المجلة العربية للعلوم الصيدلية مجلة اتحاد الجامعات العربية مجلة علمية دورية محكمة تصدر عن الجمعية العلمية لكليات الصيدلة في الوطن العربي كلية الصيدلة

النسخ

1 المجلة العربية للعلوم الصيدلية مجلة اتحاد الجامعات العربية مجلة علمية دورية محكمة تصدر عن الجمعية العلمية لكليات الصيدلة في الوطن العربي كلية الصيدلة جامعة دمشق 2013 الرقم المتسلسل الموحد الدولي ISSN 2013 ) المجلد الرابع العدد التاسع ربيع اآلخر آذار )مارس السنة السابعة عشر 1

2 .6 شروط النشر في المجلة العربية للعلوم الصيدلية 1. أن يكون البحث أصيال لم يسبق نشره في مجلة أخرى و أن ال تتجاوز عدد صفحاته /10/ صفحات بما في ذلك األشكال الحواشي و المصادر. 2. يمكن أن يقبل البحث باحدى اللغات العربية االنكليزية أو الفرنسية و تفضل اللغة العربية علما أن هيئة تحرير المجلة ستقوم بترجمة البحوث الواردة بغير اللغة العربية. 3. أن يكتب على ورقة مستقلة عنوان البحث اسم صاحبه و لقبه باللغة العربية و صفته العلمية مع ذكر المركز العلمي أو الجامعة التي يعمل بها الباحث. 4. ترسل ثالث نسخ مطبوعة باآللة الكاتبة أو على الحاسوب و يفضل األخير بحيث تتوافق كتابة البحث مع نظام (PC) باستخدام منسق الكلمات (6.M).S Word و أن يرسل القرص مع ثالث نسخ مطبوعة. 5. يتبع في كتابة البحث المخطط التالي. الملخص : Abstract ال يتجاوز 150 كلمة باللغة العربية و أيضا باللغة االنكليزية أو الفرنسية و يحدد فيه ما آل اليه البحث و الجديد فيه يتبع بالكلمات المفتاح. Key words الموضوع : Subject و يتألف مما يلي: المقدمة Introduction المواد و الطرائق : Materias and Methods يذكر فيه مصادر المواد األولية و األجهزة المستخدمة و خطة العمل المتبعة النتائج Results المناقشة Discussion و أخيرا االستنتاجات. Conclusions المراجع : References و هي تضم ذكر المراجع وفقا للترتيب األلفبائي ألسماء المؤلفين على أن يتبع التسلسل التالي: 1- Baron L.J.R. et al. HPLC and GLC Analysis of the Triglyceride Composition of Bovine, Ovine and Caprine Milk, Journal of Dairy Research, 57, , بالنسبة للكتب: اسم المؤلف أو مجموعة المؤلفين عنوان الكتاب الصفحات دار النشر مكان النشر السنة. اذا كان الكتاب باللغة العربية يذكر ذلك. مثال: 1- Salle B.L. Le lait de femme. Ricour C. et al. (éd): Traité de nutrition pédiatrique, , Maloine, Paris, تنطبق هذه التعليمات على المراجع العربية. ترسل المرفقات على ورقة مستقلة على أن ترسم الخطوط البيانية بالحبر األسود. أما بالنسبة للصور الفوتوغرافية فيرجى ارسال الصور األصلية و ليس نسخة عنها و تتعهد المجلة باعادتها الى صاحبها. ان اعالم المجلة عن وصول البحوث ال يعني حتمية النشر ذلك أن هذه البحوث ستعرض قبل نشرها على محكمين من ذوي االختصاص و سوف يبلغ صاحب البحث بما توصل اليه المحكمون ة هيئة التحرير. ترسل كافة المراسالت باسم األستاذ الدكتور جمعه الزهوري رئيس تحرير المجلة العربية للعلوم الصيدلية كلية الصيدلة جامعة دمشق دمشق الجمهورية العربية السورية dean.pharm@damasuniv.edu.sy 2

3 هيئة تحرير : األمين العام للجمعية العلمية لكليات الصيدلة في الوطن العربي أ. د. جمعه الزهوري عميد كلية الصيدلة بجامعة دمشق سورية رئيسا عميد كلية الصيدلة الجامعة األردنية األردن أ. د. طالل أحمد أبورجيع عميد كلية الصيدلة جامعة عين شمس مصر أ. د. عبد الناصر بدوي سنجاب عميد كلية الصيدلة و العلوم الصحية جامعة عجمان أ. د. عبد العظيم أحمد علي عميدة كلية الصيدلة الجامعة اللبنانية أ. د. ماري تويني عميد كلية الصيدلة الجامعة السورية الخاصة أ. د. عادل نوفل الهيئة االستشارية أ. د. نانسي هاكوز أ. د. ماري تويني أ. د. عبد الرزاق عبد السالم العوزي أ. د. سالمة عبد الكريم بوخطوه أ. د. سعاد يوسف الكارب أ. د. منال مصطفى قنديل أ. د. راجية علي طه أ. د. أسامة عبد المتعال منصور أ. د. ماجد علوان الشربجي أ. د. سليمان عبد العزيز الجبور أ. د. نصر الدين حسين عبد الهادي أ. د. عدي عصام عريضة أ. د. غسان محمد أبو شيخة أ. د. سليمة علي بن غزي أمانة التحرير د. رانيا ديوب عميدة كلية الصيدلة جامعة الزرقاء عميدة كلية الصيدلة الجامعة اللبنانية عميد كلية الصيدلة جامعة طرابلس ممثلة عميد كلية الصيدلة جامعة بنغازي عميدة كلية الصيدلة جامعة كرري وكيل الدراسات العليا بكلية الصيدلة جامعة القاهرة عميدة كلية الصيدلة جامعة األزهر بنات عميد كلية الصيدلة جامعة األزهر بنين عميد كلية الصيدلة جامعة اليمن عميد كلية الصيدلة جامعة األزهر غزه عميد كلية الصيدلة جامعة الرباط الوطني عميد كلية العلوم الصحية الجامعة األمريكية في مادبا عميد كلية الصيدلة جامعة الزيتونة األردنية عميدة كلية الصيدلة الجامعة الليبية الدولية للعلوم الطبية كلية الصيدلة جامعة دمشق سورية المقر الدائم: كلية الصيدلة جامعة دمشق 3

4 شارك في تعريب البحوث المنشورة في هذا العدد األستاذ الدكتور جمعه الزهوري الدكتورة سمر الزير أستاذ في قسم الكيمياء التحليلية و الغذائية قسم األدوية و السموم 4

5 بسم هللا الرحمن الرحيم لمحة عن الجمعية العلمية لكليات الصيدلة في الوطن العربي و أنشطتها تأسست " الجمعية العلمية لكليات الصيدلة في الوطن العربي" أثناء انعقاد المؤتمر التأسيسي لعمداء كليات الصيدلة في الوطن العربي بدعوة من كلية الصيدلة جامعة دمشق في شهر كانون الثاني /ديسمبر/ 1996 و قد حضر المؤتمر ثالثون عميد كلية يمثلون األقطار العربية التالية: األردن الجزائر السودان سورية العراق فلسطين الكويت لبنان مصر. مهام الجمعية: تتولى الجمعية القيام بالمهام التالية: 1- العمل على انشاء مجلس لالختصاصات الصيدالنية العربية. 2- العمل على تنسيق و تطوير المناهج الدراسية في كليات الصيدلة في الوطن العربي. 3- تشجيع التعاون في مجاالت التأليف و التعريب و النشر. 4- اصدار مجلة علمية محكمة متخصصة باسم " المجلة العربية للعلوم الصيدلية " مجلة اتحاد الجامعات العربية. 5- العمل على اصدار معجم للمصطلحات الصيدالنية العلمية باللغة العربية و االنكليزية و الفرنسية. 6- تقديم المشورة و الخبرة في وضع األسس العلمية النشاء كليات جديدة للصيدلة في األقطار العربية. 7- التنسيق بين المراكز العلمية الخدمية و البحثية في كليات الصيدلة في الوطن العربي. 8 ع- قد الندوات و المؤتمرات العلمية المتخصصة و عقد مؤتمر علمي كل سنة تناقش فيه أهم المستجدات في العلوم الصيدالنية. 9- تشجيع تبادل الخبرات التدريسية و التدريبية و البحثية بين كليات الصيدلة في الوطن العربي. 10- تشجيع التنسيق في مجال الدراسات العليا من حيث المواضيع المشتركة و االشراف المشترك. 11- تشجيع الباحثين للقيام ببحوث علمية مشتركة بين كليات الصيدلة في الوطن العربي و األجنبية. 12- اصدار دليل شامل لكليات الصيدلة و كوادرها التعليمية في الوطن العربي. 13- العمل على اجراء تقويم لكليات الصيدلة في الوطن العربي و بشكل اختياري بالتعاون مع اتحاد الجامعات العربية و الجمعيات و المنظمات الدولية ذات العالقة. 14- العمل على توثيق الصالت بين الجمعية و مثيالتها في دول العالم. عضوية الجمعية: تكون عضوية الجمعية مفتوحة لكافة كليات الصيدلة في الوطن العربي و يشترط لقبول العضوية تحقيق الشروط التالية مجتمعة : 1- أن تكون الكلية مانحة لدرجة االجازة )بكالوريوس( في الصيدلة أو في العلوم الصيدالنية أو ما يعادلها من جامعة معترف بها من الدولة المانحة للشهادة. 2- أن ال تقل فترة الدراسة فيها عن أربع سنوات أو عن عدد الساعات المعتمدة عالميا بعد شهادة الثانوية العامة أو ما يعادلها. 3- أن يكون خريجها مؤهال لمزاولة مهنة الصيدلة في بلده. 5

6 من أنشطة الجمعية العلمية لكليات الصيدلة في الوطن العربي 1- تم اصدار العدد التأسيسي من المجلة العربية للعلوم الصيدلية في عام 1996 و تم حتى اآلن اصدار المجلد األول و الثاني من هذه المجلة و هذا هو العدد الثامن من المجلد الرابع و قد تم اصدار العدد الخاص األول و الذي تضمن بعض البحوث التي ألقيت في المؤتمر العلمي الثاني للجمعية. 2- عقدت الجمعية المؤتمرات العلمية التالية: األول في جامعة العلوم و التكنولوجيا األردنية من 1997/10/ الثاني في الجامعة اللبنانية األميركية من 1998/10/ الثالث في جامعة طنطا )مصر( من 1999/10/ الرابع في كلية الصيدلة بالمنستير )تونس( من 2000/11/ الخامس في الجامعة األردنية من 2001/10/ السادس في جامعة عجمان من 2002/10/ السابع في جامعة القديس يوسف )لبنان( من 2003/12/6-4. الثامن في جامعة القاهرة من 2004/12/ التاسع في جامعة الملك سعود من 2005/12/ العاشر في جامعة الكويت من 2006/12/ الحادي عشر في جامعة الفاتح )ليبيا( من 2007/12/9-7. الثاني عشر في جامعة حلب )سورية( من 2008/11/7-5. الثالث عشر في جامعة مصر للعلوم و التكنولوجيا )مصر( من 28-25/ أيار- مايو/ الرابع عشر في جامعة عجمان للعلوم و التكنولوجيا )االمارات( من 9-7/ شباط فبراير/ الخامس عشر في كلية الصيدلة- الجامعة األردنية من 2012/11/ سيعقد المؤتمر العلمي السادس عشر للجمعية في رحاب كلية الصيدلة- جامعة بنغازي ليبيا. 6

7 Page Contents الصفحة 9 افتتاحية العدد المحتوى 11 A comparative study for evaluation the quality parameters of topical creams produced in Syria containing steroids during shelf-life. دراسة تقويمية مقارنة لمعايير جودة الكريمات الموضعية المصنعة في سورية الحاوية على ستيروئيدات خالل فترة العمر على الرف. 11 Al Mardini MA. and Arous B. (Syria) محمد عامر المارديني و باسمة عروس )سورية( 21 Determination of Selenium in Supplement Food Using Spectrophotometry with a new Digestion Method. تحديد السيلينيوم ببعض المتممات الغذائية بمقياس الطيف الضوئي باستخدام طريقة هضم جديدة. 21 Katmto L. and Al Zouhouri J. (Syria) لينة كتمتو و جمعه الزهوري )سورية( 31 Separation And Assay of Metronidazole and Diloxanide Furoate in Tablets by RP-HPLC. فصل ومقايسة مزيج من ميترونيدازول وديلوكسانيد فورات في األقراص باستخدام االستشراب السائل رفيع اإلنجاز بالطور العكوس. 31 Al Halabi Z., Al Khayat A. Haidar S. (Syria) زيان الحلبي محمد عمار الخياط سامر حيدر )سورية( 41 A promising extract suppresses cellular proliferation during the initiation phase of chemically induced colon carcinogenesis. خالصة واعدة تثبط التكاثر الخلوي خالل طور التحريض في تسرطن القولون الم حد ث كيميائيا. 41 وصفي عصفور سوسن الماضي لينا الحفار )سورية( (Syria) Asfour W., Al Madi S., Al Haffar L. 55 Studying the accelerated photostability of ciprofloxacin and lomefloxacin in tablets and eye drops. دراسة الثبات الضوئي المسرع لسيبروفلوكساسين و لوميفلوكساسين في المضغوطات و القطرات العينية. 55 Mando Z. and Al Mardini MA. (Syria) زينب مندو و محمد عامر المارديني )سورية( 65 Isolation, Proliferation, and Phenotyping of Cancer Stem Cells from Primary Breast Cancers: Establishing A Model for Evaluating the Response to Chemotherapeutic Agents. عزل خاليا ثديي ة جذعية سرطانية من سرطانات ثدي أولي ة وتكثيرها وتنميطها: تأسيس نموذج لتقييم االستجابة ألدوية المعالجة الكيميائية. 65 Yousef L., Salamoun M., Kassem I., Al Jamali M. (Syria) لمى يوسف ماهر سلمون عصام قاسم مجد الجمالي )سورية( 79 Spectroscopic method for the determination of Dorzolamide hydrochlorid and timolol maleate in it dosage form / Eye drops. معايرة كل من الدورزوالميد هيدروكلوريد والتيمولول ماليات في شكلها الصيدالني /قطرة عينية/ باستخدام مقياس الطيف الضوئي. 79 Murad R. and Al Zouhouri J. (Syria) رشاد مراد و جمعه الزهوري )سورية( 7

8 87 Study In Vitro Study of the Efficacy of some Antibiotic in Preventing the adherence of some aerobic bacteria Isolated from Tonsil's Core. دراسة في الزجاج لفعالية بعض الصادات الحيوية في منع التصاق بعض الجراثيم الهوائية المعزولة من لب اللوزتين. 87 Kaddo AG. And Ammori M. (Syria) عبدالغني كدو و مصطفى العموري )سورية( 105 A Study for Vitamin C Stability in some kinds of Baby Food. 105 دراسة ثباتية فيتامين C في بعض أغذية األطفال. Deeb M. and Salamy M. (Syria) منال ديب و ميسم سالمي )سورية( 117 Determination of Methoxsalen in Pharmaceutical Dosage Forms using Capillary Gas Chromatography. تحديد الميتوكسالين في المستحضرات الصيدالنية باستخدام االستشراب الغازي الشعري. 117 Sakur AA. and Manaa MF. (Syria) أمير الحاج صكر و محمد فراس مناع )سورية( 125 Comparative study between Captopril and Lisinopril in their Potential protective role in 5-flurouracil-induced Toxicity in Experimental animals. دراسة مقارنة بين الكابتوبريل والليزينوبريل في دورهما الوقائي المحتمل من السمية الناجمة عن 5 -فلورويوراسيل في حيوانات التجربة. 125 Ibraheem DA. and Al Adhal A. (Yemen) عدنان األدهل و دعاء أنور ابراهيم )اليمن( 8

9 بسم هللا الرحمن الرحيم افتتاحية العدد الزمالء األعزاء على قدر أهل العزم تأتي العزائم وعلى قدر أهل الكرام تأتي المكارم نعم أتى هذا العدد من المجلة العربية للعلوم الصيدلية ليتو ج بجهد ث لة من باحثين نجباء قد عزموا على خوض غمار البحث والغوص في مكنوناته فأتت أبحاثهم مرآة صادقة لجهود حثيثة ال بد وأنها ستلقى من يعيها ويثمنها. وفي غمرة الظروف الصعبة فإنه بحق لحدث عظيم أن تبقى هذه المجلة تبصر النور وتواظب على إصدارها حتى في أحلك األوقات ظلمة لتكون خير دليل على الجهود المتضافرة التي آلت إال أن تمضي قدما وتكون نبراسا يقتدى به ويحتذى. وإنني في هذا المجال ألتقدم بجزيل الشكر لألستاذ الدكتور محمد عامر المارديني رئيس جامعة دمشق ولألستاذ الدكتور سلطان أبو عرابي العدوان األمين العام التحاد الجامعات العربية على دعمهم المستمر لنا. والله من وراء القصد دمشق في آذار )مارس( 2013 األمين العام للجمعية العلمية لكليات الصيدلة في الوطن العربي رئيس هيئة تحرير المجلة العربية للعلوم الصيدلية عميد كلية الصيدلة جامعة دمشق األستاذ الدكتور جمعه الزهوري 9

