أسم وعنوان األخت ارع أنتاج بروتين المصفوفة لفيروس المخلوي التنفسي البشري بأستخدام تقنيات الهندسة الو ارثية واكتشاف ثالث بروتينات خلوية تتفاعل مع هذا ا

الحجم: px
بدء العرض من الصّفحة:

Download "أسم وعنوان األخت ارع أنتاج بروتين المصفوفة لفيروس المخلوي التنفسي البشري بأستخدام تقنيات الهندسة الو ارثية واكتشاف ثالث بروتينات خلوية تتفاعل مع هذا ا"

النسخ

1 أسم وعنوان األخت ارع أنتاج بروتين المصفوفة لفيروس المخلوي التنفسي البشري بأستخدام تقنيات الهندسة الو ارثية واكتشاف ثالث بروتينات خلوية تتفاعل مع هذا البروتين Production of Human Resiratory Syncytial virus Matrix Protein and the Discovery of Three Cellular Proteins Interact with this Protein أسماء المشاركون ۱- ليلى فؤاد علي مدرس مساعد ۲- رغد غالب السهيل أستاذ مساعد ۳- فيصل غازي ناصر طبيب أستشاري

2 الملخص من أجل التحري عن البروتينات الخلوية لالنسان التي تتفاعل مع بروتين المصفوفة )M( لفيروس المخلوي التنفسي البشري )hrsv( والتي تشكل اهدافا لعقار جديد يمنع تكاثر الفيروس تم جمع عينات من مسحات البلعوم والحنجرة من المرضى الراقدين في المستشفيات من مختلف األعمار و الذين يعانون من أعراض مشابهة لالنفلونزا. العينات التي كانت نتيجة فحوصاتهم لفيروس hrsv بواسطة تفاعل البلمره التسلسلي من النوع RT-PCR موجبة تم عزل الفيروس منها في الخاليا السرطانية للرئة.Hep2 وتم تنمية وتكثير فيروس hrsv بنجاح في خطوط الخلاليا Vero التي تمت ادامتها بوسط Dulbecco s )FCS( الذي يحتوي على 01 مصل جنين العجل Modified Eagle s Medium (DMEM) والمضادات الحيوية. تم مالحضة التأثيرات المرضيه للفيروس على الخاليا Hep2 المصابة التي تتمثل بتكوين ال. syncytia تم تحضير خزين للفيروس وكانت قيمة TCID50 له فيروس/ مل أي ما يعادل /PFU 01 مل. تم استخالص الرنا للفيروس (RNA) وعمل دنا (cdna) مكمل له باستخدام بادئات متخصصة للجين المسؤل عن التشفير للبروتين المصفوفة M. تم غرس نسق القراءة المفتوح (ORF) للجين في الناقل pet 16b وتمت عملية الكلونة بنجاح. بعدها تم ادخال الناقل في بكتريا BL21(DE3).E.coli أنتجت البكتيريا المتحولة بروتين المصفوفة لفيروس hrsv وبتراكيز عالية وتم استخالص هذا البروتين وتنقيته بأستخدام تقنية الفصل الحيوي.Immobilized mmetal affinity chromatography تم استخدام هذا البروتين في اختبار تفاعل بروتين- بروتين مع بروتينات خاليا بشرية في المختبر. وقد تم تحديد هذه البروتينات وتحليلها بواسطة مطياف الكتلة في وحدة Proteomic في معهد العلوم البيوفيزيائية ومدرسة الطب والصحة جامعة دورهام/ المملكه المتحدة. وأظهرت هذه الدراسة وألول مرة أن البروتينات الخلوية (بروتين الصدمة الحرارية HSP 90.)p <0.05( بمعنوية hrsv ترتبط مع بروتين المصفوفة للفيروس )Annexin A2 Annexin A5 هذه البروتينات على درجة عالية من االهمية على نمو وتكاثر الفيروس وكذلك لها اهمية كبيرة في االستجابة المناعية لالصابة بالفيروس وكثير من الفعاليات االيضية الخلوية وعليه فان استهداف تفاعل بروتين المصفوفة مع هذه البروتينات من قبل عقارجديد مصمم لهذه االهداف سيكون له تأثير كبيرعلى الفيروس ويكون استخدامه فعاال كلقاح أو عالج.

