريا على اخت ازل النت ارت NO2 والذي بدور يختزل إلى NO3 N2.Reductases بعض انواع البكتريا الالهوائية االختيارية يختزل )يضيف الكترون أو يزيل اوكسجين( من ت ارت. بواسطة بعض االنزيمات المعروفة ب Facultative Anaerobic بواسطة هذا االنزيم تنتج انزيم تستطيع البكتريا االستعاضة بالنت ارت بدال من االوكسجين كمستلم نهائي لاللكترونات في عملية التنفس. NO3 + 2e + 2H NO2 + H2O وبذلك تستطيع العديد من البكتريا الالهوائية االختيارية استخدام النتروجين في النت ارت للتنفس الالهوائي. االخرى مثل بعض انواع ال إن معظم البكتريا المعوية تختزل النت ارت إلى نتريت Pseudomonas بينما بعض االنواع تتسطيع اكمال التفاعل إلى غاز النتروجين. No2 + N2 No3 وهذ االنواع هي هوائية مجبرة اال انها تستطيع ان تقاوم الظروف الالهوائية باالستعانة بأيون البنائية NO3 24 بدل من االوكسجين كمستلم لاللكترونات لتحرير الطاقة لعمليات ساعة حضانة يضاف الكاشف: Nitrate reductase 1 غم 1.6 غم سم سم حامض الخليك :Reagent A Sulfanilic Acid Acetic acid, 5m :Reagent B N, N- dimethyl - 1- كاشف أ حامض السلفانيليك حامض الخليك 5 ع 2- الكاشف ب α - naphthylamine 5 عياري Acetic Acid 5m 5m acetic acid is prepared by adding 1 part of glacial acetic to 2.5 parts distilled water. Reagents A, B can be stored at 22c for 1 year. يحضر حامض الخليك 76 5 جزئين ونصف من الماء المقطر. الكواشف سنة. عياري باضافة جزء من حامض الخليك الثلجي الى A,B يمكن ان تحفظ بدرجة ح اررة م لمدة 22

77 م غبار الزنك: Zinc Dust لتحديد ان كانت النت ارت ال ازلت موجودة. -3 طريقة اج ارء الكشف: الوسط المستخدم: Nitrate broth 1- بعد حضانة الوسط بدرجة ح اررة 37 من Zinc Dust.A, B 2- يضاف قليل من خطوة )1(. 3- هناك ثالث احتماالت: أ- لون احمر بعد اضافة A, B لمدة ساعة يضاف 3 قط ارت من كل غبار الزنك في حالة عدم تكوين اللون االحمر في = اخت ازل ب- عدم تكون اللون االحمر بعد اضافة ج- تكوين اللون االحمر بعد )أي ان.)71( NO3 NO2 و A, B zinc powder = اخت ازل N2 NO3 NO2 zinc dust B, A غبار الزنك = لم يختزل ال NO3 zinc dust يكشف عن وجود NO3, A, B تكشف عن شكل )NO2 77

78 م اختبار انزيم اليوريز Urease enzyme هو اختبار للتحري عن انزيم اليوريز الذي تنتجه بعض البكتريا مثل Klebsiella وهو مهم في تشخيص هذين الجنسين وتميزها عن اف ارد, Proteus Helicobacter pylori البكتريا المعوية االخرى. تنتج هذا االنزيم ايضا بكتريا حيث تستخدمه لمقاومة حموضة المعدة اذ يقوم هذا االنزيم بتكسير جزيئات اليوريا )الناتجة من عملية هدم البروتينات من قبل خاليا الجسم( وهي تتواجد بصورة طبيعية في عصا ارت CO2 المعدة. ينتج عن تكسير اليوريا الى امونيا و وبذلك تستطيع هذ البكتريا معادلة حموضة المعدة لتتمكن من النمو واحداث االصابة. اسم الوسط: Christensen's media الذي يحتوي على مستخلص الخميرة و االكار وكاشف الفينول االحمر. باالضافة الى مواد غذائية اخرى. يعقم هذا الوسط بالموصد 15 بدرجة 121 دقيقة. لمدة ثم يحضر محلول اليوريا المعقم الى الوسط السابق ثم يوزع على انابيب ويبرد بشكل مائل.)Slant( الكشف الموجب تحول لون السطح المائل من االصفر الغامق الى اللون الوردي نتيجة لتفكك اليوريا لتعطي االمونيا وغاز ثاني اوكسيد الكاربون مما يؤدي الى ارتفاع الPH. كما هو مبين في )الشكل 71( 78

