عزل وتشخیص البكتریا المنتجة لانزیم الامیلیز 1 جاسم محمد عودة.1.2 2* علي حسین فیاض استاذ مساعد دكتور قسم علوم الاغذیة كلیة الزراعة جامعة بغدا

النسخ

1 عزل وتشخیص البكتریا المنتجة لانزیم الامیلیز جاسم محمد عودة.. * علي حسین فیاض استاذ مساعد دكتور قسم علوم الاغذیة كلیة الزراعة جامعة بغداد بغداد العراق. Dr.jasim.awda@coagri.uobaghdad.edu.iq قسم علوم الاغذیة كلیة الزراعة جامعة بغداد بغداد العراق. engalialazzawi87@gmail.com تاریخ استلام البحث: 07/7/4 تاریخ قبول النشر: 07// الخلاصة عزلت 36 بكتریا من مصادر مختلفة (التربة والنشا والارز المطبوخ وبعض الاغذیة الاخرى) وأخضعت لمجموعة من اختبارات الغربلة الا ولیة للحصول على العزلة الا كفا في انتاج أنزیم الا میلیز من خلال حجم الھالة المتكونة بكاشف (لوكال) إذ اختیرت 7 عزلات للغربلة الثانویة من خلال قیاس الفعالیة الا نزیمیة والفعالیة النوعیة للانزیم وتبین ان العزلة التي رمز لھا A4 كانت الاكفا في انتاج انزیم الامیلیز ثم جرى تشخیص ھذه العزلة من خلال الفحوصات المجھریة والمزرعیة وبتقنیة جھاز Vitek System فضلا عن التشخیص الجیني من خلال جین 6S بالكشف عن تسلسل القواعد النتروجینیة للجین باستعمال تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) والذي بلغ حجمة 56 قاعدة وبالمقارنة مع ما متوفر من معلومات في المركز الوطني لمعلومات التقنیة الحیویة NCBI تبین ان العزلة تعود الىsubtilis.Bacillus الكلمات المفتاحیة: عزل تشخیص الامیلیز جین 6S. rrna ISOLATION AND IDENTIFICATION OF BACTERIA THAT PRODUCE AMYLASE Jasim. M. Awda, Ali. H. Fayyadh*. Assis. Prof. Dr. Department of Food Sciences, College of Agriculture, University of Baghdad, Bagdad, Iraq. Dr. jasim.awda@ coagri. uobaghdad.edu.iq. Department of Food Sciences, College of Agriculture, University of Baghdad, Bagdad, Iraq. engalialazzawi87@gmail.com. ABSTRACT Thirty six bacteria were isolated from various sourcesc (soil, starch, cooked rice and other foods) and subjected to a series of primary screening tests to obtain the optimal isolation to production of amylase. The volume of producing zone by logal indicator for (Seven) isolates of the secondary screening by measuring the enzymatic activity and specific enzymatic activity. The isolate A4 was found to be the most efficient for production of amylase. Then this isolate was diagnosed through microscopic, vitek system technique. in addition by gentic diagnesis through gene 6s of the genes nitrogen bases by use the polymerase chain reaction (PCR) which reached 56 bases. In comparison to the available information at the National Center for Biotechnology Information (NCBI), the isolation was found to be Bacillus subtilis Keywords: Isolation, Diagnosis, 6S rrna, Amylase. المقدمة :INTRODUCTION تشكل الامیلیزات Amylases) ( مجموعة من الانزیمات التي تنتج الدكسترین والعدید من الوحدات الاساسیة بوساطة التحلل الماي ي للاواصر الكلایكوسیدیة,4 لجزیي ات النشا. انزیمات التحلل الماي ي Enzymes) (Amyloltic لھا اھمیة كبیرة في العدید من عملیات التكنولوجیا الحیویة بما في ذلك الدواي یة والغذاي یة والالیاف والنسیج والمنظفات والتخمیر والتنقیب عن النفط وصناعة الورق (04 Demain, (Adrio &. یتواجد الامیلیز في النباتات والحیوانات والاحیاء المجھریة اكتسب الامیلیز (3... (EC المنتج من المصادر المیكروبیة اھمیة ھاي لة بین الباحثین وذلك بسبب القدرة الھاي لة على الانتاج وسھولة التعامل مع الاحیاء المجھریة والتي تنتج الانزیم بفعالیة عالیة وكلفة انتاج قلیلة مقارنة بالمصادر الاخرى (00 Magalhaes, ). Souza & بلغ انتاج الامیلیز الى ما یصل الى %65 من سوق الانزیمات 7 * ال م ل م رسالة ماج لل اح ال اني.