3 الوصف الكامل المقدمة فيروس المخلوي التنفسي البشري )hrsv( هوو السوبب الرئيسوي أللتهابوات الجهواز التنفسوي وزيوارات المستشفى أثناء فترة الرضاعة والطفولة (0(. هناك ما يقدر ب 46 مليون حالوة سونويا علوى مسوتو العوالم. األطفال الصغار في عمر أقل من 4 أشهر وكبار السن وأولئك الذين يعانون من نقص المناعة فيروس يمكن أن يسبب hrsv مرضا شديدا مع حوالي حالة وفاة سنويا علوى مسوتو العوالم )2(. تقريبوا 3 مون األفوراد المصوابين قود تتطوورالى التهواب القصويبات ألكثور مون الرضوع سونويا فوي الواليوات المتحدة )3(. ومن المثير لالهتمام أظهرت دراسة أن التهاب القصيبات الناتجة عن االصابة بفيروس RSV مقارنة مع التهاب القصيبات غير RSV كان مرتبطوا موع مضواعفات وخيموة للمورض )6(. وهوذا يعنوي أن العودو بفيروس RSV نفسها قد تكون أكثر خطورة من التهابات فيروسية أخر في فصل الشتاء في األطفال )5(. فيوروس hrsv ينتموي ىلوى جونس )4(. Pneumovirus اسومها يوأتي مون حقيقوة أن البوروتين F علوى سطح الفيروس تسبب دمج أغشية الخاليا المتجاورة وتشكيل )7(. syncytia على الرغم من أهمية فيروس hrsv كعامل ممورض للجهواز التنفسوي التوجود لقاحوات وال عالجوات فعالة وناجعة حاليا )8(. لذلك فان الدراسات عن األدوية أو اللقاحات ضود hrsv مهموة للغايوة. وأن يكوون العقارفعال وينبغي أن يستهدف الجينات األساسية لنمو وتكاثر الفيروس. ان أهم هذه البروتينوات هوو بوروتين المصفوفة.Matrix بروتينات الفيروس hrsv تمكن الفيروس من االصلبة وكذلك تتفاعل مع بعضها البعض. كما وتتفاعل مع بروتينات الخلية المضيفة ليتكاثر الفيروس )9(. البروتين مصفوفة )M( هوو البوروتين األكثور أهميوة والوذي يقوم بتجميع مكونات وتراكيب الفيروس لتكوين فيروس مكتمل ويحدد شكله النهائي )01(. بسبب أهمية االصابة بفيروس RSV كمشكلة صحية خطيرة كانت الحاجة الملحة إلجراء عن البروتين M والبروتينات الخلوية التي تتفاعل معه التي قد تكون أهدافا ألدوية جديدة. الدراسة هذه

4 أجريت هذه الدراسة ىلى: 0. انتاج بروتين المصفوفة من قبل خاليا بكتريا االشريشا القولونية المتحولة.transformed E.coli 2. استخالص البروتين الفيروسي المنتج من قبل البكتريا وتنقيته واستخدامه في تفاعول protein-protein مع مستخلص بروتيني لخاليا بشرية.Hep 2 interaction 3. اجراء ترحيل كهربائي في هالم.SDS-PAGE 6. تقطيع حزم البروتينات التي ارتبطت مع بروتين المصفوفة للفيروس. 5. تعريف وتشخيص البروتينات الخلوية للحزم المقطعة من الهالم بأستخدام مطياف الكتلة الضوئي Mass.spectrophotometer