79 الكشف عن انزيم الكاتاليز يستخدم لتمييز العنقوديات :Catalase Test Staphylococcus )التي تعطي اختبار موجب( عن المسبحيات والتي تعطي نتيجة سالبة له. ان انزيم Catalase يحلل Streptococci بيروكسيد الهيدروجين إلى ماء واوكسجين )غاز( حسب المعادلة التالية: 2H2O Catalase 2H2O + O2 وجود هذا االنزيم مهم جدا للنمو الهوائي النه يمنع ت اركم المواد السامة التي قد تقتل البكتريا. طريقة االختبار: 1 -تنمى البكتريا على وسط مغذي صلب Agar(.)Nutrient 2- ينقل جزء من هذا النمو بواسطة عيدان خشبية إلى شريحة زجاجية نظيفة. تضاف قطرة من كاشف H2O2 )بيروكسيد الهيدروجين(. %3-3 الكشف الموجب: ظهور فقاعات نتيجة لتحرر غاز االوكسجين )كما هو مبين في.) الشكل 72 مالحظة: اليمكن استخدام وسط اكار الدم في هذا االختبار وذلك الن كريات الدم الحمر تحتوي على انزيم Catalase وبالتالي فقد تعطي اختبار موجب كاذب. 79

80 م اختبار انزيم التجلط من اهم يعد : Coagulase test االختبا ارت لتشخيص العنقوديات الذهبية ومن الجدير بالذكر ان اليعتبر من االنزيمات. وانما بروتين تنتجه البكتريا coagulase. يتفاعل هذا البروتين مع مادة موجودة في الدم تدعى Staphylococcus aureus بوثرومبين المعقد الناتج من هذا التفاعل يدعى staphylothrombin والذي يؤدي إلى تخثر الدم وذلك بتحويل الفايبرينوجين إلى فايبرين. احيانا يرتبط هذا البروتين بشدة على سطح البكتريا ويغطي السطح بالليفن عند تماسه مع الدم. العنقوديات لمغلفة بالليفين عادة تكون مقاومة لعملية االلتهام.Phagocytosis بشكل عام تمتلك العنقوديات ما يسمى الذهبية والذي يطلق عليه احيانا Coagulase " " Slide الذي يكشف عنه Clumping Factor بمالحظة تكتل البكتريا عند اضافة قطرة من بالزما الدم على الشريحة ومزجها مع قطرة من معلق البكتيريا. نا تكتل الخاليا ينتج عن بروتين مثبت على الخاليا ويلتصق مع الفايبرينوجين في البالزما. هذا البروتين يعتبر من عوامل الض اروة لبكتريا بسب ارتباطه مع مولد الليفين والليفين الموجود في الجروح Staphylococcus aureus مما يساعد على تجمع البكتريا على الجروح. طريقة اج ارء االختبار: سم تؤخذ انبوبة معقمة يوضع في االنبوبة من مزروع سائل للعنقوديات الذهبية مع سم من بالزما دم االرنب او االنسانPlasma Citrated Human Or Rabbit. توضع االنبوبة في حمام مائي بدرجة 37 لمدة من 24 ساعة تفحص خالل هذ 4 الفترة إذا كان الكشف موجب تتخثر بالزما الدم الكشف السالب عدم وجود تخثر Clotشكل )73(. مالحظة مهمة جدا: Blood = blood fluid (serum + plasma) + RBC + WBC + Platelets Plasma = blood - )RBC + WBC + Platelets( Serum =Blood (fibrinogen + cellular components). لتحضير البالزما: 1- يسحب دم من االرنب أو االنسان يوضع في انبوبة معقمة تحتوي على مادة مانعة لتخثر )Anti-Coagulant( مثل: K- Oxalate or sodium citrate or heparin 3 1 سم 3 لكل 12 سم من الدم يضاف من اوك ازالت %2 الصوديوم أو 81