2 Bacillus معروف جیدا بانھا منتجة للانزیمات الخارجیة بشكل كبیر ومتنوع والتي منھا جنس ویزداد باستمرار al., (John Ravindar & Elangovan, 03 ; Abdullah et الامیلیزات التي لھا دور في مختلف الصناعات (04. بالرغم من أن ظروف النمو متشابھة لمختلف أنواع جنس Bacillus إلا أنھا تختلف في انتاج الا میلیزات وذلك یعتمد على مكونات الوسط والمعاملات المختلفة نوع السلالة حیث یمكن تعزیز أنتاج الانزیمات بواسطة تحسین مكونات الوسط جنبا الى جنب مع غیرھا من المعاملات الاخرى با ستخدام تخمرات الحالة الساي لة والتي تفضل على تخمرات الحالة الصلبة في تنمیة البكتریا لا نتاج الا نزیم وذلك نظرا لسھولة تنقیة الانزیم من المنتجات التي یتم الحصول علیھا فضلا عن سھولة ادارة العملیة 05) al.,.(dash et al., 05 ; Abd-Elhalem et المواد وطراي ق العمل :MATERIALS AND METHODS مصادر العزلات : تمت عملیة العزل من مصادر مختلفة شملت (التربة والنشا والارز المطبوخ وبعض الاغذیة الاخرى) وأخضعت للتنقیة من خلال نقلھا عدة مرات على اطباق بتري وادخلت الى الغربلة الا ولیة للحصول على العزلة الا كفا في انتاج أنزیم الا میلیز العزل والغربلة الاولیة : استعمل وسط Nutrient Agar و Nutrient Broth والوسط الا نتاجي الذي حضر وفق ما ذكر في Teodoro (000) Martins & للتحري عن قابلیة العزلات البكتیریة لانتاج انزیم الامیلیز وذلك بزراعة المستعمرة البكتیریة المنماة على وسط الاكار المغذي بعمر 8 ساعة في منتصف الطبق وحضنت الاطباق بدرجة حرارة º 37 م لمدة 4 ساعة. تم التحري عن قابلیة العزلات البكتیریة لانتاج انزیم الامیلیز باستعمال محلول الیود المحضر سابقا وذلك عن طریق تغطیة الطبق بمحلول الیود ثم قیاس قطر المستعمرة البكتیریة (Growth) وقطر منطقة التحلل (Zone) لكل عزلة ومن خلالھا تم احتساب قدرة العزلات على تحلیل النشا من خلال انتاج الانزیم وكما یا تي: كفاءة العزلات لانتاج الا نزیمات المحللة للنشا = قطر منطقة التحلل(الھالة المتكونة) قطر المستعمرة البكتیریة(النمو البكتیري) رقم الانبوبة المنحنى القیاسي لمكفرلاند : MacFarland أتبعت الطریقة الموصوفة من قبل al.,(996) Collee et في إعداد المنحنى MacFarland القیاسي حیث أضیفت الحجوم المذكورة في (الجدول ) من كلورید الباریوم الماي ي إلى أنابیب أختبار وأكمل الحجم الى 0 مل بحامض الكبریتیك الخزین وقیست الامتصاصیة لجمیع الانابیب وبمكررین في جھاز المطیاف الضوي ي Spectrophotometer على طول موجي 600 نانومتر وحضر محلول السیطرة Blank من حامض الكبریتیك بتركیز % فقط حیث استخدم في تصفیر الجھاز وعلى نفس الطول الموجي وأستخدمت معادلة الخط المستقیم من منحنى MacFarland القیاسي كما في (الشكل ) وأ ستخدمت ھذه المعادلة في حساب عدد الخلایا التقریبي/مل للمزارع المنشطة لتحدید حجم اللقاح المطلوب إضافتھ إلى وسط إنتاج الا نزیم خلال مدة الدراسة. جدول (): تراكیز المنحنى القیاسي MacFarland لا عداد منحنى القیاسي. 0 8 x الامتصاصیة على طول عدد الخلایا التقریبیة MacFarland كلورید الباریوم الماي ي حامض الكبریتیك (مل) /مل الرقم القیاسي موجي 600 نانومتر (مل)