5 المواد وطرق العمل 1 المواد 1. استعملت األجهزة والمعدات التالية عند تنفيذ المشروع Manufacturing Company/ Equipment or Apparatus Origin 6 well flat bottom plate Coastar/ USA well U bottom plate (Vinyl) Centrifuge Cooling centrifuge Deep-freezer Electrical balance Electrophoresis equipments Eppendorf tubes Gel electrophoresis unit Hot plate with magnetic stirrer Incubator &Shacker incubator Laminar air flow hood Membrane filters (0.22µm),(0.5µm) Microcentrifuge Coastar Beckman/USA Beckman Sanyo/Japan Fischer /USA Fischer Fischer BioRad/USA Promega /USA Memmert /England EuroClone/Italy Schleicher and Schuel / USA Hettich /Germany

6 Micropipettes Microwave Microwave oven Nanodrop Oven Thermocycler ph meter Power supply Refrigerator Screw capped test tubes Sensitive balance Spectrophotometer Stericup filter unit Ultraviolet light Vortex Water bath Water distillatory Confocal microscope Brand /Germany Fischer Sigma /England Fischer Sherwood /USA Promega /USA Fischer Fischer Fischer BBL /USA Sartorius/Switizerland Shimadzu /Japan Millipore/ USA Ultraviolet /USA Labcoo Memmert /Germany Fischer Karl-Zeiss/Germany

7 . 2 المواد الكيمياوية والبايولوجية Chemical and biological materials Company (origin) 1 Agarose gel Promega /USA 2 Ammonium per sulphate Sigma/England 3 Ampicillin (Amp) Sigma/ Aldrich /USA 4 Bromophenol blue dye (10 mg/ml) BDH/England 5 Coomassie brilliant blue Difco /USA 6 Dipotassium phosphate (K 2 HPO 4 ) Sigma /England 7 Dimethyl sulfoxide (DMSO) Difco /USA 8 Disodium phosphate (Na 2 HPO 4.7H 2 O) Difco 9 Dulbecco s Modified Eagle Medium Gibco/USA (DMEM), +4.5g/L d-glucose, + Pyruvate 10 Ethanol Absolute Difco 11 Ethylenediaminetetraacetic acid ) EDTA) Merck /Germany 12 Fetal calf serum Gibco 13 Glucose Difco 14 Glycerol Sigma/ Aldrich

8 15 Protein ladder Biolab/England 16 GeneRule (100-1 kb) and ( kb) DNA Ladder. Biolab 17 AlphaQuant DNA Ladder (200 bp-10 Kbp) Biocompare /USA 18 Glacial acetic acid Difco 19 Magnesium sulfat (MgSO4) Merck / Germany 20 Monopotassium phosphate (KH 2 PO 4 ) Difco 21 Nucleotide mix dntp Roch/ Germany 22 Acrylamide bisacrylamide Fisher/Germany 23 Sodium Dodesyle Sulphate (SDS) Sigma 24 Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Gibco 25 Phosphate-Buffered Saline (PBS) 7.2 Gibco 26 Polyethylene glycol Sigma 27 Sodium chloride (NaCl) Difco 28 Sodium phosphate (NaHPO 4 ) Difco 29 Sulphuric acid (H 2 SO4) Difco 30 Tri-HCl Difco 31 5% Trypsin- Versein 10X, 100ml Gibco

9 3. العدد المستعملة The kit Company 1 Onestep RT-PCR Kit Qiagene /USA 2 Tag polymerase kit Thermo/USA 3 Dream DNA polymerase Kit. Thermo 4 QIAquick PCR purification kit. Qiagen/USA 5 ImProm-II Reverse transcription System Promega/USA 6 RNeasy Mini kit purification total RNA from Tissue culture Qiagen 7 EZgene TM Cleaning/Gel Extracion Kit Biomiga/USA 8 QIAprep Spin Miniprep Kit Qiagen 9 SDS-PAGE Preparation Kit Sigma/England 4. خطوط الخاليا المستعملة Cell Line Origen Tissue Source Hep-2 Human epidermoid cancer cells Provided by Dr. Robert Paul Yeo / Durham University