81 البوتاسيوم. للتخلص من الكريات يرسب الدم بعملية الطرد المركزي بسرعة 1111 دورة/دقيقة لمدة 15 دقيقة ستترسب عند هذ السرعة المكونات الخلوية ليبقى في االعلى سائل اصفر ارئق هو البالزما الحاوي على الفايبرينوجين. لتحضير المصل Serum يسحب الدم ويوضع في انبوبة عريضة معقمة. تترك االنبوبة بدرجة ح اررة الغرفة لمدة 15 دقيقة ليتخثر الدم. وبذلك نتخلص من الفايبرينوجين والمكونات الخلوية. بواسطة عيدان خشبية معقمة تفصل وبحذر شديد الخثرة عن جدار االنبوبة ليطفو سائل ارئق عديم اللون إلى اعلى االنبوبة يدعى المصل. 81

82 م homopolysaccharide اختبار تحلل النشا يعتبر النشا من السكريات المتعددة من نوع حيث يتكون من وحدات متكررة من الفا D-Glucose احد الكشوفات النوعية للكشف عن النشا هو ظهور اللون االزرق عند اضافة محلول اليود الى الوسط الحاوي على النشا. بعض االحياء المجهرية لها القدرة على تحليل النشا عن طريق اف ارز انزيم خارجي يدعى Amylase ينتج عن عملية التحلل الدكسترين وهو C12H22O11 سكر متعدد )C6 H10 O5 )n و المالتوز وهو سكر ثنائي والسكر االحادي.C6H12 الكلولكوز O6 هذ النواتج ال تعطي اللون االزرق مع اليود. وبما ان انتاج االميليز يقتصر على بعض انواع البكتريا لذا يعتبر احد االختبا ارت التشخيصية لالنواع المنتجة له Starch amylase amylose + amylopectin C6H10O5 (blue with I) (bluish red or red brown).. شكل )74( Amylopectin amylase dextrins amylase maltose (disaccharidemaltose) amylase glucose Colorless with iodine طريقة العمل: 1- بواسطة اللوب ينقل مستعم ارت من البكتريا لتلقح في وسط طبق يحتوي على وسط اكار النشا. 37 تحضن لمدة 48 ساعة في يغمر الطبق بمحلول اليود lugol iodine 4- ان ظهور: منطقة ارئقة النتيجة موجبة. منطقة زرقاء منطقة قهوائية سالبة )لم يتحلل النشا( تحلل جزئي. 82