3 شكل (): المنحنى القیاسي MacFarland لحساب إعداد الخلایا البكتیریة/ مل. تحضیر اللقاح: حضرت مزارع فتیة بعمر لایتجاوز 48 ساعة من العزلات التي وقع علیھا الاختیار من مرحلة الغربلة الا ولیة التي تمیزت بكفاءتھا العالیة في إنتاج الا نزیم حیث تم تحضیر اللقاح وذلك با خذ مسحة بواسطة أبرة التلقیح ) full (Loop من مزارع العزلات الى انابیب اختبار حاویة على 0 مل من الوسط الساي ل المغذي Nutrient broth ثم حضنت بدرجة حرارة 37 م الا نابیب لمده (4-48) ساعة بعد ذلك تم حساب عدد الخلایا/مل عن طریق قیاس الا متصاصیة الضوي یة للمزارع المنشطة على طول موجي 600 نانومتر وبالاستعانة بمعادلة الخط المستقیم لمنحنى MacFarland القیاسي ثم أجري التخفیف اللازم للحصول على العدد المطلوب اضافتھ من الخلایا الى وسط الا نتاج. الغربلة الثانویة (الكمیة): استعمل نفس الوسط الانتاجي عدا اضافة الاكار وذلك باستعمال دوارق حجمیة بسعة 300 مللتر تحتوي على 50 خلیة حدد حجم اللقاح بالاستعانة مللتر من الوسط إذ لقحت ھذه الدوارق بعد تعقیمھا بعالق البكتیریا وبحجم مقداره 0 8 بالمنحنى القیاسي لمحلول MacFarland وحضنت في الحاضنة الھزازة بسرعة 50 دورة/ الدقیقة بدرجة حرارة º37 م لمدة 7 ساعة بعد ذلك تم أجراء عملیة النبذ المركزي (لفصل الخلایا) بسرعة 6000 Xg لمدة 0 دقیقة واعتبر الراشح الذي تم الحصول علیھ مستخلص خام للانزیم وقدرت الفعالیة الا نزیمیة وتركیز البروتین لحساب الفعالیة النوعیة للا نزیم في المستخلص الخام. تقدیر فعالیة أنزیم الامیلیز : اتبعت طریقة (DNSA) Dinitro Salicylic acid 3,5 التي اشار الیھا كل من & Whitaker (997) al., Bernard, (97) ; Lin et رسم المنحنى القیاسي للكلوكوز من خلال رسم العلاقة البیانیة بین الامتصاصیة الضوي یة على طول موجي 540 نانومتر والتراكیز المختلفة من الكلوكوز (ملغم / مل) واعتمد ھذا المنحنى القیاسي في تقدیر الكلوكوز المتحرر بفعل الانزیم كوحدة للتعبیر عن الفعالیة. تعرف وحدة الفعالیة الا نزیمیة (وحده/ مل) انھا كمیة الا نزیم التي تحرر () مایكرومول من السكریات المختزلة (الكلوكوز) في الدقیقة الواحدة وتحت ظروف التقدیر: - محلول فوسفات البوتاسیوم الدارئ 0.05 ذو الاس الھیدروجیني 7. - محلول المادة الا ساس (النشا الذاي ب (% starch)) (Stock substarte solution (% soluble أذیب ( غم) من النشا في (5 مل) من المحلول الدارئ ثم أضیف الى الخلیط (50 مل) من المحلول الدارئ المغلي مع الاستمرار بالغلیان لمدة دقیقة واحدة بعدھا ترك لیبرد ثم أكمل الحجم الى (00 مل) بالمحلول الدارئ نفسھ واستخدم كمادة اساس لتقدیر الفعالیة. تقدیر تركیز البروتین : قدر تركیز البروتین وفق الطریقة الموصوفة من قبل (976) Bradford وكما یا تي: 9