10

11 دراسة تقويمية مقارنة لمعايير جودة الكريمات الموضعية المصنعة في سورية الحاوية على ستيروئيدات خالل فترة العمر على الرف A comparative study for evaluation the quality parameters of topical creams produced in Syria containing steroids during shelf-life الملخص Abstract محمد عامر المارديني و باسمة عروس قسم الكيمياء الصيدلية و المراقبة الدوائية- كلية الصيدلة جامعة دمشق سورية يهدف البحث إلى القيام بدراسة تقويمية مقارنة لمعايير جودة الكريمات الموضعية المصنعة محليا الحاوية على بعض الستيروئيدات خالل فترة العمر على الرف والتحقق من مدى تطابق العمر على الرف المعنون مع العمر على الرف الحقيقي من خالل مجموعة من اختبارات الجودة التي طبقت على 47 عينة من هذه الكريمات. حيث تم تقييم الصفات الظاهرية للعينات فحص العينات بالمجهر قياس اللزوجة تعيين قيم ph وقياس الناقلية الكهربائية. كذلك تمت مقايسة المادة الفعالة باستخدام HPLC حسب الطرائق الواردة في.USP 30 كما تم تطبيق اختبار تدوير درجة الحرارة. وبالنتيجة تبين أن هذه الكريمات تتمتع بمعايير الجودة التي تتطلبها دساتير األدوية كما تبين أن الستيروئيدات المستخدمة كمواد فعالة بقيت محافظة على ثباتها الكيميائي ضمن الكريم حتى بعد انتهاء فترة الصالحية المعنونة أما المشكلة المشاهدة فقد ظهرت بالثبات الفيزيائي للكريم مما يبين أهمية إعادة النظر بدراسات الثبات الفيزيائي أثناء تطوير هذه الصيغ وكذلك أهمية اتباع الممارسات الجيدة في نقل وتوزيع وتخزين هذه الكريمات واتباع الشروط التي تضمن حماية المستحضر من التخرب. This research aims to make a comparative study for evaluation the quality parameters of topical creams locally produced containing steroids during shelf-life, and to ensure the compatibility of real shelf-life with labeled shelf-life through a set of quality tests which were applied to 47 samples of these creams. Creams were evaluated through appearance, microscopic test, viscosity measurement, determination of ph value, electrical conductivity measurement, and the active substances have been assayed by using HPLC according to assay methods mentioned in USP 30. The temperature cycling was applied also. As a conclusion these creams have the quality parameters required by the Pharmacopoeia, and steroids used as an active substance still maintain their chemical stability in creams even after their labeled expiry period, but the problem observed in the physical stability of cream, in which demonstrate the importance of reconsider the physical stability studies during the development of these formulations, also to follow good practice in transporting, distribution and storage of these creams and to follow the conditions which ensure protection of products from degradation. الكلمات المفتاح :Key words كريم Cream جودة Quality العمر على الرف Shelf-life الستيروئيدات Steroids اللزوجة Viscosity درجة الباهاء ph الناقلية الكهربائية Electrical Conductivity المقدمة Introduction يمنح العمر على الرف )المعنون على عبوة الدواء( المريض ثقة بأن المستحضر الدوائي سوف يحافظ على ذاتيته فعاليته جودته و نقاوته خالل فترة صالحية المستحضر الدوائي.( 5 ) تصنف الكريمات كنمط من المستحلبات وبالتالي فهي أنظمة قد تتعرض لتغيرات فيزيائية كيميائية و جرثومية خالل التصنيع النقل التخزين و االستخدام مما يسبب تغيرات في الكريم( 4 ). المجلد الرابع العدد التاسع جمادى األول 1434 آذار )مارس(

12 وعموما قد تخزن الكريمات في الصيدليات لفترات تصل لسنتين و ربما أكثر ضمن فترة صالحيتها في هذه الحالة هناك تتالي لعدة فصول مناخية وبسبب عدم توفر شروط حفظ مستمرة )حرارة ورطوبة مناسبتين على مدار الساعة( يعتبرهذا تهديد حقيقي لثبات الدواء (10). من هنا تظهر أهمية القيام بدراسة تقويمية لصيغ الكريمات الموضعية و منها الحاوية على الستيروئيدات خالل فترة العمر على الرف والتحقق من مدى تطابق العمر على الرف المعنون مع العمر على الرف الحقيقي وذلك من خالل مجموعة من اختبارات الجودة التي طبقت على 47 عينة من الكريمات المصنعة في سورية الحاوية على الستيروئيدات التالية:الديكساميتازون الموميتازون البيتاميتازون الكلوبيتازول البيكلوميتازون الهيدروكورتيزون والتريامسينولون. فقد تم الحصول على عينات من الكريمات في بداية فترة الصالحية وعينات خالل فترة الصالحية و عينات منتهية الصالحية. تعد االختبارات التالية من أهم معايير جودة الكريمات: مراقبة الصفات الظاهرية للكريم أثناء خروجه من األنبوب حيث يالحظ نسيج Texture الكريم بالعين المجردة كما يراقب مدى تجانس اللون أو حصول لمعان نتيجة تبلور المادة الفعالة أو تقشد ما نتيجة لتخرب حصل على المستحلب أو تجمع للطور الزيتي (3). االختبار المجهري الذي يسمح بمالحظة تجانس توزع األطوار احتمال تشكل البلورات أو وجود جسيمات غريبة( 3 ). اختبار اللزوجة Viscosity الذي يسمح بقياس اللزوجة بوصف سلوك تدفق المادة بشكل كمي بهدف ضمان الجودة وقياس مدى سهولة تحرر المنتج من األنابيب وقياس قابلية االنتشار)المد )spreadabilit وفهم طبيعة أو المبدأ األساسي لهذا النظام( 11 ). اختبارpH وهو أحد المؤشرات على الثبات كما أن تعيينه مهم للحكم على إمكانية تطبيق الكريم و تقبل الجسم له( 14 ). Electrical اختبار الناقلية الكهربائية Conductivity وهو من المعايير المعبرة جدا عن الثبات فتغير قيم الناقلية عن القيم البدئية ارتفاعا أو انخفاضا يعبر عن بدء تخرب( 3 ). مقايسة المادة الفعالة Active Substance حيث يجب أن يحوي الكريم مقدار المادة الفعالة الموسومة على العبوة. لذلك تتم مقايسة المادة الفعالة باالعتماد على مبدأ االستشراب السائل رفيع اإلنجاز HPLC-.(13) Assays اختبار مقاومة الحرارة( 12,9,8,7,6 ) أو ما يسمى اختبار األرجحة Swing test أو تدوير درجة الحرارة Temperature Cycling حيث إن دراسة تأثير تفاوت درجة الحرارة يجب أن يؤخذ بعين االعتبار خاصة ما يالئم شروط شحن و تخزين الكريمات. المواد و األجهزة المستخدمة جرى الحصول على المعياريات التالية: Dexamethasone, Dexamethasone Sodium Beclometasone dipropionate, Phosphate Betamethasone Valerate, Betamethasone International Chemical من Dipropionate Reference Substances WHO,Stockholm, Mometasone و الحصول على المعياريات Sweden furoate, Clobetasol propionate من شركة دومنا للصناعة الدوائية و المعياري Triamcinolone acetonide من شركة العالمية للصناعة الدوائية )يونيفارما( و المعياري Hydrocortisone من مختبرات إميسا للصناعة الدوائية و المعياريات Testosterone Propyl 4-hydroxybenzoate propionate من.SIGMA-ALDRICH و تم الحصول على ايتانول ميتانول أسيتونتريل ايزو أوكتان من Panreac وMerck و تم الحصول على أمونيوم دي هيدروجين أورتوفوسفات فوسفات أحادية الصوديوم فوسفات ثنائية المجلد الرابع العدد التاسع جمادى األول 1434 آذار )مارس(

13 ت- الصوديوم يوديد البوتاسيوم 4,2,2 تري ميتيل البنتان من.Sigma-Aldrich أما عينات الكريم فتم الحصول عليها من الشركات الدوائية المصنعة لها و من الصيدليات المختلفة وقد كان اختيار العينات مشروطا بضرورة أن يكون هناك عينات ببداية فترة الصالحية a و عينات خالل فترة b و عينات منتهية الصالحية e. أما الرمزc فأعطي للعينات التي خضعت الختبار مقاومة الحرارة. تم استخدام جهاز تفريق لوني سائل رفيع االنجاز HPLC لشركة Hitachi/Japan مقياسpH لشركة Metrohm ConductivityMeter لشركة Jenway مقياس اللزوجة خاص بالكريمات لشركة MYR Viscotic مجهر استقطابي لشركة. Olympus الطرائق :Methods -تم اختبار كل الكريمات بالمجهر االستقطابي بعد التلوين بأحمر السودان الثالث red) (Sudan III و هو ملون خاص بتلوين الطور الزيتي علما أن الكريمات المدروسة هي من نمط زيت/ماء. -تم قياس اللزوجة للعينات a,b,e,c مع المحافظة على درجة حرارة.25 C ±0.1 C -تم تحديد قيمة ph بتمديد الكريم في الماء المقطر )حيث تم وزن 5 غ 0.01± غ من الكريم ثم أضيف له 45 غ من الماء ثنائي التقطير( ثم جرى القياس بمقياس ph.(1) م قياس الناقلية الكهربائية بتمديد الكريم بالماء المقطر ثم جرى القياس بمقياس الناقلية. -أجريت مقايسات المواد الفعالة باستخدام جهاز HPLC حيث تم تطبيق طرق المقايسة الواردة في دستور األدوية األمريكيUSP30 باستخدام عمود C18 أبعاده 4.6mm 25cm والكاشف UV- Vis حيث تم تحضير عينات الكريم باستخالص الكريم بالمحل المذكور في دستور األدوية USP30 )إما ميتانول ايتانول أو أسيتونتريل( ثم يضاف العياري الداخلي وفقUSP30 و تثفل العينات ثم يؤخذ من السائل الطافي و يحقن في جهاز. HPLC كما تم التحقق من مصدوقية هذه الطرائق وفق متطلبات USP30.(13) -و كجزء من اختبارات اإلجهاد اختبار مقاومة Stress tests تم تطبيق الحرارة حيث تم تعريض عينات الكريم لثالث دورات حرارية مؤلفة كل منها من يومين بدرجة حرارة البراد C (8-2) متبوعة بيومين بدرجة حرارة 40Cثم تم تقييم ثبات الكريمات بإعادة إجراء االختبارات السابقة. ولمقارنة النتائج تمت معالجتها احصائيا ( 2 ) باستخدام التوزيع الطبيعي Z Test ألن حجم العينة 30 و ذلك باستخدام برنامج ال. Microsoft Excel وقد أعطيت العينات التي ببداية فترة الصالحية الرمز a والعينات التي ضمن فترة الصالحية الرمز b و العينات منتهية الصالحية الرمز e. أما الرمزc فأعطي للعينات التي خضعت الختبار مقاومة الحرارة. النتائج :Results من مراقبة الصفات الظاهرية للكريمات المدروسة لم يالحظ أي رائحة غريبة أو تغير باللون ألي من هذه الكريمات لكن لوحظ انفصال لألطوارفي الكريمات c أما بالنسبة للقوام فلم يالحظ تغيرعلى قوام العينات.a,b,e في الكريمات a باالختبار المجهري لوحظ عدم انفصال األطوار التي ببداية فترة الصالحية و بداية في انفصال األطوار تزداد في الكريمات التي في السنة الثالثة من صالحيتها و كذلك الكريمات e منتهية الصالحية أما الكريمات انفصال c التي أخضعت الختبار مقاومة الحرارة أبدت واضح في األطوار كما هو واضح في المقاطع الفوتوغرافية المأخوذة من عدسة المجهر في الشكل رقم :(1) المجلد الرابع العدد التاسع جمادى األول 1434 آذار )مارس(

14 العينة رقم 13c العينة رقم 13b العينة رقم 13a العينة رقم 35e العينة رقم 43c الشكل رقم (1) المقاطع الفوتوغرافية لبعض عينات الكريم الخاضعة لالختبار المجهري العينة رقم 35c ) نتائج قياس اللزوجة موضحة بالشكل رقم (2): حيث تراوحت قيم اللزوجة المقاسة بين ) mpas a b c e الشكل رقم )2( مخطط بياني لتغيرالنسبة المئوية للزوجة العينات b,c,e عن النسبة المئوية للزوجة العينات a التي اعتبرت قيمة لزوجتها %100 نتائج قياس ph موضحة في الشكل رقم (3): تتراوح قيم ph المسجلة بين المجلد الرابع العدد التاسع جمادى األول 1434 آذار )مارس(

15 a b c e الشكل رقم (3) مخطط بياني لتغيرالنسبة المئوية لقيم ph اعتبرت نسبة ph لها %100 العينات b,c,e عن النسبة المئوية لقيم ph التي العينات a نتائج قياس الناقلية الكهربائية موضحة في الشكل رقم ميكروسيمنس/سم (4): تتراوح قيم الناقلية المسجلة بين( ) a b c e الشكل رقم (4) مخطط بياني لتغيرالنسبة المئوية للناقلية الكهربائية للعينات b,c,eعن النسبة المئوية للناقلية الكهربائية للعينات a التي اعتبرت قيمة ناقليتها %100 نتائج مقايسة المادة الفعالة موضحة في الشكل رقم )5(: نتيجة المفترض احتوائها على 1 ملغ من الستيروئيد. مقايسة المادة الفعالة ب ملغ/ أخيذة من الكريم التي من a b c e الشكل رقم (5) مخطط بياني لنتائج مقايسة المادة الفعالة المجلد الرابع العدد التاسع جمادى األول 1434 آذار )مارس(

16 فيها وتراوحت النسبة المئوية لالنخفاض بين )2.58-.%)49.70 عند مقارنة قيم اللزوجة للعينات e مع قيم اللزوجة للعينات a إن النسبة األكبر من العينات e قد انخفضت قيم اللزوجة فيها وتراوحت نسبة االنخفاض بين ) (%. بينما هناك عينتان ارتفعت المناقشة : Discussion اللزوجة: عند مقارنة قيم اللزوجة للعينات للعينات b a مع قيم اللزوجة تبين أن النسبة األكبر من العينات b قد انخفضت قيم اللزوجة فيها وتراوحت النسبة المئوية لالنخفاض بين ) (%. بينما هناك 11 ارتفعت فيها قيم اللزوجة عما كانت في العينات عينة a وتراوحت النسبة المئوية لالرتفاع بين )0.68-.%)4.76 عند مقارنة قيم اللزوجة للعينات للعينات c إن العينات a c مع قيم اللزوجة قد انخفضت قيم اللزوجة فيهما قيم اللزوجة عما كانت عليه في العينات a وكانت النسبة المئوية لالرتفاع ) (%. العينة رقم 4 هي العينة الوحيدة التي تصلبت بعد اختبار مقاومة الحرارة ولم يعد باإلمكان قياس لزوجتها. و نتائج الدراسة اإلحصائية موضحة في الجدول رقم :)1( الجدول رقم )1( نتائج الدراسة اإلحصائية الختبار اللزوجة الجدول رقم )1( مقارنة العينات التي ضمن فترة الصالحية b مع العينات التي ببداية فترة الصالحية a % % التفاوت مهمل و الفارق ظاهري مقارنة العينات الخاضعة الختبار مقاومة الحرارة c مع العينات a % % التفاوت غير مهمل و الفارق جوهري مقارنة العينات المنتهية الصالحية e مع العينات التي ببداية فترة الصالحية a % % التفاوت مهمل و الفارق ظاهري Average SD RSD% Z 0 Z التقييم نجد من الجدول السابق أن تفاوت قيم اللزوجة بين العينات e b a تفاوت يدل على تخرب. هو تفاوت مهمل بينما تفاوت قيم اللزوجة بين a و c هو 10.77(% بينما تراوحت النسبة المئوية لالرتفاع بين.%) ( عند مقارنة قيم ph العينات e مع قيم ph العينات a إن النسبة األكبر من العينات e لم تتغير قيم ph فيها حيث سجلت أعلى نسبة مئوية لالنخفاض %5.35 وأعلى نسبة مئوية لالرتفاع %7.56.والنتائج موضحة في الجدول رقم )2(: : ph عند مقارنة قيم ph العينات b مع قيم ph العينات a إن النسبة األكبر من العينات b لم تتغير قيم ph فيها حيث سجلت أعلى نسبة مئوية لالنخفاض %1.97 وأعلى نسبة مئوية لالرتفاع %3.50. عند مقارنة قيم ph العينات c مع قيم ph العينات a تراوحت النسبة المئوية لالنخفاض بين )1.28- المجلد الرابع العدد التاسع جمادى األول 1434 آذار )مارس(