83 اختبار حساسية البكتريا للمضادات المقدمة: الحياتية Antibiotic Sensivity Test (Kirby- Bauer Method) :Antibiotic مركب ينتج طبيعيا من قبل بعض الفطريات Cephalosporium( )Penicillium اوالبكتريا مثل مثبط او قاتل على احياء مجهرية اخرى. موجودة في التربة. ما اسما اول من درس تأثير العقار على االحياء المجهرية هو Bacillus & Streptomyces له تأثير معظم المضادات الحديثة تعزل من احياء مجهرية Paul Ehrlich "Magic bullet" لغرض ايجاد وهو مصطلح اطلقه على العقار الفعال ضد الميكروب دون احداث أي ضرر على خاليا المضيف بعد اج ارء تجاربه على لمعالجة داء 606 syphilis )تسببه )Treponema pallidum الذي اسما كانت بداية استخدام العقاقير اكتشف بعدها مضادات وفي عام مركب توصل الى عقار salvarsan sulfanilamide 1228 اكتشف البنسلين من قبل العالم للحصول على كميات كبيرة منه استخدم في عام Flemming ومن هنا )مادة كيمياوية(. ولكنه لم يتمكن من تنقيته 1241 ضد المكو ارت العنقودية. الحرب الثانية بدأ التعاون النتاجه بكميات كبيرة ليستخدم كعالج لجرحى الحرب. وفيما يلي بعض المصطلحات الهامة في علم المضادات الحياتية: :Bacteriastatic * وبعد مضادات تثبط نمو البكتريا لحين يتسنى للجسم التخلص من الميكروبات باحد وسائل الدفاع الطبيعية مثل االد ارر.. :bactericidal * :Broad- spectrum * مضادات قاتلة للبكتريا ال تعتمد على وسائل الجسم الدفاعية. مضادات فعالة ضد مدى واسع من االحياء المجهرية قد يشمل G-,G+ وهي ضرورية لعالج الحاالت او االصابات الحادة التي تهدد حياة المريض والحاالت الضرورية جدا والتي تستدعي العالج السريع لكسب الوقت. من مساويء استخدام المضادات بشكل عشوائي هي انها تؤدي الى اختالل في توزيع الفلو ار الطبيعية )والتي تلعب دو ار هاما في ابعاد االحياء الممرضة(. عند تغير تركيبة هذ الفلو ار تصبح االحياء الممرضة قادرة على النمو والتكاثر دون ان تنافسها احياء اخرى مثال بكتريا Clostridium difficile مما يؤدي الى حدوث بقع تسمى )وهي بكتريا ال هوائية تنتج سموم قاتلة لخاليا االمعاء.)pseudomembranes 83

84 اما البكتريا فهي االخرى تحاول ان تجد طرق للدفاع عن نفسها من تاثير المضادات وذلك باف ارز انزيم يكسر حلقة ال ل B-lactam الموجود في تركيب البنسلين او بعض انواع البكتريا قد تفقد الجدار الخلوي وبذلك تقاوم البنسلين )الذي يمنع عملية بناء الجدار( واخي ار فان البكتريا السالبة لصبغة ك ارم تقاوم البنسلين من خالل جدار الخلية ثنائي الطبقات يحتوي على دهون تمنع دخول المضاد. ان تأثير المضادات الحيوية بصورة عامة يكون باحد الطرق التالية: 1- يؤثر على عملية بناء الجدار الخلوي مثل البنسلين..streptomycin, tetracycline Rifamycin 2- يؤثر على بناء البروتينات مثل 3- يؤثر على بناء االحماض النووية مثل طريقة العمل: اتبع المخطط في الشكل) 75 ( هو المستخدم لعالج السل. 84