4 نقل 0. مل من المحلول الانزیمي الى مل من كاشف البروتین (50-G (Comassie brilliant blue ومزجت جیدا وتركت لمدة 5 دقاي ق بدرجة حرارة الغرفة وقیست الامتصاصیة على طول موجي 595 نانومتر. قدر تركیز البروتین اعتمادا على المنحنى القیاسي لا لبومین المصل البقري. تشخیص البكتیریا (A4) : ت م تنمی ة البكتری ا الت ي اعط ت اعل ى فعالی ة انزیمی ة عل ى وس ط Agar) (Nutrient وبطریق ة التلق یح ال سطحي وحضنت الا طباق في درجة حرارة º37 م لمدة 48 ساعة. جرى بعدھا تحدید الخصاي ص المزرعیة والمجھریة من حیث شكل المستعمرة على الوسط الغذاي ي الصلب وحافاتھا وسطحھا ولونھا وحجمھا وشكل الخلایا وتصبیغھا بصبغة كرام وتصبیغ السبور. التشخیص باستعمال جھاز : Vitek compact system اجریت عملیة التشخیص باستعمال نظام الفایتك للعزلة البكتیریة A4 والتي اشارت معظم الفحوصات المزرعیة والموروفولوجیة انتماي ھا الى جنس.(Anonymous, (00 Bacillus أستخلاص الحامض النووي : DNA أستعمل Presto MinigDNA Bacteria Kit المجھز من شركة Geneaid في أستخلاص DNA من البكتریا تضخیم الحامض النووي : DNA توضح (الجداول و 3) أستعمال تقنیة تفاعلات السلسلة البلمرة الانزیمیة PCR لتضخیم 6S rrna واستعمل PreMix PCR المجھزة من شركة Bioneer المجفدة في انابیب ابندروف للتا كد من نوع العزلة المنتخبة بالاعتماد على (00) al., Sacchi et باستخدام البادئ حسب (الجدول :(3 جدول (): ت تمثیل القواعد النتروجینیة في البادئ. البادئ 04F الامامیة التسلسل 5 - CGGGTGAGTAACACGTG 3 - العدد CGGTGTGTACAAGGCCC 3 - العكسیة 390R جدول (3): المواد المضافة في أنبوبة ابندروف الحاویة على PreMix PCR لا ختبار 6S rrna بتقنیةPCR. المكونات مستخلص 35 DNA نانوغرام / مایكرولتر الحجم (مایكرولتر) 5 Forward primer بتركیز 0 بیكومول/ مایكرولتر Reverse primer بتركیز 0 بیكومول / مایكرولتر free nuclease water 3 4 الحجم الكلي 0 مزجت المكونات اعلاه ونقلت إلى جھاز PCR thermal cycler تم برمجة الجھاز حسب (الجدول 4 ). جدول (4): الظروف المعتمدة في تضخیم 6S rrna والتي تم برمجتھا في جھازPCR. عدد الدورات 30 الزمن (دقیقة) درجة الحرارة (م ) الخطوات رقم الخطوة 5 94 Denaturation الدنترة 94 Denaturation الدنترة 55 Annealing ارتباط البادئ 3 :40 7 Extension استطالة Final extension الاستطالة النھاي یة 5 4 Cooling التبرید 6 بعد انتھاء وقت التفاعل سحب 5 مایكرولتر من نواتج تضخیم 6S rrna للترحیل الكھرباي ي. 0