17 الجدول رقم )2( نتائج الدراسة اإلحصائية الختبار ph الجدول رقم) 2 ( %Average Average SD RSD% مقارنة العينات التي ضمن فترة الصالحية b مع العينات التي ببداية فترة الصالحية a % % التفاوت مهمل و الفارق ظاهري مقارنة العينات الخاضعة الختبار مقاومة الحرارة c مع العينات a % % التفاوت غير مهمل و الفارق جوهري مقارنة العينات المنتهية الصالحية e مع العينات التي ببداية فترة الصالحية a % % التفاوت مهمل و الفارق ظاهري Z 0 Z التقييم نجد من الجدول السابق أن تفاوت قيم ph بين العينات e b a يدل على تخرب. هو تفاوت مهمل بينما تفاوت قيم ph بين a و c هوتفاوت بين) (% بينما تراوحت النسبة المئوية لالرتفاع بين ) (%. عند مقارنة قيم الناقلية للعينات e مع قيم الناقلية للعينات a سجلت أعلى نسبة مئوية لالنخفاض %23.57 وأعلى نسبة مئوية لالرتفاع %8.31. ونتائج الدراسة اإلحصائية موضحة في الجدول رقم :)3( الناقلية الكهربائية: مع قيم الناقلية b عند مقارنة قيم الناقلية للعينات للعينات a إن النسبة األكبر من العينات b لم تتغير قيم الناقلية فيها حيث سجلت أعلى نسبة مئوية وأعلى نسبة مئوية لالرتفاع %10.66 لالنخفاض. %15.31 عند مقارنة قيم الناقلية للعينات c مع قيم الناقلية للعينات a تراوحت النسبة المئوية لالنخفاض الجدول رقم )3( نتائج الدراسة اإلحصائية الختبار الناقلية الكهربائية الجدول رقم) 3 ( مقارنة العينات التي ضمن فترة الصالحية b مع العينات التي ببداية فترة الصالحية a مقارنة العينات الخاضعة الختبار مقاومة الحرارة c مع العينات a مقارنة العينات المنتهية الصالحية e مع العينات التي ببداية فترة الصالحية a % % التفاوت مهمل و الفارق ظاهري % % التفاوت غير مهمل و الفارق جوهري % % التفاوت مهمل و الفارق ظاهري %Average Average SD RSD% Z 0 Z التقييم نجد من الجدول السابق أن تفاوت قيم الناقلية بين العينات e b a يدل على تخرب. هو تفاوت مهمل بينما تفاوت قيم الناقلية بين a و c هوتفاوت المجلد الرابع العدد التاسع جمادى األول 1434 آذار )مارس(

18 مقايسة المادة الفعالة: لقد تبين من خالل دراسة نتائج مقايسة المادة الفعالة أن كل العينات المختبرة كانت محققة لمتطلبات دساتير األدوية سواء كانت العينات في بداية أو خالل أو منتهية الصالحية )العينات )a,b,e و كذلك العينات الخاضعة الختبار مقاومة الحرارة. c لكن لوحظ أن العينات c نتيجة تعرضها لتفاوت بدرجة الحرارة قد فقدت تجانسها حيث نجد أن تركيز المادة الفعالة قد تفاوت كثيرا بين بداية و منتصف و نهاية عبوة الكريم على خالف ما وجدناه في العينات a و. b بينما وسطي هذه التراكيز لم يعبر على عدم التجانس. وهذا ينطبق على بعض العينات e منتهية الصالحية التي فقدت أيضا تجانسها. بلغ المتوسط الحسابي لتركيز المادة الفعالة في عينات الكريم التي ببداية فترة صالحيتها a القيمة % من القيمة المعنونة. عند مقارنة قيم تركيز المادة الفعالة للعينات b مع قيم التركيز للعينات a إن النسبة األكبر من العينات b لم تتغير قيم تركيز المادة الفعالة فيها حيث سجلت أعلى نسبة مئوية لالنخفاض %10.19 وأعلى نسبة مئوية لالرتفاع % عند مقارنة قيم تركيز المادة الفعالة للعينات c مع قيم التركيز للعينات a لوحظ انخفاض بسيط جدا لمتوسط قيم تركيز المادة الفعالة في العينات c حيث سجلت أعلى نسبة مئوية لالنخفاض %27.35 وأعلى نسبة مئوية لالرتفاع % عند مقارنة قيم تركيز المادة الفعالة للعينات e مع قيم تركيز المادة الفعالة للعينات a لوحظ انخفاض بسيط جدا لمتوسط قيم تركيز المادة الفعالة في العينات e و لكنه أكبر من االنخفاض في متوسط قيم تركيز المادة الفعالة في العينات c حيث سجلت أعلى نسبة مئوية لالنخفاض %18.71 وأعلى نسبة مئوية لالرتفاع. %6.32 و نتائج الدراسة اإلحصائية موضحة في الجدول رقم )4(: الجدول رقم )4( نتائج الدراسة اإلحصائية لمقايسة المادة الفعالة الجدول رقم) 4 ( مقارنة العينات التي ضمن فترة الصالحية b مع العينات التي ببداية فترة الصالحية a مقارنة العينات الخاضعة الختبار مقاومة الحرارة c مع العينات a مقارنة العينات المنتهية الصالحية e مع العينات التي ببداية فترة الصالحية a % % التفاوت مهمل و الفارق ظاهري % % التفاوت مهمل و الفارق ظاهري % % التفاوت مهمل و الفارق ظاهري %Average Average SD RSD% Z 0 Z التقييم نجد من الجدول السابق أن هناك تفاوتا في قيم تركيز المادة الفعالة بين العينات c e b a لكنه تفاوت مهمل ال يدل على تخرب. االستنتاجات :Conclusions الكريمات تتمتع بمعايير الجودة التي تتطلبها دساتير األدوية تمت الدراسة على الكريمات الموضعية الحاوية على من حيث تركيز المادة الفعالة و ph و من حيث القوام الستيروئيدات و المصنعة محليا و لقد تبين أن هذه المجلد الرابع العدد التاسع جمادى األول 1434 آذار )مارس(

19 المناسب الذي يسمح بسهولة خروج الكريم من عبوته و المد و التطبيق وبالتالي سهولة االستخدام لدى المريض. و لقد تبين أن الستيروئيدات المختلفة و باختالف استراتها )الديكساميتازون الموميتازون البيتاميتازون الكلوبيتازول البيكلوميتازون الهيدروكورتيزون التريامسينولون( تعتبر مركبات كيميائية ثابتة ضمن الكريم و بقيت محافظة على ثباتها الكيميائي خالل فترة صالحية الدواء الممتدة من سنوات حيث 3-2 بقي تركيز المادة الفعالة موافق للتركيز المعنون على العبوة و ضمن حدود المقايسة كما لم تظهر نواتج تخرب لهذه المواد خالل فترة العمر على الرف. إال أن المشكلة الحقيقية تظهر في الثبات الفيزيائي للكريم حيث أن معظم الكريمات التي تعرضت النفصال في األطوار تبقى عاجزة عن أداء وظيفتها نظرا لحدوث تخرب مما يمنع استعمالها. و لقد تبين من دراسة المؤشرات على الثبات الفيزيائي و هي ph و الناقلية و اللزوجة أن معظم الكريمات التي ظهر عدم ثباتها الفيزيائي هي كريمات تعرضت لتفاوت في درجات الحرارة ولما كان الثبات الفيزيائي للمستحضرات الدوائية هو جزء متكامل من ثبات الدواء و متطلبات الجودة و يمكن أن يكون ذو تأثير كامن ليس فقط على مظهر الدواء و لكن أيضا على عمل وفعالية و أمان المستحضر الدوائي لذا كان من الضروري أن يحدد العمر على الرف للكريمات )لألنظمة المبعثرة( باالعتماد على الثبات الكيميائي لمكوناتها والثبات الفيزيائي للنظام كامل. بشكل وبالنتيجة فإن العمر على الرف الحقيقي كان مطابقا للعمر على الرف المعنون على عبوات الكريم في أغلب العينات التي تم حفظها ضمن الشروط المعنونة و لم تتعرض لتفاوت بدرجة الحرارة. تمت متابعة الدراسة باختبار معايير مقايسة الحوافظ و االختبارات الميكروبيولوجية في دراسة قيد النشر. المراجع :References المواصفة الخاصة بمستحضرات التجميل-كريمات -1 الجلد حسب هيئة المواصفات و المقاييس العربية السورية وزارة الصناعة رقم /1011/ تاريخ 1992 ناصر آغا ع. حميدان ح. اإلحصاء الحيوي -2 منشورات جامعة دمشق كلية الصيدلة المارديني م.ع. المراقبة الدوائية منشورات جامعة -3 دمشق كلية الصيدلة Brummer R. Rheology Essentials of Cosmetic and Food Emulsions ( ) Chow S.C., Jones B., Liu J.P.,Peace K.E. Statistical Design and Analysis of Stability Studies. Chapman Hall/CRC Biostatistics Series, FDA, Guidance for Industry. Stability testing of drug substances and drug products. June Haynes J.D. Worldwide virtual temperatures for product stability testing, G. Pharm. Sci.,60(6),927, Huynh K. Handbook of Stability Testing in Pharmaceutical Development, Springer, July Huynh K. Pharmaceutical Stability Testing to Support Global Markets, DE USA, Springer ( ), Kumar P. A., Kumar K.S., Shamima A., Farhana J., Rasheda A., Nusr N. A comparative real time study of stability of cream and ointment formulations of clobetasol propionate in drug stores of Bangladesh. Publication: Advances in Natural and Applied Sciences. Science and Technology, May Lieberman H.A., Rieger M.M., and Banker G.S. Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems, Volume1, Second Edition, Revised and Expanded, ( ), المجلد الرابع العدد التاسع جمادى األول 1434 آذار )مارس(

20 13- United Stated Pharmacopoeia USP30/ National Formulary NF25, United Stated Pharmacopoeia USP31/ National Formulary NF26, Sarfaraz K.N. Handbook of Pharmaceutical Manufacturing Formulations Semisolid Products. volume 4, ( ), المجلد الرابع العدد التاسع جمادى األول 1434 آذار )مارس(

21 تحديد السيلينيوم ببعض المتممات الغذائية بمقياس الطيف الضوئي باستخدام طريقة هضم جديدة Determination of Selenium in Supplement Food Using Spectrophotometry with a new Digestion Method الملخص Abstract لينة كتمتو و جمعه الزهوري قسم الكيمياء التحليلية و الغذائية- كلية الصيدلة جامعة دمشق سورية طبقنا طريقة هضم جديدة لمعايرة السيلينيوم بالمتممات الغذائية بمقياس الطيف الضوئي باستخدام كاشف 3 3 ثنائي أمينو بنزيدين هيدروكلورايد. استخدمنا طريقة هضم جديدة الستخالص السيلينيوم بشكله الرباعي التكافؤ ( 4+ )Se من المتممات الغذائية لمعايرته مباشرة بمقياس الطيف الضوئي. تعتمد طريقة الهضم على استخدام الحمض لهضم العينات في نظام مغلق باستخدام درجات حرارة مصدرها أشعة مايكروية ضمن نظام حراري مضبوط. بعد هضم العينات وحصولنا على السيلينيوم بشكله الرباعي تمت معايرته بمقياس الطيف الضوئي باستخدام كاشف 3,3 ثنائي أمينو بنزيدين هيدروكلورايد وهي طريقة لونية سهلة تتمتع بحساسية ونوعية جيدة لتحديد السيلينوم بكميات زهيدة. يعتمد مبدأ الطريقة اللونية على تشكيل معقد بيازسيلينول ثابت أصفر اللون ناتج عن تفاعل السيلينيوم الرباعي ( 4+ )Se مع 3,3 ثنائي أمينو بنزيدين هيدروكلورايد وبعد ذلك يستخلص المعقد بواسطة التولوين ويعاير لونيا عند طول موجة 420 نم وهي طول موجة االمتصاص األعظمي التي أبداها المعقد وقد كانت العالقة مابين االمتصاص والتركيز عالقة طردية ضمن المجال ) (. μg/ml درسنا الشروط المثلى لتشكل معقد البيازسيلينول من درجة حموضة الوسط الحرارة الزمن تركيز كاشف 3,3 ثنائي أمينو بنزيدين هيدروكلورايد نوع محل االستخالص وتأثير تسلسل االضافات. درسنا تكرارية ومردود طريقة الهضم باألشعة الماكروية وجدنا أن طريقة الهضم المستخدمة تتمتع بتكرارية جيدة ومردود استخالص عالي حيث كانت النسبة المئوية للمردود 99.5% بانحراف معياري نسبي %1.62±. وتم التحقق من صالحية الطريقة اللونية المستخدمة حيث بينت النتائج أنها ذات تكرارية مقبولة وحساسية جيدة لمعايرة السيلينيوم الرباعي في المتممات الغذائية. An a new digestion method for selenium determination in supplement food with spectrophotometric method using 3,3 Diaminobenzidine Hydrochloride. New digestion method was used for selenium (IV) extraction from food supplements for direct determination with spectrophotometric method. The digestion method provides acid digestion of the sample in a closed vessel device using temperature control microwave heating. After sample digestion and selenium (IV) occur,spectrophotometry method applied using 3,3 Diaminobenzedine hydrochloride. Simple, sensitive and specific spectrophotometric method for the determination of selenium at trace levels. The method based on the formation of stable yellow-colored piazselenol complex by reaction of Se (IV) with 3, 3'-diaminobenzidine hydrochloride, which is then extracted in toluene and detected spectroscopically at 434 nm. Optimization conditions (ph Effect, thermo effect, time effect, reagent DABH concentration effect extract solvent effect, reagent consequence effect) for piazselenol complex formation were studied. The microwave digestion method was found to be repeatability and satisfactory recovery from the spiked samples of standard Se (IV).The spectrophotometric method was validated and found to be suitable for estimation of Se (IV) species in food supplement. المجلد الرابع العدد التاسع جمادى األول 1434 آذار )مارس(

22 الكلمات المفتاح :Key words السيلينيوم Selenium الهضم باألشعة الماكروية Microwave Digestion مقياس الطيف الضوئي Spectrophotomery 3,3 ثنائي أمينو بنزيدين هيدروكلورايد 3,3 DABH بيازسيلينول Piazselenol المتممات الغذائية.Food Supplement المقدمة Introduction اكتشف عنصر السيلينوم من قبل العالم السويدي جون برزيليوس.J BERZELIUS عام 1817 لدى دراسته لمخلفات غرف الرصاص المستخدمة في صناعة حمض الكبريت )1(. يرمز للسيلينيوم ب Se موقعه في الجدول الدوري في المجموعة VI A في العمود السادس )بين التيليريوم Te والكبريت S( والصف الرابع )بين البروم Br والزرنيخ )As عدده الذري 34 وكتلته الذرية نادرا ما يوجد بشكله الحر في الطبيعة ومن خواصه الفيزيائية أنه عنصر صلب درجة انصهاره 221 C ودرجة غليانه 685 C وكثافته 4.28 g/cm3 وينحل في الماء بشكل طفيف.بنية بلوراته سداسية الزوايا واألضالع أرقام أكسدته في وسط شديد الحموضة كما يلي: )3,2( يعتبر السيلينيوم من المعادن الزهيدة الهامة حيث يلعب دروا هاما كعامل مضاد للسرطان من خالل تحفيز تشكيل خاليا الدم البيضاء WBCs التي تقوم بتدمير الخاليا السرطانية )4(. يستخدم جسم اإلنسان السيلينيوم إلنتاج أنزيم الغلوتاتيون بيروكسيدازperoxydase (5) Glutathione والذي يعمل بالمشاركة مع فيتامين E في حماية األغشية الخلوية من الجذور الحرة الناتجة عن التفاعالت اإلستقالبية. باإلضافة لذلك فهو يدعم الجهاز المناعي من خالل زيادة نشاط وعدد خاليا الدم البيضاء كما يقي من األمراض القلبية الوعائية السكتة الدماغية األمراض االلتهابية التهاب المفاصل الروماتيدي الساد كما أنه مهم للحفاظ على وظيفة طبيعية للغدة الدرقية. )7,6( إن عوز السيلينيوم يؤدي لإلصابة بمرض كيشان Keshan disease وهو مرض فيروسي مميت أهم أعراضه ضعف بوظيفة القلب ووذمة رئوية. إن التراكيز المرتفعة من السيلينيوم بالدم )أعلى من 100( μg/dl تؤدي للتسمم بالسيلينيوم.Selenosis وغالبا ما تظهر األعراض السريرية للتسمم بالسيلينيوم عند اإلنسان عندما يزيد التعرض المزمن عن 900 مكغ. أهم أعراض التسمم بالسيلينيوم هي: اضطرابات هضمية معوية تساقط الشعر بقع بيضاء على األظافر منعكسات قد تصل بالنهاية للشلل. أذية عصبية من خدر وفرط (8) يعد السيلينيوم من المعادن الزهيدة الهامة في المتممات الغذائية حيث استخدمت عدة طرق تحليلية لمعايرة السيلينيوم بالمتممات الغذائية المياه التربة شعر اإلنسان والحليب منها مقياس الطيف الضوئي باالمتصاص الذري (AAS) (9) مقياس الفلورة المرئي (9) Fluorometry مقياس الطيف الضوئي (10,9) كما استخدمت طرق تحليلية أخرى كمطيافية الكتلة المدمجة مع البالزما التحريضية (ICP- MS) plankton لمعايرة السيلينيوم في العوالق البحرية marine )11) والمصل )12( serum والبندق.)13( كما استخدمت تقنية الكروماتوغرافيا السائلة عالية األداء (HPLC) لمعايرة السيلينيوم في أغذية األطفال )14( والبندق )13( و أوراق الشاي )15(. هدف البحث: تهدف هذه الدراسة لتطبيق طريقة هضم جديدة باستخدام األشعة الماكروية الستخالص معدن السيلينيوم من عينات المتممات الغذائية لمعايرته مباشرة بمقياس الطيف الضوئي باستخدام كاشف 3,3 ثنائي أمينوبنزيدين هيدروكلورايد واستخدام هذه الطريقة لمراقبة تراكيز السيلينيوم المعدني في المتممات الغذائية. المواد والطرائق :Materiala and Methods األجهزة المستخدمة: جهاز الهضم باألشعة الماكروية Microwave digestion صنع شركة Anton Paar األلمانية: -1 المجلد الرابع العدد التاسع جمادى األول 1434 آذار )مارس(