85 م م اختبار االختزال Reductase test من المعروف ان الحليب الذي يحتوي على بكتريا حية ونشيطة النمو يكون جهد االكسدة-االخت ازل فيه واطىء نتيجة الستنفاذ االوكسجين المذاب من قبل البكتريا. ان اساس هذا االختبار يعتمد على ان صبغة المثيلين االزرق تفقد لونها ( تختزل( في هكذا بيئة. في هذا االختبار تخلط صبغة المثيلين االزرق مع الحليب وتحضن بدرجة ح اررة وتفحص بفت ارت زمنية خالل 6 ساعات. يدعى الوقت الالزم لفقدان الصبغة 35 كلما كانت MBRT(.)Methylene Blue Reduction Time هذ القيمة اكبر ) 6 ساعات( كانت جودة الحليب اكثر. ان قيمة هذا االختبار تعتمد على افت ارض ان كل البكتريا الموجودة في الحليب 35 تساهم في خفض جهد االكسدة- االخت ازل بدرجة ح اررة م. اما البكتريا المحبة للح اررة والبرودة والتي ال تنمو بهذ الدرجة لن تعطي نتيجة موجبة في هذا االختبار. فالحليب الخام Streptococcus lactis, سيحتوي بالدرجة االولى على بكتريا Escherichia coli وكالهما من البكتريا المختزلة و لذلك يعتبر االختبار ضروري وذو فائدة لتقييم الحليب الخام في محطات االستالم. طريقة العمل: شكل )76( ) 1:25111 يضاف 3 1 سم من صبغة المثيلين االزرق )بتركيز الى انبوبة تحتوي -1 3 سم على 11 من الحليب. تغلق االنبوبة بسداد مطاط 3 وتقلب بحذر م ارت وبحذر لخلط الحليب مع الصبغة توضع االنابيب في حمام مائي بدرجة 35 ح اررة تفحص باستم ارر خالل فترة -3 ساعات. تقدر جودة الحليب من الوقت الالزم الخت ازل الصبغة من اللون االزرق الى عديم اللون. كلما كان الوقت اطول كان الحليب اكثر جودة. 85

86 تقدير كفاءة المطهرات Evaluation of disinfectants 1811 تصنيع A-Phenol coefficient B- Filter paper method C- use- dilution method بدأ استخدام المواد الكيميائية في السيطرة على نمو االحياء المجهرية منذ بداية عام حيث تم استخدام محاليل اليود لمعالجة الجروح و مادة كيمائية مضادة لالحياء اليدين قبل الج ارحة. اليوم يتم منها فقط يستخدم الغ ارض صحية في المنازل والمستشفيات هذ المواد قد تكون غازية او سائلة او حتى بشكل صلب. كفاءة هناك بعض المواصفات التي يجب توفرها عند ايجاد المادة الكيميائية المناسبة وهي: عالية حتى في الت اركيز القليلة. قابلية المادة على الذوبان في الماء الكحول وثبات المحاليل لفت ارت زمنية طويلة. قدرة المطه ارت على القضاء على مدى واسع من االحياء المجهرية دون ان تؤثر على االنسجة الحية. قدرة اخت ارق المواد الصلبة. ال تتأثر فاعليتها بوجود مواد عضوية. ال تسبب تآكل او تصبيغ االسطح. غير مكلفة و سهولة الحصول عليها. المجهرية: بصورة عامة هناك 3 القوية: 1- High level التي تقتل السبو ارت واذا مستويات للمواد القاتلة للج ارثيم اعتمادا على االحياء )%37( مثل الفورمالديهايد استخدمت بشكل صحيح تقتل كل انواع الحياة )التعقيم( وهذا النوع ضروري في تعقيم االجهزة و المواد الطبية مثل اجهزة القلب و الرئة و الزرع النسيجي التي ال تعقم بالح اررة. الوسط 2- :Intermediate -3 عصيات السل و الفايروسات. المطه ارت الضعيفة الفايروسات. التي تقتل السبو ارت الفطرية و بعض البكتريا الممرضة مثل :Weak Level من الطرق الشائعة لتقييم كفاءة المطه ارت: تقتل فقط البكتريا و الفطريات الخضرية و بعض 86