10 5. البكتريا التي استخدمت 1 Bacteria E coli BL21 (DE3) plyss. Genotype:F - ompt gal dcm lon hsds B (r B - m B - ) λ(de3) plyss(cm R ) Company Novagen/ Germany. 6 الناقل الذي استعمل : /USA) pet 16b (Novagen. 7 تفاصيل الناقل المستعمل Type Cloning, Expression Origin of Replication pbr322 Copy # ~40 Markers Link to Sequence Features Ampicillin Novagen T7 promoter T7 transc start T7 terminator His Tag MCS laci

11 8. البادئات المستعملة في تضخيم الجينات Primer name Primer sequence (5 3 ) Origin N Forward primer N reverse primer M Forward primer M Reverse primer M Forward primer with restriction site M Reverse primer with restriction site CATCCAGCAAATACACCATCCA GCATCTCTGAGTATTTTTATGG ATGGAAACATACGTGAAC TTAATCTTCCATGGGTTTG TGCGGATCCATGGAAACATACGTG AAC TGCGGATCCTTAATCTTCCATGGGT TTG Sigma/ England 9. االوساط الزرعية المستعملة Medium Company(Origion) 1 Luria broth 2 2XY broth Melford/England

12 A. Ethylendiaminetetraacetic Acid (EDTA) (0.5 M) B. TE buffer (50 X) (Tris, Acetic acid, EDTA) The following components were dissolved in D.W. Tris base Glacial acetic acid EDTA (0.5 M) 242 gm 57.1 ml 100 ml ph was adjusted to 7.8 and completed to 1000 ml with H 2 O. C. DNA loading buffer 6X dye: 10. الدوارئ والمحاليل المستعملة Mixture of 30% sucrose and 0.25% bromophenol blue was made. The mixture was completed to 100 ml and autoclaved then kept at 4 C until used. A. Growth Medium: Dulbecco's modified Eagle's Medium (DMEM) containing Heat inactivated Fetal Calf Serum Penicillin/Streptomycin (100 IU/ml) 11. الدوارئ والمحاليل المستعملة في الزراعة النسيجية 500ml 50ml 5ml B. Maintenance medium: Dulbecco's modified Eagle's Medium (DMEM) Heat inactivated Fetal Calf Serum Penicillin/ Streptomycin (100 IU/ml). 500ml 10ml 5ml C. Freeze medium: Growth medium containing 20% heat inactivated serum. DMSO (cryoprotectant) 10% should not contain antibiotics.

13 D. Trypsin-EDTA solution: Composition: 0.05% trypsin and 0.5 mm EDTA (ph 8.0) E. Phosphate buffer solution: One tablet was dissolved in 500ml D.W. ph: المضاد الحيوي المستعمل:.Ampicillin (Amp) 100 mg/ml in distilled water A. 6X His wash buffer: Phosphate Buffer NaCl Imidizole Adjust ph to الدوارئ والمحاليل المستعملة في استخالص وتنقية البروتين 50 mm 300 mm 1 mm B. 6X His elution buffers: Phosphate Buffer 50 mm NaCl 300 mm Imidizole 50 mm Adjust ph to 7.0 The same buffer was prepared with addition of Imidizole in different amount to get the following concentrations: (100, 200, 300 and 500) mm. A. Stacking gel: H 2 O Stacking buffer 14. المحليل المستعملة في عمل هالم SDS-PAGE 3.25 ml 1.25 ml

14 Acrylamide/Bis-acrylamide 0.67 ml 10% (w/v) ammonium persulfate (AP) 50 μl TEMED 5.0 μl B. Separating gel Acrylamide 10%: H 2 O 3.8ml Acrylamide/Bisacrylamide 3.33 ml Resolving Buffer 2.5 ml 10% (w/v) ammonium persulfate (AP) 100μl TEMED 10μl C. 10X Sample buffer (loading buffer): Tris-HCI (ph 6.8) M SDS 4 % β-mercaptoethanol 1 0 % Glycerol 2 0 % Bromophenol Blue 20 mg C. 1x Running Buffer: Tris-HCl Glycine SDS dh 2 O 25 mm 20 mm 0.1% w/v to 1000 ml D. Staining: Coomassie Brilliant Blue R % Methanol 30 %