5 الترحیل الكھرباي ي Electrophoresis لنواتج تقنیة PCR وتحضیر ھلام الا كاروزAgarose : حضر الھلام بتركیز % وذلك با ذابة 0.5 غم من الا كاروز في 50 مل من محلول X TBE سخن بواسطة Ethidium º م وأضیف إلیھ مایكرولتر من صبغة microwave oven لمدة دقیقة ترك لیبرد لحرارة بحدود 55.bromide وصب الھلام بقالب الترحیل الكھرباي ي وترك لیتصلب وأضیف محلول الترحیل X TBE buffer لیغطي سطح الھلام أضیفت العینات بمقدار 5 مایكرولتر من ناتج (Sambrook and Russell, (00 PCR وأستعملت دلاي ل حجمیة Ladder والتي جھزت من شركة Promega لتحدید حجموم الحزم. :RESULTS AND DISCUSSION النتاي ج والمناقشة عزل البكتریا المنتجة لا نزیمات الامیلیز: تم في ھذه الدراسة انتقاء 36 مستعمرة من البكتریا المنتجة لانزیمات الامیلیز من التربة وبعض المواد الغذاي یة على والحاوي على النشا بنسبة % من بین عدد كبیر من المستعمرات التي ظھرت على ھذا الوسط الغذاي ي Nutrient Agar الوسط عند حضنھا في 37 مº وكان اساس انتقاي ھا یعتمد على كونھا تحلل النشا وتكون ھالة شفافة واضحة حول منطقة النمو. نقلت ھذه المستعمرات على وسط Agar) (Nutrient وحضن في 37 مº. غربلة عزلات البكتریا على أساس كفاءتھا لا نتاج انزیم الامیلیز: الغربلة الاولیة : اخضعت العزلات البكتیریة التي تم انتقاي ھا من الخطوة السابقة الى عملیة غربلة اولیة للتعرف على مقدرتھا على تحلیل النشا كدلیل لانتاج الانزیمات على الوسط االمغذي للنشا. وحضنت في 37 مº مدة 4 ساعة ثم حسبت كل من قطر منطقة النمو (G ( وقطر منطقة تحلل النشا (Z) واستخرجت منھا قیمة Z/G التي عدت دلیلا على قابلیة العزلات على انتاج الانزیم ویوضح الجدول التالي كفاءة 36 عزلة على انتاج انزیمات الامیلیز بدلالة قیمة. Z/G ویلاحظ من الجدول تباین ھذه العزلات في تحلیل النشا تباینا واضحا مع تمیز سبع عزلات منھا وھي العزلات (AJ,AJ8,AJ,AJ8,AJ9,AJ7,AJ33) والتي تراوحت كفاءتھا في تحلیل النشا ما بین. 4. واخضعت لعملیة الغربلة الثانویة لانتقاء الاكفاء منھا في انتاج انزیم الامیلیز. وجدیر بالا شارة انھ وبغیة التا كد من منطقة تحلل النشا وتقدیر قطر ھذه المنطقة على وجھ الدقة اضیف كمیة من محلول الیود المخفف الى سطح الوسط لا ظھار ھذه المنطقة التي تمیزت عن المناطق الاخرى بلونھا الشفاف بخلاف بقیة اجزاء الوسط التي تلونت باللون الازرق. وكما مبین في (الجدول 5) جدول( 5 ): كفاءة عدد من عزلات البكتریا في انتاج انزیمات الامیلیز المقدرة على اساس نسبة قطر منطقة تحلل النشا (Z) الى قطر منطقة النمو (G)* Z/G رقم العزلة Z/G رقم العزلة.3 A3.5 A 0.88 A4.85 A.47 A5.04 A3.85 A6.0 A4.0 A7.33 A5 3.8 A8.3 A6.5 A9.5 A7 0.8 A0.0 A8. A.4 A9.06 A.05 A0. A3.75 A 0. A4 4. A * تمیزت جمیع العزلات با نھا موجبة لصبغة كرام مكونة للابواغ وعصویة. رقم العزلة A5 A6 A7 A8 A9 A30 A3 A3 A33 A34 A35 A36 Z/G الغربلة الثانویة: اجریت الغربلة الثانویة على العزلات السبعة التي رمز لھا من A الى A7 والتي وقع علیھا الاختیار من عملیة الغربلة الاولیة كعزلات ممیزة في تحلیل النشا في المزارع المغمورة با ستعمال الوسط الغذاي ي اذ حضنت الاوساط بعد تلقیحھا بالعزلات المذكورة في º 37 م مدة 4 ساعة قدرت الفعالیة والفعالیة النوعیة لانزیم الامیلیز في ھذه العزلات