87 م 1- coefficient : phenol اعتمد لسنوات طويلة وهو فحص لمقارنة كفاءة مطهر ما مع الفينول. 2- طريقة اق ارص ورق الترشيح: وهي تستخدم في مختب ارت التدريس لتقييم كفاءة المطهر. وهي تعتمد على ظهور منطقة تثبيط حول القرص الحاوي على المادة الكيميائية المضادة. 3- طريقة استعمال التخافيف :Use dilution method تستخدم احيانا كبديل للطريقة االولى. للمطه ارت التي تختلف كليا عن الفينول والتي ال يمكن تطبيق الطريقة االولى في تقييمها. الكثير من المطه ارت الممتازة ال يمكن تقييمها بالطريقة االولي النها ال تشابه الفينول في خواصه المضادة او القاتلة للج ارثيم مثل اليود او المنظفات. في هذ الحالة تجرى الطريقة الثالثة وهي طريقة استعمال quaternary detergents التخافيف طريقة العمل:. Staphylococcus aureus Use dilution method 1- ضع الدبابيس في انبوبة تحتوي مزروع سائل البكتريا 2- تخلص من المزروع البكتيري بصبه في بيكر يحتوي على مادة مطهرة ثم يعقم )يهمل( اما الدبابيس توضع في اطباق بتري معقمة تحتوي على ورق ترشيح و تترك 1\2 ساعة لتجف. 3- بواسطة ملقط معقم )بالتلهيب الكحولي( يؤخذ احد الدبابيس ليوضع في كل مطهر )مطهر واحد لكل الشعبة و محضر حسب تعليمات الشركة( و لكن فت ارت زمنية مختلفة. 4- بعد انتهاء كل فترة تخلص )كل مجموعة( من المطهر الحاوي على الدبابيس الملونة)بصبه في بيكر مطهر(. ثم تنقل الدبابيس الى انبوبة تحتوي على ماء معقم)احذر من بقايا مطهر(. 5- تترك لمدة 1 دقيقة في الماء لمعادلة تأثير المطهر. 6- ثم تخلص من الماء وضع الدبابيس في انبوبة تحتوي على وسط زرعي سائل معقم. 7- يجب عمل سيطرة وذلك بنقل احد الدبابيس الملونة ببكتريا Staphylococcus aureus الى وسط سائل معقم )دون معاملتها بالمطهر(.. 8- تحضن جميع االنابيب لمدة ساعة بدرجة 37 يتم فحص االنابيب الخالية من النمو لتحديد المطهر المناسب والوقت الالزم لقتل البكتريا. )شكل 77( 87

88 تشخيص البكتريا باألنظمة التجارية السريعة Bacterial Identification Using Rapid MuIti-test CommerciaI Systems العديد من الطرق واالج ارءات العملية ممكن ان تستخدم الغ ارض التشخيص منها: طرق التصبيغ د ارسة المظهر الخارجي للمستعمرة الحركة والعديد من التفاعالت االنزيمة 88 والبايوكيمياوية ان د ارسة كل هذ الخواص تتطلب كميات كبيرة مكن االوساط الز ارعية انابيب االختبار االطباق الز ارعية اضافة إلى الفترة الزمنية الالزمة لد ارسة هذ الخواص. لتالفي هذ العوامل تم ابتكار العديد من االنظمة السريعة لتشخيص البكتريا الممرضة والتي تعزل باستم ارر في المختب ارت الطبية تشخيصا دقيقا وخالل فترة قصيرة جدا. من اهم هذه االنظمة الشكل النهائي للنتائج ( Enterotube II API 20E minitek )Pattern التي يتم الحصول عليها تحول إلى شفرة رقمية لتستخدم فيما بعد لمطابقتها مع بنك المعلومات الذي يحتوي على نتائج االختبا ارت لبكتريا معلومة ومشخصة )قياسية( بعض من هذ االنظمة قد يعطي العديد من االحتماالت )للنتائج( التي تساعد في تشخيص النمط الحياتي biotype( على شكل مجموعة من االنابيب التي تتكون من جزئين ال (.جميع هذ االنظمة تتوفر cupuie وهو الجزء المنخفض والذي يتصل بأنبوبة رفيعة تحتوي على االوساط الز ارعية )المجففة( ويدعى باالنبوبة التي تحتوي على االوساط الخاصة لالختبا ارت الروتينية وتختلف فيما بينها بعدد االختبا ارت البايوكيماوية. وبصورة عامة تشخيص النوع يتطلب أقل من الجديدة للتشخيص العديد من الم ازيا وهي: أقتصادية من ناحية االوساط الز ارعية. سهولة العمل. الدقة في التشخيص. سريعة. نتائج منتظمة وكاملة. هذ اختبار. ان لهذ االنظمة الم ازيا ساعدت في انتشار واسع في استخدامها خاصة في المختب ارتالطبية. وبالرغم من ذلك فأن الطرق الروتينية قد ال يستغنى عنها خاصة عند الحاجة إلى تأكيد بعض االختبا ارت المشكوك في نتائجها إضافة إلى ان االنظمة السريعة قد صممت لتشخيص األجناس البكتيرية ذات االهمية الطبية فقط وليس النواع بكتيرية مثل البكتريا الرمية في التربة والميا مثال: API 20E