15 Acetic acid 10 % (v/v) D.D.W 60% (v/v) Coomassie blue was used for gel staining by immersing the gel in the dye for 3 hr. E. Destaining: Methanol 40% (v/v) Acetic acid 10 % (v/v) D.D.W 50% (v/v) The stained gel was destained by immersing it in methanol acetic acid solution for 24 hr. with multiple changing of destaining solution.

16 ط ارئق العمل جمع العينات عينات تم جمع من مسحات البلعوم واف ار ازت األنف في وسط ناقل لمرضى مصابين بالتهابات تنفسية وبأعمارمختلفة. تشخيص االصابة Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction إج ارء تم فحص تفاعل البلمرة التسلسلي لتشخيص اإلصابة بالفيروس باستخدام بادئات متخصصة للجين N للفيروس وهذه البادئات هي: N Forward primer CATCCAGCAAATACACCATCCA N reverse primer GCATCTCTGAGTATTTTTATGG استخالص الرنا RNA تم استخالص الرنا للفيروس من المزرعة النسيجية باستخدام عدة االستخالص الخاصة وتمت تنقية الرنا باستخدام العدة الخاصة بالتنقية.

17 عمل دنا مكمل cdna تم عمل دنا مكمل للرنا باستخدام بادئات متخصصة للجين M وهذه البادئات هي M Forward primer M Reverse primer ATGGAAACATACGTGAAC TTAATCTTCCATGGGTTTG تضخيم الجين M تم تضخيم الجين M باستخدام بادئات خاصة وهي: M Forward primer with restriction site M Reverse primer with restriction site TGCGGATCCATGGAAACATACGTGAAC TGCGGATCCTTAATCTTCCATGGGTTTG كلونة الجين M pet المممذي 16b حشمممر الجمممين M تمممم للفيمممروس فمممي الناقمممل يحتممموي علمممى الجمممين المسمممؤل عمممن انتممما β بعد معاملة كل من الجين والبالميد باالنزيم القاطع Bam H1 كل على حدة ومن ثم انزيم lactamase لصقهماباستخدام االنزيم T4. Ligase

18 عملية تحول الخاليا البكتيرية Bacterial Transformation تم تحول الخاليا البكتيرية باستخدام طريقمة الصمدمة الح ارريمة الادخمال الناقمل الهجمين المى بدرجمة البكتريما Luria broth ثانيمة. لممدة 24 نميمت البكتريما علمى وسمط مضمافا لمم المضماد الحيموي فمي امبسملين 24 C Luria agar الحاضممنة الهمم اززة بدرجممة حمم اررة C 73. تممم تنميممة علممى وسممط البكتريمما مضممافا اليممم االمبسمملين البكتريا المتحولة بنجاح تنمو النها تصبح مقاومة لالمبسلين. تم انتخماب مسمتعمرة واحمدة ونميمت علمى الوسمط السائل وحضنت في الحاضنة اله اززة لمدة 81 ساعة وأستعملت ألنتا بروتين المصفوفة للفيروس. انتاج بروتين المصفوفة للفيروس :hrsv luria broth ب 81 تم تلقيح 811 ممل ممن وسمط ممل ممن المزرعمة أعماله وتممت حضمانة الممزرو لممدة 6 سمماعة فممي الحاضممنة الهمم اززة بدرجممة حمم اررة C 73. بعممدذلم تممم تلقمميح لتممر مممن الوسممط الزرعممي السممائل وحضممنت الفالسممكات بدرجممة حمم اررة C 44 فممي الحاضممنة الهمم اززة دورة/دقيقممة لمممدة علممى ان سمماعة يضاف الحفزIPTG بمقدار 811 ملغ ارم/لتربعد مرور خمس ساعات من بدء الحضن بالحاضنة اله اززة وذلم لتحفيز انتا البروتين. استخالص وتنقية البروتين المنتج: تم تجميع االوساط الزرعية في انابيمب خاصمة بجهماز الطمرد المركمزي المبمرد بدرجمة حم اررة C 2 وبسمرعة دورة/دقيقمة لممدة 80 دقيقمة. أخمذ ال ارشمح وأضميف لمم المحلمول المحلمل للخاليما البكتيريمة وتمم عممل نبمذ مركممزي بدرجممة C 88 بسممرعة دورة/دقيقممة لمممدة دقيقممة. تممم تنقيممة البممروتين المنممتا بأسممتخدام (His6)/ nickel (II) nitrilotriacetic acid (Ni +2 NTA).system تمم ترييما الومروتين علم هالم SDS-PAGE كما موضح بالشكا 4.