6 ویوضح (الجدول 6) كفاءة العزلات السبعة على انتاج الانزیم اذ یلاحظ تفوق العزلة A4 على غیرھا من العزلات فقد بلغت الفعالیة 7.5 وحدة / مل وفعالیتھا النوعیة 45.3 وحدة/ ملغم. علیھ فقد وقع الاختیار على ھذه العزلة لا كمال الدراسة علیھا بعد اخضاعھا لمجموعة من فحوص التشخیص. تمیزت العزلة A4 انھا اعطت اعلى نسبھ تحلل اذ بلغت (4.) كما اعطت اعلى فعالیة نوعیة في المزارع المغمورة. تعد طریقة قیاس فعالیة الامیلیز اعتمادا على قابلیتھا التحلیلیة للنشا من اكثر الطراي ق استخداما لتحدید فعالیة ھذا الانزیم في طافي المزروع البكتیري والتي تعتمد على متابعھ تحرر السكریات المختزلة والكشف عنھا باستخدام كاشف 3,5 (DNSA).Dinitrosalicyclic acid وتعتمد شدة اللون فیھا على كمیة السكریات المختزلة المتحررة الناتجة من تحلیل الامیلیز لمواده الاساس (النشا ).( 9 al..(igarashi et al., 9; Lin et كما واستخدمت طریقھ (976) Bradford لتقدیر تركیز البروتین كونھا من الطراي ق الحساسة. واعتمادا على النتاي ج التي تم التوصل الیھا اختیرت العزلة A4 لا نتاج الانزیم ودراسة خواصھ في التجارب اللاحقة. جدول (6): كفاءة العزلات المنتخبة من الغربلة الاولیة في انتاج انزیم الامیلیز. العزلة A A A3 A4 A5 A6 A7 الفعالیة الانزیمیة الفعالیة النوعیة تشخیص العزلة با ستعمال جھاز الفایتك : Vitek اظھرت نتاي ج الفحوصات التشخیصیة للعزلة التي تم الحصول علیھا من الغربلة الكمیة كما مبین ادناه في الجدول وذلك با ستعمال جھاز Vitek Compact System والتي تبین من خلالھا احتمالیة ان تكون العزلة Bacillus subtilis بنسبة %96 وبذلك تم الاعتماد على ھذا الفحص وبھذه النسبة في تشخیص النوع وللتاكید تم اجراء التشخیص الجیني للعزلة للتا كد منھا بشكل قطعي على انھا تعود الى. Bacillus subtilis التشخیص الجزیي ي للعزلة قید الدراسة : اعتمد في ھذا النوع من التشخیص على جین 6S rrna حیث اجري في البدایة استخلاص للمادة الوراثیة للعزلة قید الدراسة (A4.(Bacillus subtillis وتم التا كد من نقاوتھا بقیاس نسبة امتصاصیتھا في 60 الى 80 نانومتر ثم اجري التضخیم بتقنیة PCR من خلال استخدام بوادئ خاصة بالجین 6S. rrna حیث اظھرت النتاي ج التي تم الحصول علیھا من الترحیل الكھرباي ي للجین المضخم وجود حزمة واحدة مما یدل على ارتباط البوادئ بالجین المستھدف كما في (الشكل ( وھو جین 6S rrna دون الاجزاء الاخرى من DNA المستخلص من العزلة قید الدراسة قدر الحجم الجزیي ي لناتج التضخیم حیث كان یبلغ 56 قاعدة ویذكر ان جین 6S rrna یستخدم بشكل ناجح في التمییز بین الانواع المختلفة من البكتریا ویعطي نتاي ج حاسمة في التشخیص (04) al.,.lakshmi et ویذكر ان الباحث استعمل تضخیم جین 6S rrna في تشخیص بكتریا Bacillus sp حیث اشار al., Hasan et (07) ا ىل ان حجم قطعة جین 6S rrna بلغت 08 زوج قاعدة بینما اشار (05), Bukhari Rehman& الى ان طول قطعھ جین 6S rrna التي قام بتضخیمھا من.B subtilis بلغت 500 زوج قاعدة.