89 ال وهو نظام لتشخيص اف ارد العائلة المعوية وبعض االنواع االخرممن العصيات السالبة لصبغة ك ارم التي التحتاج إلى متطلبات غذائية خاصة. API 20E عبارة عن شريط يحتوي على االساس ( الوسط الخاص لالختبار ) المجففة. اختبار ال 20 Oxidase أي هو االختبار رقم تحضير الشريط: ضع أنبوبة صغيرة بداخلها المادة وقبل البدء باعداد هذا الشريط يجب اج ارء على العزلة قيد التشخيص يعتبر هذا االختبار جزء من المجموعة يجب عزل البكتريا )المجهولة( على وسط ماكونكي. ³ سم -3-4 ماء مقطر في االناء المسطح تحت شريط االنيبيبات ( لتوفير الرطوبة وبالتالي النعاش نمو البكتريا (. سجل رقم العزلة على أحد الجهات. اثناء ق ارءة النتائج. أفتح امبولة احذر من كتابة الرقم على الغطاء خشية استبداله SaIine ( 0.85% NaCI ) or Suspension media -5 انقل مستعمرة معزولة وامزجها جيدا مع المحلول السابق بأستخدام ماصة لتحضير عالق البكتريا. سم ³. بمقدار 5 باستور معقمة بنفس الماصة انقل عالق البكتريا إلى كل من االختبا ارت المشار اليها في التعليات وذلك بمالمسة الماصة على حافة ال cupuie إلى جزء االنبوبة الحاوي على الوسط الز ارعي. لكي يدخل العالق بالخاصية الشعرية يرجى االنتبا إلى ان بعض االختبا ارت تتطلب توفير ظروف الهوانية ويتم ذلك باضافة طبقة من الزيت المعقم بعد التلقيح بالبكتريا. يوضح الشريط في الصندوق الخاص به ليحضن بدرجة ساعة اضف الكواشف التالية: لمدة م 37 قطرة واحدة من كاشف كوفاكس إلى انبوبة قطرة من كاشف باريت قطرة من كاشف IND A and B to VP وأق أر النتيجة خالل دقائق. النتيجة قد تستغرق 10.FeCI3 to TDA اق أر نتائج بقية االختبا ارت بدون اضافة أي كاشف. دق

90 سجل النتائج الموجبة والسالبة مع اعطاء القيم المقابلة لها )1 و 2 و 4 للموجب أو للسالب(. 0 نق أر النتائج التي ال تحتاج إلى كواشف وتسجل ( + أو - ) ثم تضاف كواشف االندول phenyiaianine VP and )قطرة واحدة من كل كاشف (. أفحص تخمر الكلوكوز وانتاج الغاز. الفقاعات دليل على اخت ازل النت ارت وتحرير غاز النتروجين. اضف كاشف النت ارت إلى انبوبة الكلوكوز الكشف الموجب هو ظهور اللون االحمر دق. خالل 3-2 سجل النتائج )+ أو - ) لكل االختبا ارت زمن ثم اعطي القيمة الرقمية لكل نتيجة حسب التعليمات. اجمع القيمة لكل ثالثة اختبا ارت لتحصل على رقم نهائي يتكون من م ارتب. يقارن 7 الرقم النهائي مع دليل العزالت الخاص بالنظام ليعطيك االسم العلمي الكامل للعزلة المجهولة كما مبين في الشكل )78(