19 اج ارء تفاعل بروتين-بروتين في المختبر: تمم تحليمل خاليما Hep 2 باسمتخدام محلمول خماص السمتخالص البروتينمات خاليما المزرعمة النسميجية وتمم اج ارء التفاعل بين هذه البروتينات وبمروتين المصمفوفة للفيمروس والمحممل علمى كريمات Qiagen Ni-NTA 2 دورة/ثانيممة بدرجمة حمم اررة C 2 ولممدة تممم سمماعات. agarose beads وتمم التفاعممل علممى حاممل دوار 81 Tween %. بعود ذلوك توم ترحيول غسمل كريمات همالم النيكمل بمحلمول دارئ الفوسمفات الحماوي علمى الكريات على هالم SDS-PAGE كما موضح بالشكا 5. تشيخص وتعريف البروتينات الت تفاعلت مع بروتين المصفوقة لفيروس :hrsv تمممممم تقطيمممممع حمممممزم البروتينمممممات ممممممن همممممالم SDS-PAGE وتحليلهوووووا بواسوووووطة مطيووووواف الكتلوووووة فوووووي وحدة Proteomic في معهد العلوم البيوفيزيائية ومدرسة الطب والصحة جامعة دورهام/ المملكه المتحدة. عناصر الحماية 0. تم كلونة الجين المسؤل عن التشفير لبروتين المصفوفة M في الناقل pet 16b وادخل الناقل الهجين الى بكتريا االيشريشيا القولونية BL21(DE3) E.coli بنجاح. 0. تم انتاج بروتين المصفوفة Matrix protein لفيروس المخلوي التنفسي البشري Human Respiratory Syncytial Virus من بكتريا االيشريشيا القولونية باستخدام تقنيات الهندسة الوراثية بنجاح. 2. تم تحديد البروتينات الخلوية (بروتين الصدمة الحرارية )Annexin A2 Annexin A5 HSP 90 بانها تتفاعل أو ترتبط مع بروتين المصفوفة للفيروس hrsv بمعنوية )0.05> p(. هذه التفاعالت على درجة عالية من االهمية في عملية االصابة وكذلك في االستجابة المناعية للفيروس وبذلك ممكن ان تكون أهدافا جيدة لستراتيجية جديدة في تصيميم العقارات والمركبات الكيمياوية المثبطة لنمو الفيروس خاصة ان الجين المسؤل عن التعبير للبروتين M هو من الجينات المحافظة او الثابتة واليعاني من تغييرات نتيجة لتطور الفيروس والذي يحدث بصورة مستمرة لبعض جيناتهاالخر.

20 الرسومات التوضيحية للنتائج bp 771 bp شكل 1: نتيجة الترحيل الكهربائي لجين.1 المصفوقة لقيروس الخلوي التنفسي البشري في هالم االكاروز. دليل 2. جين المصفوقة bp 5711 bp 500 bp 250 bp شكل 2: الترحيل الكهربائي في هالم.1 دليل.2 االكاروز للناقل بعد هضمه باالنزيم القاطع. الناقل المهضوم باالنزيم القاطع.