23 يستخدم لمعالجة وتهضيم العينات يمكن برمجته ببرنامج معالجة مناسب حسب نوع العينة. Spectrophotometer مقياس الطيف الضوئي: اليابانية HITACHI صنع شركة UV-Vis. model U Sartorius ميزان تحليلي لوزن العينات من شركة األلمانية نوع TE64 حساسيته 0.1 ملغ. ph مقياس لدرجة الحموضة.)Quartz Cell( خاليا كوارتز سعة flasks) (Volumetric بالونات معياري,100,50 25,10 مل ممصات معيارية Pipette( )Volumetric سعة 10, 5, 2, 1 مل. 2- المواد والمذيبات المستخدمة: تتصف جميع المواد المستخدمة في هذا البحث بأنها من النوع التحليلي عالي النقاوة. 3,3 ثنائي أمينو بنزيدين رباعي هيدروكلورايد (NH2)2C6H3C6H3(NH2)2.4HCl من شركة Sigma- Aldrich سيلينيت الصوديوم )99%(Na2SeO3 من شركة Sigma Aldrich ماء مضاعف التقطير Double Distilled Water من إنتاج شركة Sigma Aldrich التولوين Toluen من شركة Merck الكلوروفورم Chloroform من شركة Merck البنزن Benzene من شركة Merck رابع كلور الفحم )CCl4( Carbon tetrachloride من شركة Merck محلول النشادر المركز 25% )NH3( من شركة Merck ماء أوكسيجيني 30% )H2O2) من شركة Merck كبريتات الصوديوم الالمائية Na2SO4 من شركة Scharlau إيديدات الصوديوم EDTA-2Na من شركة.Scharlau استخدمت في هذا البحث بعض المتممات الغذائية المحلية من إنتاج الشركات الدوائية في سوريا وهي: فيتاسيلين مضغوطات )عينة A( من إنتاج شركة ابن الهيثم للصناعة الدوائية حيث كمية السيلينيوم في المستحضر 100μg( / بالمضغوطة( و سوبراتيك مضغوطات )عينة B( من إنتاج شركة المتوسط للصناعة الدوائية حيث كمية السيلينيوم في المستحضر 55μg( / بالمضغوطة(. -3 تحضير المحاليل Preparation( :)Solution محلول كاشف هيدروكلورايد: 3,3 ثنائي أمينو بنزيدين رباعي يحضر بحل 0.25 غ من المادة في 50 مل أسيتون ويحفظ في عبوة عاتمة اللون )يجب أن يكون حديثا (. محلول عياري أم Stock Solution بتركيز 1000 مكغ/مل من السيلينيوم: المحلول محضرا من السيلينيوم يحضر بحل غ من سيلينيت الصوديوم Na2SeO3 في 30 مل من الماء المضاعف التقطير ويتم التحريك حتى تمام االنحالل ثم ينقل المحلول الناتج لبالون معاير سعة 100 مل ويكمل الحجم بالماء المضاعف التقطير حتى خط العيار. محلول إيديدات الصوديوم %5: يحضر بحل 2.5 غ من إيديدات الصوديوم في 20 مل من الماء المضاعف التقطير ثم ينقل المحلول الناتج لبالون معاير سعة 50 مل ويكمل الحجم بالماء المضاعف التقطير حتى خط العيار. المزيج السلفوكرومي ) K2Cr2O7 :(H2SO4 - يحضر بحل 6 غ من ثنائي كرومات البوتاسيوم K2Cr2O7 في 50 مل من الماء المضاعف التقطير ويتم التحريك حتى تمام االنحالل ثم ينقل لوعاء إشباع سعة 250 مل بعد ذلك 100 يضاف مل من حمض الكبريت المركز 98% H2SO4 العيار. ثم يكم ل بالماء المضاعف التقطير حتى خط المجلد الرابع العدد التاسع جمادى األول 1434 آذار )مارس(

24 -4 تم وزن تحضير العينات: مضغوطة من العينة 20 بعد وزنها وحساب A الوزن الوسطي للمضغوطة يتم سحقها جيدا ويؤخذ وزنة تكافئ 50 ملغ من العينة A. تحضر العينة B بنفس طريقة تحضير العينة A. -5 هضم العينات: استخدمنا جهاز الهضم باألشعة الماكروية Microwave Digestion لهضم العينات وتحضير محاليل العينات. يعتمد مبدأ عمل الجهاز على استخدام الحمض لهضم العينات في نظام مغلق وباستخدام حرارة وضغط وفق برنامج مضبوط. طريقة العمل تحضير محاليل العينات : توضع وزنات العينات المحضرة في أنابيب الهضم Digestion tubes ونضيف لكل منها 6 مل من حمض األزوت الكثيف و 2 مل من الماء األوكسجيني وننتظر مدة 15 دقيقة ثم نغلق أنابيب الهضم بشكل جيد ونضعها في جهاز الهضم وتبدأ المعالجة الحرارية وفق البرنامج التالي: Ramp 20 min Power 700 W, Hold 15 min, Fan 1 Ramp 0 min Power 300 W, Hold 15 min, Fan 1 Ramp 0 min Power 0 W, Hold 20 min, Fan 2 يفتح جهاز الميكرويف ثم يتم فتح )تنفيس( أنبوب الهضم 15 ويترك مدة الهضم في دورق عياري سعة المضاعف التقطير حتى خط العيار. وبذلك أصبح لدينا محلول العينة دقيقة. وبعدها يتم تفريغ محتوى أنبوب 100 A مل ويمدد بالماء جاهز ويحتوي على السلينيوم المعدني الحر بتركيز نظري قدره 0.53 مكغ/مل ومحلول العينة B بتركيز نظري وقدره 0.28 مكغ / مل. يحتوي على السيلينيوم المعدني الحر 6- معايرة السيلينيوم بمقياس الطيف الضوئي باستخدام كاشف 3,3 ثنائي أمينو بنزيدين هيدروكلورايد: يحضر محلول عياري ممدد من السيلينيوم بتركيز 10 مكغ/مل وذلك بأخذ 1 مل من المحلول العياري األم للسيلينيوم stock solution توضع في بالون معاير سعة 1000 )تركيزه 100 مكغ/مل( مل وتمدد بالماء المضاعف التقطير لخط العيار. تضبط حموضة المحلول الناتج بواسطة حمض الكبريت المركز لتصبح = ph ± يحضر محلول عياري ممدد من السيلينيوم بتركيز 10 مكغ/مل وذلك بأخذ مل من 1 للسيلينيوم توضع في بالون معاير سعة المحلول العياري األم مل وتمدد 100 بالماء المضاعف التقطير لخط العيار. تضبط حموضة المحلول الناتج بواسطة حمض الكبريت المركز لتصبح ph.1.5 ±0.3 = يضاف إلى كل من بالونات السلسلة 0.5 مل من كاشف 3,3 ثنائي أمينو بنزيدين هيدروكلورايد (DABH) ويسخن المزيج لمدة 20 دقيقة ثم تضبط حموضة الوسط بواسطة النشادر المركر لتصبح =ph 1.8 ± بعد ذلك يتم استخالص المعقد الملون في حبابة اإلبانة 10 بواسطة مل من التولوين ثم تمرر طبقة التولوين الحاوية على المعقد الملون على كبريتات الصوديوم الالمائية للتجفيف. تعامل محاليل العينات) A B( و بنفس طريقة معاملة السلسلة العيارية للسيلينيوم. ويتم تحضير الشاهد بنفس طريقة تحضير بالونات السلسلة العيارية ولكن باستبدال محلول السيلينيوم العياري بالماء المضاعف التقطير. النتائج والمناقشة: تم التوصل في هذا البحث إلى إيجاد طريقة سهلة سريعة اقتصادية باستخدام جهاز الهضم باألشعة الماكروية الستخالص السيلينيوم المعدني بشكله الحر ومن ثم معايرته بشكل مباشر بمقياس الطيف الضوئي باستخدام كاشف 3,3 ثنائي أمينو بنزيدين هيدروكلورايد ألول مرة في تحديد السيلينيوم المعدني بشكله الحر وفي اثنين من المتممات الغذائية الشائعة االستخدام وهي على شكل مضغوطات ووضع الشروط المثلى للتحليل وتم التحقق من موثوقية الطريقة وصالحيتها. ودرسنا الشروط المثلى المجلد الرابع العدد التاسع جمادى األول 1434 آذار )مارس(

25 العيارية ثالث مرات وحساب وسطي اإلمتصاصيات عند كل تركيز ثم رسم الخط البياني لهذا االمتصاص وتم حساب قيمة مربع معامل اإلرتباط (correlation coefficient) R 2 للتحقق من وجود عالقة ارتباط بين التراكيز وقيم االمتصاص. وتم تحديد معادلة االرتداد الخطي Equation) (Liner Regression كما هو موضح بالشكل )1(. لمختلف العوامل المؤثرة في تشكيل معقد بيازسيلينول )Se-DAB( Piazselenol من درجة حموضة الوسط الحرارة الزمن تركيز كاشف 3,3 ثنائي أمينو بنزيدين هيدروكلورايد نوع محل االستخالص وتأثير تسلسل االضافات. - نتائج قياس محاليل السلسلة العيارية: تمت قراءة إمتصاصية كل تركيز من تراكيز الساسلسة الش كل( 1 (: معادلة االرتداد الخطي للطريقة المدروسة حددت العوامل التحليلية للطريقة المطبقة ولخصت النتائج في الجدول )1( حيث أعطيت قيم كل من المجال الخطي ومعادلة الخط المستقيم ومربع معامل االرتباط وحد القياس الكمي وحد الكشف. وكانت دقة الطريقة التحليلية جيدة ويتجلى ذلك في القيم المنخفضة لالنحراف المعياري النسبي المحسوبة على أساس تحليل ثالث مكررات وهذا ما توضحه النتائج المعروضة في الجدول )2(. وتشير القيم المرتفعة لالسترجاعية إلى مضبوطية الطريقة التحليلية حيث كانت قيم االسترداد ضمن مجال 98.75% - 102% وبقيم انحراف معياري نسبي ال تتجاوز %2. وهذا ما توضحه النتائج المعروضة في الجدول )3(. الجدول )1( العوامل التحليلية للطريقة المطبقة القيمة المعامل 420 n.m طول موجة االمتصاص األعظمي ʎmax المجال الخطي )مكغ/مل( Y=0.012X+0.77 معادلة االنحدار معامل االرتباط حد الكشف )مكغ/مل( LOD حد القياس الكمي )مكغ/مل( LOQ 25 المجلد الرابع العدد التاسع جمادى األول 1434 آذار )مارس( 2013

26 الجدول )2( تقييم دقة الطريقة التحليلية Se +4 (μg/ml) االنحراف المعياري المردود % الكمية المكتشفة الكمية المأخوذة % % % % % % % الجدول )3( تقييم مضبوطية الطريقة التحليلية االنحراف المعياري النسبي % Se +4 (μg/ml) التركيز العملي a التركيز النظري المردود % % % % 0.28 a حسب التركيز العملي اعتمادا على ثالثة مكررات لكل تركيز. - نتائج قياس محاليل العينات: طبقت الطريقة التحليلية لتحديد السيلينيوم الرباعي في +4 Se )4( نتائج تحديد السيلينيوم 4+ Se في عينات المتممات المتممات الغذائية التجارية )مضغوطات(. يظهر الجدول الغذائية. المجلد الرابع العدد التاسع جمادى األول 1434 آذار )مارس(

27 Absorbance Absorbance الجدول )4( تحديد السيلينيوم النسبة المئوية للمردود كمية % Se +4 بالمتممات الغذائية التجارية السيلينيوم المكتشفة )μg) كمية السيلينيوم المضافة )μg) الكمية المصرح عنها )μg) المتمم الغذائي Supratech (Tablets) Vitaselen (Tablets) ± ± % 99.6% رابع كلور الكربون البنزن( وأخيرا تأثير تسلسل اإلضافات. بناءا على النتائج التي ظهرت معنا فإن الشروط الالزم تطبيقها لتشكل المعقد وإلجراء القياسات الطيفية هي: 1- درجة ال ph المثلى لتشكل المعقد Se-DAB هي 1.5 ± 0.3.الشكل )2( 70 درجة 2- الحرارة المثلى لتشكيل المعقد هي 0 C مئوية. الشكل )3( تحديد الشروط المثلى لمختلف العوامل المؤثرة 1- Se-( Piazselenol معقد بيازسيلينول في تشكيل :)DAB درسنا العوامل المؤثرة في تشكيل معقد ملون ثابت بين Se +4 وثنائي أمينو بنزيدين هيدروكلورايد. وذلك لتحديد الشروط المثلى من أجل التحديد الطيفي لهذه الشاردة حيث درسنا تأثير كل من ph تركيز ثنائي أمينو بنزيدين الوسط درجة الحرارة الزمن هيدروكلورايد DABH نوع محل االستخالص )حيث استخدمنا: الكلوروفورم التولوين T, ºC ph الش كل( 2 (: تأثير درجة ال ph على تشكل المعقد Se-DAB 3- الزمن األمثل لتشكيل المعقد عند الدرجة 70 ºC هي 20 دقيقة. الشكل )4( 4- التركيز األمثل من كاشف 3,3 ثنائي أمينو بنزيدين هيدروكلورايد لتشكل المعقد Se-DAB هو.5mg/ml وذلك ألنه بالتراكيز المنخفضة تكون كمية الش كل( 3 (: تأثير درجة الحرارة في امتصاصية المعقد.Se-DAB الكاشف غير كافية لتشكيل المعقد وبالتراكيز المرتفعة يحصل تداخل. الشكل )5( 5- المحل الذي أعطي أعلى امتصاصية للمعقد عند طول موجة االمتصاص األعظمي هو التولوين. الجدول )5( المجلد الرابع العدد التاسع جمادى األول 1434 آذار )مارس(

28 Absorbance Absorbance 6- اتباع تسلسل إضافة إضافة محلول السيلينيوم محلول كاشف 3,3 ثنائي أمينو بنزيدين هيدروكلورايد DABH تسخين الناتج ضبط الحموضة استخالص المعقد تجفيف الناتج الش كل( 4 (: تغيرات االمتصاص مع الزمن Time (min) تركيز كاشف دي أمينو بنزيدين مكغ/مل الش كل( 5 (: تأثير تركيز تركيز كاشف 3,3 ثنائي أمينو بنزيدين هيدروكلورايد DABH على تشكل المعقد Se-DABH الجدول )5( تأثير نوع محل االستخالص محل االستخالص الكلوروفورم التولوين رابع كلور الكربون البنزن 420 االمتصاص nm عند المجلد الرابع العدد التاسع جمادى األول 1434 آذار )مارس(

29 in institutionalized elderly patients: arandomized controlled trial. Arch. Intern, Med, 159 (7): , Koller L.D. and Exon J.H. The two faces of selenium-deficiency and toxicity are similar in animals and man. Can.J. Vet. Res, 50: , The United States Pharmacopeia. USP- 24/NF-19.United Stetes Pharmacopeial Convention, Inc.: Washington,D.C., Revanasiddappa, H.D. and Kumar T.N. A facil spectrophotometric method for determination of selenium. Anal.Sci, 17 (11): , Arslan Z. and Erstas N. Determination of trace elements in marine plankton by inductively coupled plasma mass spectrometry (ICP-MS). Fresenius J.Anal. Chem. 336 (3): , Forrer R. and Wenker C.H. Concentration of 17 trace elements in serum and whole blood of plains viscachas (Lagostomus maximus) by ICP-MS, their reference ranges, and their relation to cataract. Biol. Trace Elem. Res., 81 (1):47-62, Kannamkumarath S.S., Wrobel K. and Vonderheide A. HPLC-ICP-MS determination of selenium distribution and speciation in different type of nut. Anal. Bioanal. Chem., 373 (6): , Bratter P. and Blasco I.N. Speciation as an analytical aid in trace element research in infant nutrition. Analyst, 123 (5): , Yoshida M., Kimura Y. and Abe M. Quantitative evaluation of selenium contained in tea by high performance liquid chromatography. J. Nutr. Sci. Vitaminol, 47 (3): , الخالصة: توصلنا في هذا البحث لطريقة هضم جديدة الستخالص السيلينيوم المعدني بشكله الحر من المتممات الغذائية طبقت ألول مرة في سوريا تمكنا من خاللها معايرة السيلينوم مباشرة بطريقة مقياس الطيف الضوئي باستخدام 3,3 Se +4 كاشف ثنائي أمينو بنزيدين هيدروكلورايد. وتصلح الطريقة المطبقة لالستخدام في التحاليل الروتينية للسيلينيوم في المتممات الغذائية ويمكن أن تكون هذه الطريقة References Se +4 مفيدة في ضبط ومراقبة الجودة. 1- Brown Jr. and Robert D. Mineral Commodity Survey Selenium. United States Geological Survey, Retrieved, Minaev V.S. and Kalugin V.V. Structural and Phase Transformations in Condensed Selenium. Journal of Optoelectronics and Advanced Materials, 7 (4) : , Reilly C. Selenium in food and health.2nd ed. New York, Springer, Rayman M.P. Selenium in cancer prevention: a review of the evidence and mechanism of action. Proc Nutr Soc. 64 (4):527-42, Hatanaka N. and Nakaden H. Selenium kinetics and changes in glutathione peroxidase plementation with selenite. Nutrition, 16 (1): 22-26, Douillet C. and Bost M. Effect of selenium and vitamin E supplementation on lipid abnormalities in plasma, aorta and adipose tissue of Zucker rats. Biol. Trace Elem. Res, 65 (3): , Girodon F. and Galan P. Impact of trace elemens and vitamin supplementation on immunity and infections المجلد الرابع العدد التاسع جمادى األول 1434 آذار )مارس(