7 Marker ج 6S rrna للع لة ق ال ارسة شكل (): نتاي ج الترحیل الكھرباي ي على ھلام الاكاروز والدلیل الحجمي Marker قاعدة نتروجینیة. الذي یتراوح بین كیلو اخذ ناتج PCR وارسل الى شركة Macrogen الكوریة 56 قاعدة وكما في (الجدول 7) لمعرفة تسلسل القواعد النتروجینیة وتبین انھ مكون من 3

8 عدد القواعد جدول (7): تتابع القواعد النتروجینیة لجین 6s RNA للعزلة A4. تتابعات القواعد النتروجینیة لجین 6S rrna 56 GCGGTCGTTTGACTGGGCTACTCCGGGAACCGGGGCTAATACCGGATGGT TGTTTGAACCGCAGGTTCAAACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTAC AGATGGACCCGCGGCGCATAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGG CAACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAG ACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATG GACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGAT CGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTACCGTTCGAATAGGGCGGT ACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGC CGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAG GGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCG GGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGA ATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGG CGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGG GAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTG CTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAG CACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGAC GGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGA AGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAATCCTAGAGATAGGACGT CCCCTTCGGGGGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTG TCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAG TTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGG AGGAAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCT ACACACGTGCTACAATGGACAGAACAAAGGGCACCGAAACCCCGAGGTTA ACCCATCCCACAAATCTGTTTTCAGTTCGGAACCCAATCTGGAAATCCAC CGGCGTGAAACTGGAAACCCTTTTAATCCCGGATAAACATGCCCCGGTGA AAATTCCGCCTCTCCCTAG اظھرت النتاي ج بعد تحلیلھا ببرنامج BLAST في المركز الوطني لمعلومات التقنیة الحیویة NCBI وبالمقارنة مع ما تتوفر بھ من معلومات ان ھناك تطابق وبنسبة % بین ھذه العزلة وبین سلالات من بكتریا.B subtilis المسجلة في NCBI كما مبین في (الجدول 8). وعلیھ عدت العزلة قید الدراسة عاي دة الى البكتریا.B subtilis حیث جاءت ھذه النتیجة مطابقة لاختبارات الفایتك ان التشخیص على المستوى الجزیي ي یعتبر من الطراي ق الحدیثة والتي استعملت من قبل العدید من الباحثین ) 06 al.,.(lakshmi et al., 04; Khajuria et al., 05; Shine et جدول (8): نسبة تطابق تتابعات القواعد النتروجینیة للعزلة A4 مع 0 سلالات بكتریا.B subtilis المسجلة في.NCBI رمز الوصول نسبة التطابق % السلالة Strain Identity Accession Bacillus subtilis MA-40 KX Bacillus subtilis MA-9 KX Bacillus subtilis M9(06b KU Bacillus subtilis St JN Bacillus subtilis JAM A JN Bacillus subtilis K9-9 JF Bacillus subtilis BAB-54 KR Bacillus subtilis 3 JN Bacillus subtilis TCCC JF Bacillus subtilis IICTSVMH3 FR

9 المصادر REFERENCES I. Abd-Elhalem, B. T., El-Sawy, M., Gamal, R. F., & Abou-Taleb, K. A. (05). Production of amylases from Bacillus amyloliquefaciens under submerged fermentation using some agro industrial by products. Annals of Agricultural Sciences, 60(), II. Abdullah, R., Shaheen, N. A. E. E. M. A., Iqtedar, M., Naz, S. H. A. G. U. F. T. A., & Iftikhar, T. (04). Optimization of cultural conditions for the production of alpha amylase by Aspergillus Niger (BTM-6) in solid state fermentation. Pak. J. Bot, 46(3), III. Adrio, J. L., & Demain, A. L. (04 ). Microbial enzymes: tools for biotechnological processes. Biomolecules, 4(), IV. Anonymous. (00). VITEK System Product Information. Durham, North Carolina / USA, -. V. Bukhari, D. A., & Rehman, A. (05). Purification