21 شكل 3: مستعمرات لبكتريا االيشريشيا القولونية على وسط Luria agar with ampicillin بروتين المصفوفة 30kD شكل 4: الترحيل الكهربائي لبروتين المصفوفة للفيروس المستخلص من المزارع البكتيرية والمنقى باستخدام تقنية IMAG في هالم.SDS-PAGE 1: دليل 2: سيطرة موجبة 3: سيطرة سالبة 4: أستخالص بمحلول االميدازول بنركيز 5: 151mM االستخالص بتركيز 6 :االستخالص 211mM بتركيزmM 7: 311 االستخالص بتركيزmM511.

22 Ladder M الترحيل الكهربائي لناتج تفعل بروتين المصفوفة للفيروس مع البروتينات الخلوي لمستخلص خاليا.HEP 2 شكل 5: جدول رقم 1: نتائج مطياف الكتلة لتفاعل البروتين M مع البروتينلت الخلوية: Band Approx size /kda ID Swissprot Score 1 80 Human Hsp 90s Annexin A2 OS=Homo sapiens 3 30 Annexin A5 OS=Homo sapiens

23 نتائج تعريف البروتينات بمطياف الكتلة :Nano-LC ESI MS-MS 1. Proteins detected: NB human HSP90 has same peptides and score as top match: Human HSP 90 MPEEVHHGEEEVETFAFQAEIAQLMSLIINTFYSNKEIFLRELISNASDALDKIRYESLTDPSKLDSGKELKIDIIP NPQERTLTLVDTGIGMTKADLINNLGTIAKSGTKAFMEALQAGADISMIGQFGVGFYSAYLVAEKVVVITKHNDDEQ YAWESSAGGSFTVRADHGEPIGRGTKVILHLKEDQTEYLEERRVKEVVKKHSQFIGYPITLYLEKEREKEISDDEAE EEKGEKEEEDKDDEEKPKIEDVGSDEEDDSGKDKKKKTKKIKEKYIDQEELNKTKPIWTRNPDDITQEEYGEFYKSL TNDWEDHLAVKHFSVEGQLEFRALLFIPRRAPFDLFENKKKKNNIKLYVRRVFIMDSCDELIPEYLNFIRGVVDSED LPLNISREMLQQSKILKVIRKNIVKKCLELFSELAEDKENYKKFYEAFSKNLKLGIHEDSTNRRRLSELLRYHTSQS GDEMTSLSEYVSRMKETQKSIYYITGESKEQVANSAFVERVRKRGFEVVYMTEPIDEYCVQQLKEFDGKSLVSVTKE GLELPEDEEEKKKMEESKAKFENLCKLMKEILDKKVEKVTISNRLVSSPCCIVTSTYGWTANMERIMKAQALRDNST MGYMMAKKHLEINPDHPIVETLRQKAEADKNDKAVKDLVVLLFETALLSSGFSLEDPQTHSNRIYRMIKLGLGIDED EVAAEEPNAAVPDEIPPLEGDEDASRMEEVD 2. Proteins detected: NB human annexin 2 has same score as top hit: Annexin 2 MSTVHEILCKLSLEGDHSTPPSAYGSVKAYTNFDAERDALNIETAIKTKGVDEVTIVNILTNRSNAQRQDIAFAYQR RTKKELASALKSALSGHLETVILGLLKTPAQYDASELKASMKGLGTDEDSLIEIICSRTNQELQEINRVYKEMYKTD LEKDIISDTSGDFRKLMVALAKGRRAEDGSVIDYELIDQDARDLYDAGVKRKGTDVPKWISIMTERSVPHLQKVFDR YKSYSPYDMLESIRKEVKGDLENAFLNLVQCIQNKPLYFADRLYDSMKGKGTRDKVLIRIMVSRSEVDMLKIRSEFK RKYGKSLYYYIQQDTKGDYQKALLYLCGGDD 3. Proteins detected: human annexin 5 has same score as top hit: Annexin 5 MAQVLRGTVTDFPGFDERADAETLRKAMKGLGTDEESILTLLTSRSNAQRQEISAAFKTLFGRDLLDDLKSELTGKF EKLIVALMKPSRLYDAYELKHALKGAGTNEKVLTEIIASRTPEELRAIKQVYEEEYGSSLEDDVVGDTSGYYQRMLV VLLQANRDPDAGIDEAQVEQDAQALFQAGELKWGTDEEKFITIFGTRSVSHLRKVFDKYMTISGFQIEETIDRETSG NLEQLLLAVVKSIRSIPAYLAETLYYAMKGAGTDDHTLIRVMVSRSEIDLFNIRKEFRKNFATSLYSMIKGDTSGDY KKALLLLCGEDD