30 المجلد الرابع العدد التاسع جمادى األول 1434 آذار )مارس(

31 المجلة العربية للعلوم الصيدلية- مجلة اتحاد الجامعات العربية الملخص Abstract فصل ومقايسة مزيج من ميترونيدازول وديلوكسانيد فورات في األقراص باستخدام االستشراب السائل رفيع اإلنجاز بالطور العكوس Separation And Assay of Metronidazole and Diloxanide Furoate in Tablets by RP-HPLC. زيان الحلبي محمد عمار الخياط سامر حيدر قسم الكيمياء الصيدلية و المراقبة الدوائية- كلية الصيدلة جامعة دمشق سورية تم تطوير طريقة تحليلية تعتمد على الكروماتوغرافيا السائلة رفيعة اإلنجاز بالطور العكوس لفصل ومقايسة مزيج من ميترونيدازول وديلوكسانيد فورات في األقراص. جرى الفصل باستخدام عمود 5 µm )250mm 4.6mm( C8 وطور متحرك مؤلف من اسيتونتريل :ماء بنسبة v/v)35:65( ومعدل تدفق 1 مل/د وباستخدام مكشاف UV عند طول موجة 230 نانومتر. كان زمنا احتباس ميترونيدازول و ديلوكسانيد فورات 3.17 و 5.18 دقيقة على الترتيب. كما كانت قيمتا حد الكشف لميترونيدازول وديلوكسانيد فورات مكغ/مل وقيمتا حد الكم مكغ/ مل على الترتيب. جرى التحقق من مصدوقية الطريقة من أجل المضبوطية الدقة االنتقائية والمتانة كانت الخطية ضمن المجال مكغ/مل لميترونيدازول و مكغ/مل لديلوكسانيد فورات وكانت قيم االستعادة للمضبوطية % لكل من ميترونيدازول وديلوكسانيد فورات على الترتيب. A reverse phase high performance liquid chromatography method was developed for the determination of diloxanide furoate and metronidazole in tablets. The separation was achieved using C8 column (4.6 mm 250 mm) 5 µm and mobile phase acetonitrite:water (65:35) v/v, at a flow rate of 1ml/min. Detection was carried out using UV at 230 nm. The retention times of metronidazole and diloxanide furoate were 3.17 and 5.18 min. The detection limits for metronidazole and diloxanide furoate were 0.03, 0.04 µg/ml and the Quantitation limits were 0.11,0.13 µg/ml respectively. The method has validated for accuracy, precision, selectivity and robustness, Linearity was in the range of µg/ml for metronidazole, and µg/ml for diloxanide furoate. The recovery values of Accuracy were % for metronidazole and diloxanide furoate respectively. الكلمات المفتاحية :Key words االستشراب السائل رفيع االنجاز بالطور العكوس ميترونيدازول ديلوكسانيد فورات مقايسة مصدوقية الطريقة التحليلية RP-HPLC, Metronidazole, Diloxanide furoate, Assay,Validation of analytical method. المقدمة و هدف الدراسة: يعد ميترونيدازول (2-Methyl-5-(Metronidazole )1(nitroimidazole-1-ethanol من مشتقات ل 5- نتروايميدازول ويتصف بفعاليته المضادة لألوالي والمضادة للجراثيم الالهوائية سلبية وايجابية الغرام) 3,2 ( وهو قاتل لألميبا على مستوى األنسجة tissue amebicide ويمكن اعطاؤه بالمشاركة مع ديلوكسانيد فورات في معالجة مرضى الزحار األميبي amebic dysentery أو الخراجات الكبدية األميبية amebic liver abscess المجلد الرابع العدد التاسع جمادى األول 1434 آذار )مارس(

32 ) 5,4 (.يتصف ديلوكسانيد فورات Diloxanide furoate 2,2-Dichloroacetamido-4-N-methylphenyl 2- luminal بأنه قاتل لألميبا داخل اللمعة )1()Furoate) )7,6( amebicides و يعطى عند اإلصابة بالداء األميبي الالعرضي )8(Asymptomatic amebiasis )الشكل 1(. ميترونيدازول ديلوكسانيد فورات الشكل 1: الصيغتان البنيويتان لميترونيدازول وديلوكسانيد فورات لم تتطرق دساتير األدوية البريطاني 2009 و األمريكي ووردت أبحاث تتعلق بمقايسة ديلوكسانيد فورات في 2009 و األوروبي 2007 إلى فصل ومقايسة مزيج من األقراص والمعلقات باستخدام مقياس الطيف الضوئي ميترونيدازول وديلوكسانيد فورات في األقراص. تطرقت هذه الدساتير إلى مقايسة ميترونيدازول في األقراص والمادة األولية الصرفة حيث اعتمد الدستوران البريطاني واألوروبي )10,9( المعايرة في وسط المائي واستخدم الدستور األمريكي االستشراب السائل رفيع االنجاز على عمود C8 وطور متحرك: ماء وميتانول ) 20:80 (حجم/حجم) 1 (. وفي مقايسة ديلوكسانيد فورات ذكر دستور األدوية البريطاني المقايسة في األقراص باستخدام مقياس الطيف الضوئي )10( أما الدستور األمريكي فقد تطرق فقط إلى مقايسته في المادة األولية الصرفة باعتماد المعايرة في وسط المائي )1(. وفي األدبيات العلمية استخدمت طرائق مقايسة متعددة لمقايسة ميترونيدازول في األقراص والمعلقات منها طرائق حجمية )11( و طرائق ضوئية بمقياس الطيف الضوئي )13,12( و استشرابية باستخدام االستشراب السائل رفيع االنجاز )15,14( HPLC و االستشراب الغازي المربوط )18,17( و االستشراب السائل رفيع االنجاز )19(. أما فيما يتعلق بمقايسة مزيج ميترونيدازول وديلوكسانيد فورات في األقراص فقد ذكرت األدبيات العلمية طرائق تعتمد على مقياس الطيف الضوئي )22,21,20( واالستشراب السائل رفيع االنجاز )23 HPLC 24(. تضمنت طريقة هيراديف وزمالؤه مقايسة المزيج باستخدام عمود C8 و طور متحرك مؤلف من ميتانول :اسيتونتريل: وقاء فوسفاتي )ph=4) 0.05 M بالنسب )30:25:45( V V/ وسرعة تدفق 1 مل/دقيقة وطول موجة 277 نانومتر )24(. وهناك طرائق استشرابية أخرى اعتمدت االستشراب السائل فوق الحرج super critical fluid.)25( chromatography كان هدف هذا البحث إيجاد طريقة لفصل ومقايسة مزيج من ميترونيدازول وديلوكسانيد فورات في األقراص باستخدام االستشراب السائل رفيع االنجازبالطور العكوس HPLC- RP بشروط تجريبية جديدة وبحيث تكون طريقة سريعة ودقيقة ويمكن اعتمادها لمقايسة هاتين المادتين الدوائيتين في األقراص. مع مكشاف تأين اللهب) 16))GC-FID )..1 المواد : Material المجلد الرابع العدد التاسع جمادى األول 1434 آذار )مارس(

33 المجلة العربية للعلوم الصيدلية- مجلة اتحاد الجامعات العربية يوزن 100 ملغ من ميترونيدازول المعياري وتوضع في دورق معياري سعة 100 مل ثم تذاب في الطور المتحرك ثم يحرك المحلول باالستعانة بمحرك مغناطيسي لمدة تتراوح بين دقيقة حتى تمام الذوبان. يكمل حجم المحلول بالطور المتحرك حتى خط العيار. المحلول المعياري األم لديلوكسانيد فورات 1 ملغ/مل: يحضر بنفس طريقة تحضير محلول ميترونيدازول األم فورات: المحلول المعياري لميترونيدازول وديلوكسانيد يوضع في دورق معياري سعة 100 مل 5 مل من محلول ديلوكسانيد فورات المعياري األم و 4 مل من محلول ميترونيدازول المعياري االم ثم يكمل الحجم بالطور المتحرك حتى خط العيار ويمزج فيتم الحصول على محلول تركيزه ميترونيدازول. 50 مكغ/مل لديلوكسانيد فورات و 40 مكغ / مل محاليل الخطية: يحضر 5 تراكيز متسلسلة من المادة المعيارية تحوي على الترتيب ) (% من تركيز المحلول المعياري لكل من ميترونيدازول وديلوكسانيد فورات كما يلي: يوضع في خمسة دوارق حجمية سعة كل منها 100 مل على التوالي مل من المحلول المعياري األم لديلوكسانيد فورات كما يوضع في هذه الدوارق على التوالي مل من المحلول المعياري األم خط العيار لميترونيدازول ثم يكمل الحجم بالطور المتحرك حتى فيتم الحصول على محاليل تراكيزها مكغ/مل من ديلوكسانيد فورات و مكغ/مل من ميترونيدازول على الترتيب. يحقن 20 مكروليتر من كل محلول في جهاز HPLC وتسجل النتائج. Working ( المواد المعيارية: تم الحصول على المواد المعيارية )Standard من مخبر الرقابة الدوائية في وزارة الصحة في الجمهورية العربية السورية. العينات المدروسة: تم الحصول على عينات المواد األولية لكل من ميترونيدازول وديلوكسانيد فورات من عدة مصانع دوائية محلية. وتم الحصول على عينات األقراص من بعض الصيدليات الخاصة. المواد الكيميائية: خاص بجهاز Acetonitrile أسيتونتريل.Merck. Germany تم شراؤه من شركة HPLC HPLC خاص بجهاز ال Methanol ميثانول من شركة.Merck. Germany ماء Water خاص بجهاز ال HPLC من شركة.Merck. Germany األجهزة و المعد ات: Instruments and Equipments جهاز استشراب سائل رفيع االنجاز HPLC نوع PU-980 Intelligent HP مزود بمضخة Jasco و مكشاف: UV-970 Intelligent UV/VIS و طابعة HP deskjet 5443 و حاقن يدوي mm 250X mm ( Eurospher C عمود 8 Knauer Germany من شركة 5 µm ) 4.6 Ultrasonic جهاز األمواج فوق الصوتية نموذج Germany T310 Labinco محرك مغناطيسي طراز L33 مراشح Filters قياس 0.45 مكرومتر من شركة Whatman مراشح HPLC قياس 0.45 مكرومتر من شركة Sartorius stedium biotech محاليل المضبوطية: 2. تحضير المحاليل: المحلول المعياري األم لميترونيدازول: 1 ملغ/مل المجلد الرابع العدد التاسع جمادى األول 1434 آذار )مارس(

34 يتم تحليل عينات تحوي المادة المعيارية )ميترونيدازول وديلوكسانيد فورات( مضافا إليها السواغات الداخلة في تركيب األقراص وهي )دي اوكسيد السيليكون الغروي ستيارات المغنزيوم سيليلوز مجهري التبلور غليكوالت النشا الصودية ) )20( تحضر تسع عينات مقسمة إلى ثالث مجموعات تحوي على التوالي %80 و %100 و %120 من تركيز المحلول المعياري لكل من ميترونيدازول وديلوكسانيد فورات توضع في كل دورق حجمي 100 مل من الدوارق التسعة وزنة تعادل السواغات الموجودة في قرص واحد ثم يضاف إلى دوارق المجموعات الثالث على التوالي مل من محلول ديلوكسانيد فورات األم و مل من محلول ميترونيدازول األم ثم يكمل الحجم بالطور المتحرك حتى خط العيار وتمزج جيدا فيكون تركيز ميترونيدازول في المجوعات الثالث على التوالي مكغ/مل وتركيز ديلوكسانيد فورات مكغ/مل. محاليل التكرارية: يتم تحليل عينات من األقراص وذلك بتحضير تسع عينات مقسمة الى 3 مجموعات بحيث تحوي على التوالي %80 %100 %120 من تركيز كل من محلول ميترونيدازول وديلوكسانيد المعياري. يوزن عشرون قرصا إفراديا ثم يحسب الوزن الوسطي للقرص الواحد وتطحن األقراص حتى الحصول على مسحوق ناعم ويؤخذ من أجل كل عينة من العينات التسعة كمية من المسحوق تعادل 100 ملغ ميترونيدازول و 125 ملغ ديلوكسانيد فورات وتوضع في دورق 100 مل وتذاب في االسيتونتريل ويمزج على محرك مغناطيسي لمدة نصف ساعة ثم يكمل باالسيتونتريل الى خط العيار. ترشح العينة على مراشح 0.45 مكرومتر ويؤخذ من الرشاحة 3.2 مل أو 4 مل أو 4.8 مل وتوضع في دورق حجمي سعة 100 مل ويكمل الحجم بالطور المتحرك حتى خط العيار ويمزج جيدا وتكون تراكيز المحاليل الناتجة على التوالي مكغ/مل من ميترونيدازول 40 و 50 و 60 مكغ/مل من ديلوكسانيد فورات. محاليل الدقة الوسطى: تحضرهذه المحاليل بالطريقة المذكورة نفسها التكرارية. محاليل االنتقائية: في محاليل يتم تحضير عينة شاهدة من السواغات الداخلة في تصنيع أقراص ميترونيدازول وديلوكسانيد فورات وثالث عينات تحوي كل منها على المادة الفعالة بتركيز %100 من تركيز المعياري لكل من ميترونيدازول ديلوكسانيد فورات مضافا اليها السواغات. تحضير العينة الشاهدة: توضع في دورق معياري سعة 100 مل وزنة تعادل السواغات الموجودة في قرص واحد ثم يكمل الحجم بالطورالمتحرك حتى خط العيار ثم تمزج جيدا. تحضير محاليل العينات: تؤخذ وزنة تعادل وزن السواغات الموجودة في قرص واحد وتوضع على التسلسل في ثالثة دوراق معيارية سعة 100 مل ثم يضاف إلى كل دورق مل من محلول ميترونيدازول األم و 4 5 مل من محلول ديلوكسانيد فورات ثم يكمل الحجم بالطور المتحرك حتى خط العيار وتمزج جيدا فيكون تركيز كل من ميترونيدازول وديلوكسانيد فورات في الدوارق الثالث 40 و 50 مكغ/مل على الترتيب. محاليل المتانة: تحضر عينة من األقراص ذات تركيز %100 من تركيز المعياري لكل من ميترونيدازول وديلوكسانيد فورات اعتبارا من مسحوق األقراص وبالطريقة نفسها المذكورة في محاليل التكرارية. وقد سجلت االستجابات الحاصلة في معدالت تدفق مختلفة مل /دقيقة. تحضير محاليل عينات أقراص ميترونيدازول وديلوكسانيد فورات: تحضر محاليل األقراص بحيث تحوي تراكيز معيارية من ميترونيدازول وديلوكسانيد فورات المعياري) 50 مكغ/ مل من ديلوكسانيد فورات و 40 مكغ/ مل من ميترونيدازول(. المجلد الرابع العدد التاسع جمادى األول 1434 آذار )مارس(

35 المجلة العربية للعلوم الصيدلية- مجلة اتحاد الجامعات العربية الشروط الكروماتوغرافية المستخدمة :Chromatography Conditions طور متحرك: اسيتونتريل :ماء )35:65( حجم/حجم معدل تدفق 1 مل/د طول موجة مكشاف :UV 230 نانومتر عمود: µ5m (250X4.6) mm C8 درجة حرارة العمود: 25 درجة مئوية حجم الحقنة :20 مكروليتر 4. الدراسة الكيفية: جرى اختيار طول موجة UV عند 230 نانومتر لمقايسة ميترونيدازول وديلوكسانيد فورات )26,25( ويوضح الشكل 2 طيفي امتصاص ميترونيدازول وديلوكسانيد فورات لألشعة فوق البنفسجية. ويبين الشكل 3 المخطط الكروماتوغرافي لمزيج ميترونيدازول وديلوكسانيد فورات المحقون في جهاز HPLC باستخدام الطور المعتد للفصل كما يبين الجدول 1 نتائج مالءمة النظام وفق الدستور األمريكي )1( الشكل 2: طيفا UV لميترونيدازول وديلوكسانيد فورات الشكل 3: المخطط الكروماتوغرافي لمحلول معياري من ديلوكسانيد فورات وميترونيدازول باستخدام الطور المعتمد للفصل. المجلد الرابع العدد التاسع جمادى األول 1434 آذار )مارس(

36 الجدول 1 : معايير مالءمة النظام لميترونيدازول وديلوكسانيد فورات المادة زمن االحتباس التناظرية الميز الصفائح النظرية ميترونيدازول ديلوكسانيد فورات التحقق من مصدوقية الطريقة : يلخص الجدول 2 نتائج المصدوقية الجدول 2: نتائج مصدوقية الطريقة التحليلية لميترونيدازول وديلوكسانيد فورات االستعادة % المضبوطية المادة زمن االحتباس )د( الخطية الدقة التكرارية الدقة الوسطى االنتقائية المتانة )سرعة التدفق مل/دقيقة( حد الكشف مكغ/مل حد الكم مكغ/مل RSD= RSD= RSD= RSD= R²= R²= ميترونيدازول ديلوكسانيد فورات ** نتائج فحص عينات األقراص: يوضح الجدول 3 نتائج فحص عينات األقراص الجدول 3: نتائج فحص عينات أقراص ميترونيدازول وديلوكسانيد فورات الرمز عينة األقراص وسطي مساحة قمة المعياري* وسطي مساحة قمة العينة النسبة المئوية للمادة الفعالة ميترونيدازول ديلوكسانيد فورات ميترونيدازول ديلوكسانيد فورات ميترونيدازول ديلوكسانيد فورات ملغ ميترونيدازول +250 ملغ ديلوكسانيد فورات 200 ملغ ميترونيدازول +250 ملغ ديلوكسانيد فورات 500 ميترونيدازول A2 2D 2B ملغ 500 ديلوكسانيد فورات 2c * وسطي خمس حقنات متتالية للمعياري ** وسطي ثالث حقنات للعينة المجلد الرابع العدد التاسع جمادى األول 1434 آذار )مارس(