91 المصادر References Foundations in Microbiology, by Kathleen Talaro and Arthur Talaro Fundamentals of Microbiology. Martin Forbisher, ninth edition Laboratory Exercices in Microbiology, John P. harley, and Lancing M. Prescott. Third edition Microbiological Applications, Lab manual in general microbiology. Harold Benson. eighth edition Microbiological experiments: A Health science Perspective, Third edition. Microbiology, a human perspective. Eugene W. Nester, Microbiology. Lab Exercises. Margaret Bamett, Second edition Microbiology: A Laboratory Manual. James G. cappocino Microbiology, Dynamics and diversity. Jerome J. Perry, Microbiology, Lancing M. Prescott Principles of microbiology, by Ronald M. Atlas. First edition,

92 [ ] ( ) [ ]

93 [ ]. ( ). ( ) [ ]

94 [ ] ( ) [ ]

95 [ ] [ ]

96 [ ]. : ( ) [ ]

97 [ ] ( ) ( ) [ ]

98 [ ] ( ) [ ]

99 [ ] ( ) [ ]

100 [ ] ( ) [ ]

101 [ ] ( ) [ ]

102 [ ]. : ( ) [ ]

103 [ ]. : ( ) [ ]

104 [ ] [ ]

105 [ ]. : ( ) [ ]

106 [ ]. ( ). : ( ) [ ]

107 [ ]. :( ) [ ]

108 [ ]. Bacillus cereus : ( ) [ ]

109 [ ] : ( ) Clostridium tetani [ ]

110 [ ] ( ) [ ]

111 [ ]. : ( ) [ ]

112 [ ]. : ( ) [ ]

113 [ ]. : ( ). : ( ) [ ]

114 [ ] [ ]

115 [ ] Klebsiella pneumoniae ( ) [ ]

116 [ ]. :( ) [ ]

117 [ ]. ( ) [ ]

118 [ ]. :( - ) [ ]

119 [ ]. : ( ) : ( ). : ( ) [ ]

120 [ ] Escherichia coli. Proteus mirabilis. : ( ) : ( ) [ ]

121 [ ] Streptococcus pyogenes Enterococcus faecalis Streptococcus pneumoniae. : ( ) [ ]

122 [ ] ( ) (lowenstein - jensen media) [ ]

123 [ ]. ( ) :( ) [ ]

124 [ ] Streaking. : ( ) [ ]

125 [ ]. : ( ) [ ]

126 [ ]. : ( ) ( ) [ ]

127 [ ]. : ( ). Brewer : ( ) [ ]

128 [ ]. ( ) [ ]

129 [ ]. Micrometer ( ).( ) :( ) [ ]

130 [ ]. :( ) [ ]

131 [ ]. :( ) [ ]

132 [ ]. : ( ).. : ( ).( ) [ ]

133 [ ]. :( ). : ( ) [ ]

134 [ ]. :( ) [ ]

135 [ ] :( ) :( ) [ ]

136 [ ].MR, VP : ( ). : ( ) [ ]

137 [ ]. : ( ). :( ) [ ]

138 [ ]. :( ) [ ]

139 [ ].IMViC : ( ) [ ]

140 [ ]. : ( ). : ( ) TSI :( ) [ ]

141 [ ].TSI :( ) [ ]

142 [ ]. : ( ) [ ]

143 [ ]. : ( ) [ ]

144 [ ]. :( ) [ ]

145 [ ]. : ( ) [ ]

146 [ ] ( ) [ ]

147 [ ]. :( ) [ ]

148 [ ]. : ( ) [ ]

149 [ ].( Bacillus subtilis) :( ) [ ]

150 [ ]. : ( ) [ ]

151 [ ]. :( ) ( ) [ ]

152 [ ] Pseudomonas aeruginosa API 20E ( ) [ ]