24 المصادر 1. Fernanda, P.; Caroline, B.; Luciana, S.; Nunes, A. B.; Mombach P.M.; Rodrigo, M.P.; Denise, S. M.; Márcia R.P.; Rodrigo, P.S.; Ricardo,S. K. and Afonso, L.B.(2014). Evaluation of respiratory syncytial virus group A and B genotypes among nosocomial and community-acquired pediatric infections in southern Brazil. Virology Journal. 11: Young, K.; Lisa, H. and John, D. (2014). Respiratory syncytial virus (RSV)- specific cell-mediated immune responses in human peripheral blood. Journal of Immunology. 192 (1) Sarah, N.L.; Deflubé, L.R.; Tremaglio, C.Z. and Fearns, R. (2012). The Respiratory Syncytial Virus Polymerase Has Multiple RNA Synthesis Activities at the Promoter. PLoS Pathog 8(10). 4. Tian, J.; Huang, K.; Krishnan, S.; Svabek, C.; Rowe, D.C.; Brewah, Y.; Sanjuan, M.; Patera, A.C.; Kolbeck, R.; Herbst, R. and Sims, G.P. (2013) RAGE inhibits human respiratory syncytial virus syncytium formation by interfering with F-protein function. J. Gen. Virol. 94(8): Wang, K. C.; Chang, J. S., and Lin, C. C. (2012). Cimicifuga foetida L. inhibited human respiratory syncytial virus in HEp-2 and A549 cell lines. The American Journal of Chinese Medicine.40 (1): Grad, Y.H.; Newman, R.; Zody, M.; Yang, X.; Murphy, R.; Qu, J.; Malboeuf,C.M.; Levin, J.Z.; Lipsitch, M. and DeVincenzo, J. (2014). Within-Host Whole-

25 Genome Deep Sequencing and Diversity Analysis of Human Respiratory Syncytial Virus Infection Reveals Dynamics of Genomic Diversity in the Absence and Presence of Immune Pressure. J. Virol. 88(13): Venter, M.; Madhi, S.A.; Tiemessen, C.T. and Schoub, B.D. (2001). Genetic diversity and molecular epidemiology of respiratory syncytial virus over four consecutive seasons in South Africa: identification of new subgroup A and B genotypes. Journal of General Virology. 82(9): McPhee, H.K.; Jennifer, L.;Carlisle, A.B.; Victoria A. M.; Scott M. D. ; Robert, P. Y. and John, M.S.( 2011). Influence of Lipids on the Interfacial Disposition of Respiratory Syncytial Virus Matrix Protein. Langmuir. 27: Cedric, L.; Max, R., Karl, H.; Juha, T. H. and Jonathan, M. G. (2014). Structure and Self-Assembly of the Calcium Binding Matrix Protein of Human Metapneumovirus. J. Elsever 22 (1): Liljeroos, L.; Krzyzaniak, M.A.; Helenius, A. and Butcher, S.J. (2013). Architecture of respiratory syncytial virus revealed by electron cryotomography. Proc. Natl. Acad. Sci. USA.110:

26