37 المجلة العربية للعلوم الصيدلية- مجلة اتحاد الجامعات العربية الشكل 4: المخطط الكروماتوغرافي لمحلول معياري من ديلوكسانيد فورات لفصل مزيج ميترونيدازول وديلوكسانيد فورات. وتنيدازول باستخدام الطور المستخدم الشكل 5 :المخطط الكروماتوغرافي لمحلول معياري من بنزوات ميترونيدازول وميترونيدازول باستخدام الطور المستخدم لفصل مزيج ميترونيدازول وديلوكسانيد فورات. المجلد الرابع العدد التاسع جمادى األول 1434 آذار )مارس(

38 المناقشة واالستنتاجات Discussion and Conclusion - تتصف طريقة الفصل والمقايسة التي تم التوصل إليها في هذه الدراسة بأنها طريقة ذات مصدوقية وكانت قيمتا حد الكشف مكغ /مل وحد الكم مكغ/ مل لميترونيدازول وديلوكسانيد فورات على الترتيب. - تمت زيادة نسبة االسيتونتريل في الطور المتحرك بهدف الحصول على زمن احتباس أقل لديلوكسانيد فورات مع المحافظة على معدل تدفق 1 مل /دقيقة حيث استخدم طور متحرك مؤلف من اسيتونتريل وماء بنسبة )35:65( v/v فانخفض زمن احتباس ديلوكسانيد فورات بشكل ملحوظ من الى 5.18 دقيقة وكان زمن احتباس ميترونيدازول 3.17 دقيقة وقد تم اعتماد هذا الطور في عملية الفصل والمقايسة. لم تؤد زيادة سرعة التدفق من 1 إلى 1.5 مل /دقيقة إلى انخفاض كبير في زمن احتباس مادة ديلوكسانيد فورات حيث انخفض زمن االحتباس من 9.7 إلى 7.4 دقيقة )الجدول 4(. الجدول 4: تأثير زيادة سرعة التدفق في الطور )%50 اسيتونتريل +%50 ماء( على زمن االحتباس سرعة التدفق مل/د زمن االحتباس )دقيقة( ميترونيدازول ديلوكسانيد فورات عمود C8 من أكثر أعمدة HPLC شيوعا في مخابر أدت زيادة نسبة االسيتونتريل في الطور المتحرك من - مراقبة األدوية. 40 الى % 65 إلى خفض زمن احتباس ديلوكسانيد درجة ph الطور المتحرك المعتمد تقريبا 6.31 وهي - فورات بصورة خاصة الى 5.18 دقيقة حيث أن إلفة مالئمة للعمود حسب المرجع )26( حيث تتراوح درجة ديلوكسانيد فورات للطور المتحرك كبيرة كونه منحل الحموضة المالئمة للعمود بين )8-2(. في األسيتونتريل ولذلك عند زيادة نسبة األسيتونتريل أعطت الطريقة التحليلة خطية جيدة حيث كان معامل - في الطور المتحرك أصبحت إلفة هذا المركب للطور الترابط لكل من على التوالي لميترونيدازول المتحرك أكبر من إلفته للطور الثابت ولذلك انخفض و لديلوكسانيد فورات وكانت قيم وسطي النسبة زمن احتباس هذا المركب. المئوية لالستعادة للمضبوطية قيما مقبولة حيث كانت على تميزت هذه الطريقة بأنها سريعة حيث كان زمنا - %99.08 و % التوالي في ميترونيدازول 3.17 احتباس ميترونيدازول وديلوكسانيد فورات لديلوكسانيد فورات دقيقة على الترتيب وذلك بالمقارنة مع زمني تسمح هذه الطريقة بفصل بنزوات ميترونيدازول عن - المذكورة في احتباس هاتين المادتين في الطريقة ميترونيدازول الذي هو أحد منتجات تدرك بنزوات األدبيات العلمية وهما دقيقة على الترتيب ميترونيدازول في المعلقات الفموية)المعادلة 1( لذا من.)24( الممكن استخدامها في دراسة ثبات معلقات بنزوات تتميز هذه الطريقة مقارنة مع غيرها من طرق الفصل - ميترونيدازول )27( )الشكل 5(. المعتمدة على )23( HPLC بأنها قليلة الكلفة كما أن المجلد الرابع العدد التاسع جمادى األول 1434 آذار )مارس(

39 المجلة العربية للعلوم الصيدلية- مجلة اتحاد الجامعات العربية تسمح هذه الطريقة بفصل تنيدازول عن ديلوكسانيد فورات في األقراص الحاوية على مزيج منهما )الشكل 4 (. - المعادلة 1: تدرك بنزوات ميترونيدازول إلى حمض البنزوئيك وميترونيدازول Pharmacotherapeutics for advanced practice: a practical approach, 2nd edition, Lippincott Williams&wilkins, 441, European Pharmacopoeia 6.0, British Pharmacopoeia Bartlett Pn, Ghoneim E, El Hefnawy G, El-Hallag I. Voltammetry And Determination Of Metronidazole at a carbon fiber microdisk electrode, J.Talanta 66(4) , Adegoke OA. A New Approach To The Spectrophotometric Determination Of Metronidazole And Tinidazole Using P-Dimethylaminobenzaldehyde, Journal. acta pharmaceutica. 59(4), , Mishra AK. Development And Validation of UV Spectrophotometric Method For The Determination Of Metronidazole In Tablet Formulation, International journal of pharma.research and development, Volume 2, 1-5, Emami J. A Rapid And Sensitive Hplc Method For The Analysis Of Metronidazole In Human Plasma: Application To Single Dose Pharmacokinetic And Bioequivalence Studies, Daru Journal Of Pharmaceutical Sciences. Volume 14, No. 1, 15,2006. المراجع :References 1- USP Pharmacopoeia 32/ Mahugo-Santana C., Sosa-Ferrera Z., et al. Analytical Methodologies For The Determination Of Nitroimidazole Residues In Biological And Environmental Liquid Samples. Analytica Chimica Acta 665, , H. Richard. Adams. Veterinary Pharmacology And Therapeutics, 8 edition, Iowa State university Press, , Brenner GM., Stevens CV. Pharmacology Third Edition, Saunders Elsevier, 484, Sweet Man SC. B Pharm Frpharms, Martindale, 36 th Edition, Pharmaceutical Press, China,822, Shanbhag TV. Pharmacology. Prep Manual For Undergraduates, Elsevier, First Edition, Chapter 11, , Satoskar RS., Bhandarkar SD. Pharmacology And Pharmacotherapeutics, Popular Parakashan, Twenty First Edition, Chapter 55, , Arcangelo VP., Peterson AM. المجلد الرابع العدد التاسع جمادى األول 1434 آذار )مارس(

40 21- Galal SM, Bedair MM, El-Sayed MA. Derivative Spectrophotometric Determination Of Antiprotozoal Drugs In Two- Component Tablet Preparation., J Pharm Belg,46(6),315 9, El-Ghobashy MR., Abo-Talib N. Spectrophotometric Methods For The Simultaneous Determination Of Binary Mixture Of Metronidazole And Diloxanide Furoate Without Prior Separation, Journal Of Advanced Research 31, 1, El-Gizawy SM. HPLC Analysis Of Metronidazole And Diloxanide Furoate In Its Dosage Forms, Analytical Letters, Volume 28, 83 92, Danao KR, Hiradeve SM. et al. Rp-HPLC Simultaneous Estimation Of Metronidazole And Diloxanide Furoate In Combination, International Journal Of Pharmacy & Life Sciences, Ijpls, 1(2), 82-85, Bhoira IC., Ramana B., Sundaresanb M., And Bhagwatb AM. Separation And Estimation Of Diloxanide Furoate And Metronidazole In Solid Dosage Form Using Packed Column Supercritical Fluid Chromatography, J.Analytica Chimica Acta, Volume 354, , Moffat AC., Osseelton MD., Widdop B., Clarke S. Analysis Of Drugs And Poisons, Third Edition Bempong DK., Manning RG., Mirza T. And Bhattacharyya L. A Stability-Indicating HPLC Assay For Metronidazole Benzoate, J Pharm Biomed Anal, 38(4) , Qin Y, Zou Y, et al. Determination Of Metronidazole In Serum By HPLC, Journal Of West China University Of Medical Sciences, Mar,27(1), , Ashour S., Kattan N. Simultaneous Determination Of Miconazole Nitrate And Metronidazole In Different Pharmaceutical Dosage Forms By Gas Chromatography And Flame Ionization Detector (Gc-Fid), International Journal Of Biomedical Science, Vol. 6, No. 1, 13-18, Al-Ghanam SM. And Belal F. Spectrophotometric Determination Of Diloxanide Furoate In Its Dosage Forms,J. Il Farmaco,Volume 56, , Hasan NY, Elkawy MA., Elzeany BE. And Wagieh NE. Stability Indicating Methods For The Determination Of Diloxanide Furoate, Journal Of pharmaceutical And Biomedical Analysis, Volume 28, , Mishal A., Sober D. Stability Indicating Reversed-Phase Liquid Chromatographic Determination Of Metronidazole Benzoate And Diloxanide Furoate As Bulk Drug And In Suspension Dosage Form, Journal Of pharmaceutical And Biomedical Analysis, Volume 39, , Al-Shaalan NH. Determination Of Diloxanide Furoate And Metronidazole In Binary Mixture Using First Derivative Of The Ratio-Spectra And High- Performance Liquid Chromatography-UV Methods, American Journal Of Applied Sciences. 4 (2), 66-72, المجلد الرابع العدد التاسع جمادى األول 1434 آذار )مارس(

41 المجلة العربية للعلوم الصيدلية- مجلة اتحاد الجامعات العربية خالصة واعدة تثبط التكاثر الخلوي خالل طور التحريض في تسرطن القولون الم حد ث كيميائيا A promising extract suppresses cellular proliferation during the initiation phase of chemically induced colon carcinogenesis الملخص Abstract وصفي عصفور* سوسن الماضي* لينا الحفار** * قسم األدوية و السموم- كلية الصيدلة جامعة دمشق سورية ** قسم التشريح المرضي- كلية الطب جامعة دمشق سورية.1 أجريت الدراسة الحالية ب غية استقصاء فعالية الخالصة اإليثانولية لبذور حبة البركة المزروعة محليا في الوقاية من تسرطن القولون خالل طور تحريض التسرطن بمرك ب ثنائي ميثيل الهيدرازين )DMH( لدى الجرذان ولتقييم أثر هذه الخالصة المحتمل على التكاثر الخلوي. برهنت نتائج الدراسة بأن إعطاء الخالصة بجرعة فموية يومية تكافئ 150 ملغ من البذور/ كغ من وزن الجرذ أدى إلى تثبيط تسرطن القولون وذلك ما تترجم بحدوث انخفاض معتد ذي داللة إحصائية في كل من نسبة حدوث األورام وعددها ومتوسط أحجامها. وقد ترافق ذلك مع تناقص في منسب توسيم مستضد تكاثر الخلية النووي )PCNA-LI( في القولون. وبالنتيجة فإن الدراسة الحالية قدمت دليال على أن الخالصة اإليثانولية لبذور حبة البركة تمتلك فعالية في الوقاية الكيميائية من تسرطن القولون نعتقد أنها ناجمة على األقل في جانب منها عن قدرة هذه الخالصة على تثبيط التكاثر الخلوي. تقد م نتائج هذه الدراسة أسلوبا فع اال قد يكون من الممكن االستفادة منه في الوقاية األولي ة من سرطان القولون عند البشر في المستقبل القريب. The present study was undertaken to investigate the chemopreventive efficacy of the ethanolic extract of indigenous Nigella sativa (NsE) seeds during the initiation phase of 1, 2- dimethylhydrazine (DMH)-induced colon carcinogenesis in a rat model, and to appraise its potential impact on cellular proliferation. The results demonstrated that (NsE), at an orally daily dose equivalent to 150 mg of the seeds/kg body weight, has an inhibitory effect against colon carcinogenesis as reflected by significant reductions in tumor incidence, multiplicity and mean tumor volumes. These reductions were accompanied by a significant decrease in colonic proliferating cell nuclear antigen- Labeling index (PCNA-LI). In conclusion, we provided evidence that (NsE) has a chemopreventive effect against DMH induced colon carcinogenesis. We surmise that such effect of (NsE) is mediated, at least in part, through its ability to suppress cellular proliferation. The results could provide an effective chemopreventive approach in the primary prevention of colon cancer in humans in the next future. الكلمات المفتاحية :Key words الخالصة اإليثانولية حبة البركة م نس ب توسيم مستضد تكاثر الخلية النووي طور التحريض تسرطن القولون الوقاية الكيميائية ثنائي ميثيل الهيدرازين الجرذان. Ethanolic extract, Nigella sativa seeds, PCNA-LI, initiation phase, colon carcinogenesis, chemoprevention, DMH, rats. المقدمة introduction بادئ ذي بدء البد من اإلشارة إلى أن داء السرطان cancer بات يشكل ثاني أكثر األعباء الصحية جسامة في ع د اد األمراض التي تثقل كاهل العالم بأسره تسبقه في ذلك أمراض القلب و األوعية cardiovascular diseases التي تتبو أ مركز الصدارة والسيما في المجتمعات الغربية. [1] western developed countries الدولية ألبحاث السرطان تقدر الوكالة International Agency for (IARC) Research on Cancer أن العبء العالمي المجلد الرابع العدد التاسع جمادى األول 1434 آذار )مارس(

42 ض للسرطان global cancer burden بحلول العام سيصل 2020 إلى 16.8 مليون إصابة مما يشير إلى ازدياد تفشي هذا الداء الذي بات يشكل بحق وباء عالميا. يحتل سرطان القولون والمستقيم colorectal cancer المرتبة الثالثة في قائمة الخ باثات malignancies األكثر شيوعا كما أنه يشكل سببا رئيسا للوفيات الناجمة عن السرطان على امتداد العالم. [2] أم ا في سوريا فإن معدالت اإلصابة بسرطان القولون والمستقيم آخذة في االرتفاع على نحو يبعث على القلق فبعد أن كانت نسبة اإلصابة بهذا النوع من السرطان في عام 2008 تقارب % 7.5 قفزت هذه النسبة لتصل إلى حولي % 12 وفقا آلخر اإلحصائيات المتوفرة في مديرية مكافحة السرطان في وزارة الصحة السورية عام ليصبح 2009 سرطان القولون والمستقيم بذلك ثاني أكثر أنواع السرطان انتشارا في سوريا تاليا لسرطان الرئة والقصبات lung & breast عند الرجال وسرطان الثدي bronchus cancer cancer عند النساء بالرغم من الجهود تزال-. ]3[ الحثيثة المضنية التي س خ رت وال لتطوير طرائق ومنهجيات عالجية إال أن الوسائل والسبل العالجية المتاحة بقيت قاصرة لوحدها عن تحقيق الغاية المرجوة في مواجهة نسب الحدوث العالية ومعدالت الب قيا survival rate المنخفضة في سرطانات القولون. إن اإلخفاق في السيطرة على سرطان القولون بشكل م ر حدا بالعلماء إلى البحث عن استراتيجيات للوقاية حتى أضحى تطوير عوامل وقاية كيميائية chemopreventive agents تحول دون تطور وترقي األورام الغ د ية الحميدة benign adenomas وغيرها من اآلفات الورمية الباكرة في القولون يشك ل هاجسا للباحثين في مجال الوقاية من سرطان القولون يشحذ هممهم للخوض في هذا المضمار الذي بات يمثل تطورا بارزا في ميدان بحوث الوقاية السريرية من السرطان. ]4[ ومما ال ريب فيه أن االعتماد على الوقاية من األمراض هو مبدأ موغل في الق د م تعود جذوره إلى أعماق التاريخ حيث يعتبر لجوء اإلنسان إلى الوقاية من األمراض المختلفة بالوسائل المتوافرة بين يديه ومن بينها النباتات أمرا قديما في نشأته ق د م نشأة اإلنسان. أما في العصر الحديث فقد جذبت القدرات الوقائية والعالجية المتنوعة للنباتات الطبية ج ل اهتمام الباحثين في مضمار الوقاية من السرطان وعالجه فباتت جهودهم منصب ة على تسخير قدرات تلك النباتات في صراعهم الم ضني مع ذلك الداء الخبيث المتمر د وقد كانت ثمرة أبحاثهم تلك بزوغ فجر جيل جديد من المواد الكيميائية ذات المنشأ النباتي التي أضحت تشكل دعامة من دعائم عالج السرطان )مثل (paclitaxel, vincristine والوقاية منه. وفي هذا الصدد تعتبر بذور حبة البركة )الشونيز( Nigella sativa مرشحا يستحق المزيد من التقييم والدراسة المستفيضة كعامل يمتلك القدرة على الوقاية من السرطان. إن نبات حبة البركة أو الشونيز نبات عشبي ح و لي annual herbaceous plant ينتمي إلى الفصيلة الحوذانية Ranunculacea موطنه األصلي منطقة جنوب غرب آسيا [5] وصفه Linnaeus ألول مرة عام 1753 يزرع نبات حبة البركة. ]6[ بشكل خاص في بلدان الحوض الشرقي للبحر األبيض المتوسط بغية االستفادة من بذوره التي ي طلق عليها العديد من التسميات العامي ة الدارجة كالحبة السوداء ]7[ black seed العربية( و الكمون األسود أو الشونيز )في البالد أو الكراوية black cumin السوداء ( black caraway في البالد الناطقة باإلنكليزية( كما يطلق عليها اسم Kalonji في الهند أما في الصين فتسم ى Chou Hak Jung وفي اللغة الالتينية القديمة كانت تعرف باسم Panacea أي الدواء الشامل إيمانا بالقدرات الشافية التي تتحلى بها بذور حبة البركة. أثبتت الدراسات واألبحاث العلمية الوافرة والراسخة بما يقطع الشك باليقين الفوائد العالجية والوقائية لبذور حبة البركة حيث تزخر األدبيات الطبية بالنتائج التي تقدم بالدليل القاطع براهين على األهمية الطبية للخالصات والمكونات المفردة المعزولة من بذور حبة البركة وتأثيراتها الدوائية للمكروبات متعددة المناحي كتأثيراتها المضادة ]8 9[ antimicrobial وتأثيرها المسكن لأللم المجلد الرابع العدد التاسع جمادى األول 1434 آذار )مارس(