and characterization of α-amylase from Bacillus subtilis isolated from local environment. Pakistan Journal of Zoology, 47(4), VI. Bradford, M. (976). A rapid and sensitive method for the quantitation of microorganism quantities of protein using the principles of protein dye binding. Anal. Biochem., 7, VII. Collee, G. J., Fraser, A. G., Marmion, B. P., & Simmons, A. (996). Practical and Microbiology 4 th ed., Vol. I, Churchill Livingstone. VIII. Dash, B. K., Rahman, M. M., & Sarker, P. K. (05). Molecular identification of a newly isolated Bacillus subtilis BI9 and optimization of production conditions for enhanced production of extracellular amylase. BioMed Research International,(-9). IX. Halket, G., Dinsdale, A. E., & Logan, N. A. (00). Evaluation of the VITEK BCL card for identification of Bacillus species and other aerobic endosporeformers. Letters in Applied Microbiology, 50(), 0-6. X. Hasan, M. M., Marzan, L. W., Hosna, A., Hakim, A., & Azad, A. K. (07). Optimization of some fermentation conditions for the production of extracellular amylases by using Chryseobacterium and Bacillus isolates from organic kitchen wastes. Journal of Genetic Engineering and Biotechnology, (-0). XI. Khajuria, V., Sharma, K., Slathia, P., Razdan, K., Singh, S., & Bijender K. B. (05). Production of a detergent-compatible alkaline protease from Bacillus cereus K-3, Journal Mater Environ Science. 6(8), XII. Lakshmi, B. K. M., Ratna, P. V., Devi, K. A., & Hemalatha, K. P. J. (04). Screening, optimization of production and partial characterization of alkaline protease from haloalkaliphilic Bacillus sp. International Journal of Research in Engineering and Technology. 3(), XIII. Lin, L. L., Hsu, W. H., & Chu, W. S. (997). A gene encoding for amylase from thermophilhc Bacillus sp. strain Ts-3 and it s expression in Escherichia coli. J. Appl. Microbiol., 8, XIV. Lin, L. L., Hsu, W. H., & Chu, W. S. (9). Production and properties of a raw starch degrading amylase from the thermophilic and al kaliphilic Bacillus sp. Ts-3. Biotechnol. Appl. Biochem., 8, XV. Ravindar, D. J., & Elangovan, N. (03). Molecular identification of amylase producing Bacillus subtilis and detection of optimal conditions. Journal of Pharmacy Research, 6(4),

10 XVI. Igarashi, K., Hatada, Y., Hagihara, H., Saeki, K., Takaiwa, M., Uemura, T., Ara, K., Ozaki, K., Kawai, S., Kobayashi, T., & Ito, S. (9). Enzymatic properties of a novel liquefying α-amylase from an alkalphilic Bacillus isolate and entire nucleation and amino acid sequence. Appl. Enviromen. Microbiol., 64(9), XVII. Sacchi, C. T., Whitney, A. M., Mayer, L. W., Morey, R., Steigerwalt, A., Boras, A., Weyant, R. S. & Tanja P. (00). Sequencing of 6 s rrna gene a rapid tool for identification of Bacillus anthracis. Emerging Infectious Diseases Journal. 8(0), 7-3. XVIII. Sambrook, J., & Russell, D. W. (00). Molecular Cloning, A Laboratory Manual. CSH Laboratory Press Cold Spring Harbor, New York, USA. XIX. Shine, K., Kanimozhi, K., Panneerselvam, A., Muthukumar C., & Thajuddin, N. (06). Production and optimization of alkaline protease by Bacillus cereus RS3 isolated from desert soil. International Journal of Advanced Research in Biological Sciences, 3(7), XX. Souza, P. M. D. (00). Application of microbial α -amylase in industry-a review. Brazilian Journal of Microbiology, 4(4), XXI. Teodoro, C. E. D. S., & Martins, M. L. L. (000). Culture conditions for the production of thermostable amylase by Bacillus sp. Brazilian Journal of Microbiology, 3(4), -30. XXII. Whitaker, J. R., & Bernard, R. A. (97). Experiment For Introduction To Enzymology. The Wiber Press Davis. 6