43 المجلة العربية للعلوم الصيدلية- مجلة اتحاد الجامعات العربية [10] analgesic والمضاد لاللتهاب [13, 12, 11] [15, 14] antiinflammatory antihistaminic immunopotentiating وتأثيرها المضاد للهستامين وقدراتها المعززة للمناعة [17, 16] [19, 18] anti-hypertensive [20] antidiabetic antioxidant والخافضة لضغط الدم والمضادة لداء السكري باإلضافة إلى قدراتها المضادة للتأكسد والكانسة للجذور الحرة radical [23,22, 21] scavenging وقد نالت قدرات بذور حبة البركة المضادة لألورام antineoplastic قسطا وافرا من الدراسة إذ تم استقصاء فعاليتها المضادة للسرطان في الكائن in vivo الحي باستخدام الطرازات الحيوانية animal models المالئمة وفي الزجاج توظيف خطوط الخاليا السرطانية المتنوعة in vitro من خالل cancer cell lines ]25 24[. إن الغاية المرجوة والهدف الرئيس من الدراسة الحالية هذه الم جراة في الكائن الحي in vivo هو استقصاء وتحري فعالية الخالصة اإليثانولية ethanolic extract لبذور حبة البركة المزروعة محليا في الوقاية من تسرطن القولون المحرض كيميائيا في جرذان المختبر باستخدام مركب 1,2 )DMH( Dimethylhydrazine dihydrochloride وتقييم أثرها المحتمل في تثبيط التكاثر الخلوي cellular proliferation في مستويات التعبير وذلك من خالل رصد التغيرات الحاصلة expression تكاثر الخلية النووي )PCNA( النسيجية عن مستضد Proliferating cell nuclear antigen الذي يعتبر أحد الواصمات البيولوجية biomarker الهامة في مضمار دراسة معدالت التكاثر الخلوي والمستخدمة في دراسات الوقاية الكيميائية من سرطان القولون لدى حيوانات التجارب..2 المواد والطرائق Materials and methods للحيوانات المخبرية ( دمشق سوريا(. وضعت الجرذان إثر وصولها في إحدى غرف حواضن حيوانات التجربة )كلية الصيدلة جامعة دمشق ) لت ترك بعدها أسبوعا واحدا للتأقلم مع ظروف البيئة التقليدية المضبوطة التي و ض عت فيها )درجة حرارة ± 24 1 o س %50 %10± رطوبة نسبية مع دورة منتظمة من اإلنارة والظالم 12/12 ساعة( وذلك بعد أن جرى توزيعها على أقفاص من البولي بروبيلين polypropylene cage مفروشة بنشارة الخشب وتؤمن لها حرية الحركة والوصول إلى الماء والغذاء الخاص بها. تم الحصول على بذور حبة البركة الجافة المزروعة في سوريا من السوق المحلية كما تم شراء المادة الم سرط نة 1, 2-Dimethylhydrazine dihydrochloride: )DMH) الجرذان من شركة المستخدمة لتحريض سرطان القولون عند Acros Organics األمريكية USA) (Morris Plains, NJ; أما اإليثانول المستخدم في االستخالص grade( )HPLC فقد تم شراؤه من شركة Merck األلمانية Germany). (Darmstadt, في حين تم شراء العتيدة المستخدمة ( Peroxidase/DAB )detection kit في التلوين الكيميائي النسيجي المناعي Immunohistochemical (IHC) staining من شركة Dako الدنمركية (EnVision +/HRP, DAKO, Denmark) Glostrup, إضافة ألضداد PCNA الفأرية أحادية النسيلة (clone PC10, Dako, Glostrup,.Denmark).2.2 الطرائق Methods تحضير خالصة بذور حبة البركة بعد الغسل والتجفيف تم طحن البذور باستخدام مطحنة كهربائية حتى الحصول على مسحوق خشن. جرى بعد ذلك استخالص مسحوق العقار باستخدام اإليثانول % 90 وذلك 1.2. المواد المستخدمة Materials حيوانات التجربة والمواد الكيميائية Animals بالنقع لمدة 24 ساعة في درجة حرارة الغرفة بعيدا عن and chemicals الضوء مع التحريك والرج المستمر. رشحت الخالصة استخد م في البحث 69 جرذا أبيضا ذكرا من ساللة wistar الناتجة ومن ثم تم تكرير عملية االستخالص وفق الخطوات بلغت أعمارها خمسة أسابيع تم استقدامها من شركة Leen المجلد الرابع العدد التاسع جمادى األول 1434 آذار )مارس(

44 مجموعة )NsE( أو مجموعة خالصة حبة البركة: خضعت لنفس بروتوكول المادة المسرطنة كما في المجموعة الثانية وتلق ت باإلضافة لذلك جرعة فموية يومية من خالصة حبة البركة بما يعادل 150 ملغ من البذور الجافة/ كيلوغرام من وزن الجرذ لمدة عشرة أسابيع ( والتي تمثل مدة التعرض لتأثيرات المادة المسرطنة أو ما يسمى طور التحريض.)initiation phase ق دمت الجرعات الفموية من خالل عملية التنبيب intubation باستعمال أنابيب تغذية فموية قياس تسجيل تغيرات أوزان الجرذان تم تنظيم سجل خاص د و نت فيه أوزان الجرذان في كافة المجموعات طوال فترة التجربة إذ جرى البدء بتحديد األوزان عند البدء بالتجربة ومرة واحدة أسبوعيا خالل فترة التجربة وقبل التضحية بالجرذان في نهاية األسبوع الثاني والعشرين الفحص العياني لألورام المتشكلة في القولون Macroscopical examination.2 تم ت التضحية بالجرذان بحلول نهاية األسبوع الثاني والعشرين وذلك باستعمال جرعة مفرطة من األثير ث نائ ي اإليثيل diethyl ether الخاص بالتخدير. جرى بعد ذلك تشريح الجرذان بغية الحصول على القولون كامال إلجراء الدراسة الالزمة. عدد األورام: بعد إزالة القولون من جسم الحيوان تم غسله غسال جيدا بكمية وافرة من المحلول الملحي النظامي normal saline ثم ف تح القولون على طول المحور الناصف الطوالني longitudinal median axis وك ررت عملية الغسل لتنظيف السطح الداخلي للقولون وذلك من أجل إحصاء عدد األورام المتكونة ضمن ل معة القولون من خالل الفحص العياني. أحجام األورام: تم تحديد أحجام األورام Tumor length بعد قياس كل من طول الورم (TV) volume )L( وعرضه )W( width وارتفاعه باستخدام ف رني ة vernier caliper مدرجة بتدريجات من رتبة 0.1 ملم إذ ىل السابقة حتى استنفاد العقار. ج م عت الرشاحات الناتجة وتم under طرد الم ح ل من خالل عملية التبخير في الخالء.vacuum )تم تحضير الخالصة في معمل بيوشام Biocham ريف دمشق سوريا(. ح ف ظت الخالصة في الثالجة ضمن أوعية عاتمة محكمة اإلغالق. 2.تحضير محلول المادة المسرطنة,1 2-Dimethylhydrazine مادة حل تم normal في محلول ملحي نظامي dihydrochloride. EDTA يحتوي على 1 ميلي مول / ليتر من saline بعد ذلك باهاء )ph( المحلول على 6.5 باستخدام ض بط محلول هيدروكسيد الصوديوم ) 1 مول/ ليتر( من أجل ضمان مالئمة درجة حموضة المحلول للحقن من جهة المادة المسرطنة من جهة stability وللتأكد من ثبات أخرى. است خدم المحلول الناتج مباشرة بعد التحضير. full- face تم استعمال قناع حماية كاملة للوجه (The األمريكية MSA من شركة respirator USA) Advantage 1000: MSA co., عند تحضير محلول المادة المسرطنة ولدى حقن الجرذان بالجرعات المناسبة من المحلول مجموعات حيوانات التجربة بعد انقضاء فترة التأقلم و ز عت الجرذان بشكل عشوائي ع ثالث مجموعات بالتساوي: :Normal control المجموعة الشاهدة الطبيعية تناولت الماء والغذاء فقط كما تم حقنها )تحت الجلد( مرة بالمحلول الملحي واحدة أسبوعيا ولمدة عشرة أسابيع النظامي الحاوي على 1 ميلي مول/ليتر من EDTA والذي إلذابة المادة المسرطنة vehicle تم استعماله سواغا.DMH مجموعة شاهد التسرطن :carcinogen control تم حقنها مرة واحدة أسبوعيا بمحلول المادة المسرطنة بجرعة 40 ملغ DMH /كيلو غرام من وزن الجرذ لمدة عشرة أسابيع متتالية. المجلد الرابع العدد التاسع جمادى األول 1434 آذار )مارس(

45 المجلة العربية للعلوم الصيدلية- مجلة اتحاد الجامعات العربية (6/ π (TV=L W H أتاح بعدها تطبيق القانون: حساب حجم الورم. جرى تقييم نتائج الفحص العياني وبالتالي نتائج استجابة الوقائية الكيميائية من أورام القولون chemopreventive tumor response من خالل: أورام )Incidence( 1. مقارنة النسبة المئوية لحدوث القولون. عدد األورام المتشكلة mean مقارنة متوسطات 2..)Multiplicity( 3. مقارنة متوسطات أحجام أورام القولون المتشكلة. بعد االنتهاء من تسجيل التغي رات المرضي ة العيانية في وتوز عها( تم تثبيت القولون القولون )عدد وأبعاد األورام بشكل م سط ح flat بين قطعتين من ورق الترشيح filter %10 من الفورمالين المدروء في محلول paper مدة 24 بالفوسفات phosphate-buffered formalin ساعة جرى بعدها ط مر embedding القولون في شمع البارافين paraffin بالطرائق الروتينية المتبعة لي صار بعد تمهيدا sectioning ذلك إلى إجراء المقاطع النسيجية إلجراء التلوين المناعي على المقاطع النسيجية التلوين الكيميائي النسيجي المناعي لمستضد تكاثر الخلية النووي Immunohistochemical staining of PCNA 5-µm تمت بعد الحصول على مقاطع نسيجية بسماكة إزالة شمع البارافين عن األنسجة كالمعتاد بوساطة الكزيلين xylene تلتها عملية إعادة إماهة rehydration األنسجة من خالل تمريرها في أحواض تحوي تراكيز متدرجة حتى الوصول إلى الماء متناقصة من الكحول اإليثيلي المقطر. غسلت المقاطع بعد ذلك بمحلول ملحي نظامي أضداد Monoclonal الفأرية أحادية الن سيلة PCNA counter- mouse antibodies بنسبة.1:200 ل و نت المقاطع النسيجية بعد ذلك تلوينا معاكسا stained لمدة 2-1 دقيقة باستعمال الهيماتوكسلين.(Sigma, St Louis, MO, USA) hematoxylin ق ي م ت إيجابية التلوين المناعي من خالل الفحص بالمجهر الضوئي Japan( )Nikon, ومن ثم تم تحديد النسبة المئوية للخاليا إيجابية التل ون التحليل اإلحصائي Statistical analysis تمت معالجة النتائج إحصائيا باستخدام الحاسوب computer المعروفة وذلك باالعتماد على برمجية اإلحصاء Prism5).(GraphPad حيث تم تحديد مدى أهمية الفروق اإلحصائية فيما يتعلق بمتوسطات أوزان الجرذان ومتوسطات أعداد وأحجام أورام القولون وم ن س ب توسيم مستضد تكاثر الخلية النووي ( باستعمال تحليل التباين وحيد التصنيف )PCNA-LI one- way analysis of variance (ANOVA) Tukey متبوعا باختبار للمقارنات المتعددة Tukey's Multiple Comparison test في حين تم تحديد مدى أهمية الفروق اإلحصائية في نسبة حدوث األورام باستخدام اختبار فيشر tumor incidence.fisher's exact test اعت برت الفروق جوهرية وذات أهمية إحصائية عند مستوى الداللة (0.05>P). تم إنجاز الرسوم البيانية باستخدام Excel النتائج Results التغيرات الحاصلة في أوزان الجرذان أفلحت جميع الجرذان بالبقاء على قيد الحياة حتى نهاية التجربة وحافظت إلى حد ما على حالة صحية طبيعية ظاهريا. ولدى قياس أوزان الجرذان في نهاية التجربة ( نهاية األسبوع الثاني والعشرين( لوحظ انخفاض وسطي أوزان جرذان مجموعة شاهد التسرطن carcinogen control بشكل م عتد إحصائيا مقارنة بوسطي أوزن جرذان مجموعة مدروء بالفوسفات )PBS( phosphate- buffered.saline جرى بعدها إنجاز عملية التلوين الكيميائي النسيجي المناعي وفقا للتعليمات المرفقة بالعتيدة المستخدمة kit( )Peroxidase/DAB detection وذلك بعد تمديد المجلد الرابع العدد التاسع جمادى األول 1434 آذار )مارس(

46 الشاهد الطبيعية (0.05>P) normal control في حين سج ل وسطي أوزان جرذان مجموعة NsE )التي تلقت جرعات وقائية من خالصة حبة البركة( انخفاضا لم يكن بذي أهمية من الناحية اإلحصائية significant( )not (0.05>P) والجدول رقم 1 يوضح االختالفات الم الح ظة في أوزان جرذان المجموعات التجريبية كافة حيث جرى التعبير عن األوزان كمتوسط حسابي ± Mean االنحراف المعياري.standard deviation الجدول 1: متوسط أوزان جرذان المجموعات التجريبية في نهاية التجربة) مقدرة بالغرام(. مجموعات حيوانات التجربة المجموعة األولى )الشاهدة الطبيعية( المجموعة الثانية )شاهد التسرطن( المجموعة الثالثة )NsE( ± ± ± 19.1 الوزن النهائي النسبة المئوية لحدوث األورام أظهر الفحص العياني بأن توزع األورام المتشكلة في القولون في نهاية األسبوع الثاني والعشرين من بداية التجربة كان متركزا بشكل رئيس في القولون األوسط.distal والقولون القاصي middle لوحظ بأن نسبة حدوث أورام القولون كانت %100 في مجموعة شاهد التسرطن مما يعني إصابة كافة جرذان هذه المجموعة بأورام في القولون نتيجة البروتوكول المستخدم من المادة المسرطنة.)DMH( في حين انخفضت نسبة اإلصابة بأورام القولون بشكل م عتد إحصائيا إلى %62.5 لدى مجموعة NsE التي تلقت جرعة يومية من خالصة حبة البركة )بما يعادل 150 ملغ من مسحوق البذور/ كيلو غرام من وزن الجرذ( خالل فترة تحريض أورام القولون ولم ي الحظ حدوث أية أورام لدى جرذان المجموعة الشاهدة الطبيعية والشكل 1. يوضح ن س ب حدوث األورام لدى مجموعات التجربة Incidence % NsE Carcinogen controlnormal control 0 الشكل 1: مقارنة نسب حدوث أورام القولون لدى جرذان مجموعات التجربة. المجلد الرابع العدد التاسع جمادى األول 1434 آذار )مارس(

47 المجلة العربية للعلوم الصيدلية- مجلة اتحاد الجامعات العربية متوسط عدد األورام أدى إعطاء الجرعات اليومية الفموية من خالصة حبة البركة خالل طور تحريض أورام القولون إلى تراجع جوهري ذي داللة إحصائية (0.05>P) في متوسط عدد األورام المتشكلة. الشكل متوسط أحجام األورام نجحت خالصة حبة البركة في تقليص أحجام األورام المتشكلة في القولون بشكل معتد إحصائيا (0.05>P) كما ي ظهر الشكل NsE 5.37 Carcinogen control 0 Normal control Multiplicity الشكل 2: مقارنة متوسطات أعداد أورام القولون لدى جرذان مجموعات التجربة NsE Carcinogen control 0 Normal control Mean Tumor Volume (mm3) الشكل 3: مقارنة متوسطات أحجام أورام القولون لدى جرذان مجموعات التجربة. المجلد الرابع العدد التاسع جمادى األول 1434 آذار )مارس(

48 5. 3. نتائج التلوين الكيميائي النسيجي المناعي لمستضد تكاثر الخلية النووي ( )PCNA أظهر التلوين المناعي للمقاطع النسيجية ازديادا في منسب توسيم PCNA في مجموعة شاهد التسرطن بالمقارنة مع المجموعة الطبيعية إال أن المجموعة التي تلقت خالصة حبة البركة )NsE( أبدت تراجعا واضحا ذا داللة إحصائية (0.05>P) في معدل التعبير عن PCNA وذلك ما عب ر عنه االنخفاض الملموس في قيمة منسب توسيم.PCNA PCNA - LI % NsE Carcinogen Control Normal Control 0 الشكل 4: مقارنة منسب توسيم مستضد تكاثر الخلية النووي في القولون لدى جرذان التجربة..4 المناقشة Discussion تطرق العديد من الدراسات للتأثيرات المضادة لألورام التي تتمتع بها مكو نات بذور حبة البركة والخالصات المتنوعة المحضرة منها فقد أثبتت دراسة Salomi [26] وزمالئه تشكل وظهور األورام الحليمية papilloma وإلى إنقاص أعداد تلك األورام في فئران المختبر. [27] كما أفضت الدراسة السابقة ذاتها إلى أن إعطاء خالصة بذور حبة البركة بجرعة مقدراها 100 ملغ/كيلو غرام حقنا داخل الصفاق intraperitoneal أدى إلى انحسار تشكل ساركوما األنسجة الرخوة soft tissue sarcomas المحرضة بمركب 20-methylcholanthrene في الفئران إلى %33. تناولت دراسة أخرى [28] أجريت في الزجاج vitro( )in التأثيرات الس م ية للخاليا fixed التي يحتمل أن يملكها الزيت الثابت cytotoxicity oil و مركبان نقيان آخران مستخلصان من زيت بذور حبة البركة العطري )هما الثيموكينون Thymoquinone و ثنائي الثيموكينون )dithymoquinone تجاه بعض خطوط الخاليا السرطانية البشرية المعن دة على العالج أن الخالصة الميثانولية methanol extract تمتلك تأثيرات سامة cytotoxic قوية تجاه العديد من أنماط الخاليا السرطانية ( carcinoma Erlich ascites sarcoma 180 Dalton's ascites lymphoma.)cells باإلضافة لذلك و جد بأن التطبيق الموضعي topical application لخالصة من بذور حبة البركة أدى إلى تثبيط تسرطن الجلد المحرض كيميائيا باستخدام مركب dimethylbenz[a]anthracene كما أدى إلى تأخير بدء المجلد الرابع العدد التاسع جمادى األول 1434 آذار )مارس(

49 المجلة العربية للعلوم الصيدلية- مجلة اتحاد الجامعات العربية باألدوية multidrug-resistant وقد أظهرت النتائج بأن الزيت مجر د من أية فعالية س م ية للخاليا خالفا لم رك ب ي Thymoquinone و dithymoquinone اللذين أبديا أثرا س م يا جليا تجاه كافة الخطوط الخلوية السرطانية الم ختبرة. أكدت الدراسات الحديثة الم جراة في الزجاج قدرة مركب )TQ( Thymoquinone على تثبيط تكاثر خاليا سرطان القولون [30, 29] وخاليا سرطان الموثة prostate cancer [32, 31] cells اللمفاوية وخاليا سرطان الحنجرة وخاليا سرطان ابيضاض األرومات [33] lymphoblastic leukemia cells [34]. باإلضافة لذلك فقد أظهر مركب صابونين ثالثي التربين laryngeal carcinoma cells α-hederin )وهو )triterpene saponin الذي تم عزله من بذور حبة البركة تأثيرا معتبرا في تثبيط األورام في الفئران ]36 35[. على الرغم من وفرة الدراسات التي تناولت قدرة مكونات بذور حبة البركة أو الخالصات المتنوعة المحض رة منها على الوقاية من أنماط متعددة من األورام السرطانية المحر ضة في حيوانات التجربة وعلى تثبيط نمو بعض الخطوط الخلوية السرطانية في الزجاج إال أن الدراسات التي قي مت الفعالية المضادة لألورام التي تتمتع بها الخالصة اإليثانولية ethanolic extract قليلة جدا فقد أثبتت دراسة ]37[ vitro التأثيرات الس مي ة لبذور حبة البركة ال تزال تم إجراؤها في الزجاج in cytotoxic effects لهذه الخالصة تجاه أنماط محددة من خطوط الخاليا السرطانية كخاليا سرطان الكبد )HepG2( وخاليا سرطان الرئة carcinoma( )Lewis lung كما و جد بأن الخالصة الكحولية لبذور حبة البركة تمتلك القدرة على تثبيط خاليا سرطان الثدي )MCF-7( في الزجاج. ]38[ وعليه فقد جاءت دراستنا هذه التي أجريت في الكائن الحي in vivo بهدف استقصاء فعالية الخالصة اإليثانولية لبذور حبة البركة المزروعة في سوريا وتقييم قدرتها على تثبيط تكو ن أورام tumorigenesis القولون المحرضة تجريبيا لدى جرذان المختبر باستخدام مادة ثنائي ميثيل الهيدرازين )DMH( المعروفة بقدرتها النوعية على تحريض تسرطن القولون. أثبتت نتائج هذه الدراسة أن إعطاء الخالصة الكحولية بجرعة فموية يومية تكافئ 150 ملغ من البذور الجافة/ كيلو غرام لمدة عشرة أسابيع خالل طور تحريض تسرطن القولون - أي بالتزامن مع البرتوكول protocol الم تبع من المادة المسرطنة- أد ى إلى تثبيط تسرطن القولون المحرض كيميائيا لدى الجرذان وذلك ما تجلى بحدوث انخفاض واضح في نسبة حدوث أورام القولون وتناقص جوهري في متوسط عدد األورام وتراجع بارز في أحجام األورام المتشكلة لدى الجرذان التي تلق ت جرعات الخالصة اإليثانولية مقارنة بجرذان مجموعة شاهد التسرطن.carcinogen control كما برهنت هذه الدراسة أن قدرة الخالصة اإليثانولية لبذور حبة البركة على تثبيط تسرطن القولون كانت مترافقة بحدوث نقص معتبر في منسب توسيم PCNA- ( PCNA )LI في القولون لدى الجرذان التي تلق ت الخالصة مقارنة بنظرائها في مجموعة شاهد التسرطن. من المعروف جيدا بأن PCNA هو بروتين مساعد DNA ( إلنزيم ب ول يم يراز الد نا دلتا auxiliary protein ) polymerase delta يصل التعبير عنه إلى ذروته خالل الطور )S-phase( S من الدورة الخلوية cell cycle ويلعب دورا محوريا في التكاثر الخلوي cellular ]39[ proliferation. است خدم منسب توسيم مستضد تكاثر الخلية النووي )PCNA-LI( منذ زمن واصما بيولوجيا biomarker في دراسات الوقاية الكيميائية chemoprevention من سرطان القولون والمستقيم ]40[ A فقد وجدت إحدى الدراسات على سبيل المثال بأن فيتامين ساهم في تحقيق وقاية كيميائية من سرطان القولون ترافقت مع انخفاض معتد في خ ل ص ت دراسة أخرى ]41[ كما PCNA-LI إلى أن قدرة كل من الشاي األسود واألخضر على الوقاية من سرطان القولون كانت مترافقة مع هبوط في معدل التعبير عن PCAN قاد القائمين بالدراسة إلى االستنتاج بأن قدرة كل من الشاي األخضر المجلد الرابع العدد التاسع جمادى األول 1434 آذار )مارس(

50 ة واألسود على تثبيط التكاثر الخلوي تشكل إحدى اآلليات التي يمارسان فيها فعاليتهما في الوقاية من سرطان القولون. ]42[ باإلضافة لذلك بات من المؤكد بأن زيادة التعبير عن PCNA في بؤر الخبايا الزائغة في القولون colonic (ACF) aberrant crypt foci والتي ت عرف بكونها آفات ما قبل ورمية pre-neoplastic lesions يحمل في طياته مخاطر ترقي أورام القولون وتحو لها إلى الخ باثة ]43[ malignancy ي زاد على ذلك بأن األورام التي يرتفع فيها التعبير عن PCNA تميل ألن تسلك سلوكا أكثر عدائية more aggressive مقارنة بتلك األورام ذات معدالت التكاثر الخلوي المنخفضة المترافقة مع هبوط واضح في. ]44[ مستويات PCNA بناء على ما سبق وفي ضوء النتائج التي توص لت إليها هذه الدراسة فيما يتعلق باالنخفاض الملموس ذي الداللة اإلحصائية في منسب توسيم )PCNA-LI ( PCNA ضمن نسيج القولون يمكن القول بأن خالصة حبة البركة تمتلك فعالية معتبرة في الوقاية الكيميائية من سرطان القولون المح رض كيميائيا لدى جرذان المختبر وبأنها قادرة على تثبيط عملية تكو ن األورام tumorigenesis وكبح جماح النمو الورمي خالل طور التحريض. إن فعالية خالصة حبة البركة في تحقيق هذه الوقاية الكيميائية وفي اعتراض حدثيات تطو ر تنش ؤات القولون ونموها تعود على األقل في جانب منها إلى قدرة هذه الخالصة على تثبيط التكاثر الخلوي.cellular proliferation ورغم أن بعض الدراسات السابقة ] [ استقصت فعالية مرك ب الثيموكينون على اعتباره الجوهر الفعال active principle المثبط لتكاثر الخاليا الورمية في بذور حبة البركة ورغم أن تلك الدراسات ربطت تأثيرات هذه البذور المضادة لألورام بوجود ذلك المر كب فيها إال أن مثل هذه الدراسات استخدمت جرعات عالية من الثيموكينون )6 و 10 ملغ/ كيلوغرام( يستحيل بلوغها من خالل تقديم جرعة قليلة من حبة البركة كتلك الجرعة المستخدمة )على فرض احتوائها على الثيموكينون( في هذه الدراسة والتي أثبتت فعاليتها في تثبيط التكاثر الخلوي وفي كبح تسرطن القولون األمر الذي يوحي بأن الثيموكينون قد ال يكون المركب الفعال الوحيد الذي يمكن أن نعزو إليه تلك الفعالية المثبطة لتكاثر خاليا أورام القولون. بل على العكس حتى أن دراسة ]48[ Rooney and Ryan أفضت إلى نتيجة مفادها بأن الثيموكينون ال يملك أية فعالية تجاه خاليا HT-29.colon adenocarcinoma المأخوذة من سرطان القولون الغ د ي وعليه فإن مساهمة عناصر فعالة أخرى من بين العناصر التي تضم ها خالصة حبة البركة بآليات تأثيرها المتنوعة وتأثيراتها التآزري ة synergistic effects المحتملة ال يمكن تجاهلها وإغفال أهميتها في تكوين المحصلة النهائية لتأثير خالصة حبة البركة المثبط لتكاثر خاليا أورام القولون كما أن اآللية التي تحقق من خاللها خالصة حبة البركة تأثيرها الوقائي تجاه تسرطن القولون المحر ض كيميائيا قد ال تقتصر فقط على دورها في تثبيط التكاثر الخلوي فقد يكون هذا التأثير الوقائي مرتبطا على سبيل المثال بخواص مضادة لألكسدة antioxidant أو فعالي كانسة للجذور الحرة radical scavenging activity من الممكن أن تمارسها خالصة حبة البركة تكون بمثابة درع يقي المادة الوراثية من األذي ات والطفرات التي تقدح زنا دها المادة المسرطنة المستخدمة )DMH( كما يمكن أن يكون الحتواء الخالصة على مركبات تحر ض الموت الخلوي المبرمج apoptosis في خاليا القولون - التي فشلت في إصالح تلك العيوب التي خل فتها المادة المسرطنة- أثر محتمل في تحقيق الفعالية الوقائية من تفاقم تسرطن القولون. وقد تكون لخالصة حبة البركة قدرة على رفع كفاءة عناصر الجهاز المناعي وتحفيزها والسيما تلك العناصر المضطلعة بمهام محاربة الخاليا السرطانية مما يسهم في منح هذه الخالصة فعاليتها في الوقاية من تطور أورام القولون. كما يمكن أن تلعب خالصة حبة البركة دورا محتمال في إزالة س مي ة detoxification المادة المسرطنة من خالل تثبيط األنزيمات الكبدية المسؤولة عن استقالب المادة المجلد الرابع العدد التاسع جمادى األول 1434 آذار )مارس(

51 المجلة العربية للعلوم الصيدلية- مجلة اتحاد الجامعات العربية المسرطنة وقد يكون لذلك دور بارز في تفسير فعاليتها في الوقاية من تسرطن القولون وذلك عبر مساهمتها في إنقاص كمية مستقلب metabolite azoxymethane المادة المسرطنة وهو الذي ي عتبر الشكل الفعال القادر على إحداث الطفرات التي تفضي في النهاية إلى تشكل أورام القولون. إال أن جميع هذه الفرضيات المقترحة لتفسير آلية تأثير )NsE( في الوقاية من تسرطن القولون تبقى بحاجة إلى المزيد من التمحيص والدراسة المستفيضة إذ أنه من الضروري في بادئ األمر تجزئة الخالصة وتحليل مكوناتها تحليال كيفيا qualitative وتحليال كميا quantitative والسيما أن طبيعة المكونات ومقاديرها ضمن بذور حبة البركة البد أن تختلف شأنها في ذلك شأن مكونات جميع النباتات باختالف شروط الزراعة ( كالتربة والتسميد والري ( واختالف المناخ ومواعيد الجني وظروف الحفظ والتخزين..5 االستنتاج conclusion بالنظر إلى م جمل النتائج يمكن القول بأن الدراسة الحالية التي أجريت في الكائن الحي in vivo قدمت دليال واضحا على أن الخالصة اإليثانولية لبذور حبة البركة تمتلك فعالية في الوقاية الكيميائية chemoprevention من تسرطن القولون نعتقد أنها ناجمة على األقل في جانب منها عن قدرة هذه الخالصة على تثبيط التكاثر الخلوي وذلك ما تجلى بحدوث تراجع بارز في معدالت التعبير النسيجي عن مستضد تكاثر الخلية النووي )PCNA( في القولون إال أنه من الضروري بذل جهود إضافية لتحليل الخالصة وتكريس المزيد من األبحاث الختبار الفرضيات المقترحة بغية تحديد آليات التأثير األخرى المحتملة التي تمارس من خاللها خالصة حبة البركة دورها في الوقاية من تسرطن القولون المحرض كيميائيا لدى الجرذان. تقد م نتائج هذه الدراسة أسلوبا فع اال قد يكون من االستفادة منه في الوقاية األولي ة الممكن primary prevention من سرطان القولون عند البشر في المستقبل القريب. المراجع References 1- Ferlay, J., et al. GLOBOCAN: Cancer Incidence, Mortality and Prevalence Worldwide. IARC Cancer Base No.5, version 2.0. Lyon: IARC Press, Ferlay, J., et al. Cancer Incidence and Mortality Worldwide: IARC Cancer Base No.10. Lyon, Msallati, Z., et al. Cancer Incidence in Syria, National Cancer Registry, Cancer Prevention Directorate, Ministry of Health, Damascus, Hawk, E.T., et al. Colorectal cancer chemoprevention: an overview. Gastroenterology, 126, , Saad, SI. Classification of flowering plants. 2 nd edition. Alexandria: The General Egyptian Book Co., 412-3, Jansen, P.C.M. Spices, condiments and medical plants in Ethiopia: Their taxonomy and agricultural significance. Publisher: Center for Agricultural Publishing and Documentation. Addis Ababa, 76-85, Aggarwal, B.B., et al. Potential of spice-derived phytochemicals for cancer prevention. Planta Med., 74, , El-Alfy, T., et al. Isolation and structure assignment of an anti-microbial principle from the volatile oil Nigella sativa L. Pharmazia, 30, , Morsi, N.M. Antimicrobial effect of crude extracts of Nigella sativa on multiple antibiotics- المجلد الرابع العدد التاسع جمادى األول 1434 آذار )مارس(

52 action. Gen Pharmacol., 24, , Dehkordi, F.R., et al. Antihypertensive effect of Nigella sativa seed extract in patients with mild hypertension. Fundam Clin Pharmacol., 22, , Al-Hader, A., et al. Hypoglycaemic effects of the volatile oil of Nigella sativa. Int J Pharmacognosy, 31, , Suboh, S.M., et al. Protective effects of selected medicinal plants against protein degradation, lipid peroxidation and deformability loss of oxidatively stressed human erythrocytes. Phytother Res; 18, 280 4, Burits, M., et al. Antioxidant activity of Nigella sativa essential oil. Phytother Res; 14, 323 8, Ramadan, M.F., et al. Radical scavenging activity of black cumin (Nigella sativa L.), coriander (Coriandrum sativum L.), and niger (Guizotia abyssinica Cass.) crude seed oils and oil fractions. J Agric Food Chem., 51, , Randhawa, M.A., et al. A review of the pharmaco-therapeutic effects of Nigella sativa. Pakistan J. Med. Res. 41(2), 77 83, Khan, M. A., et al. Anticancer Activities of Nigella Sativa (Black Cumin), Afr J Tradit Complement Altern Med., 8(5S), , Salomi, M.J., et al. Inhibitory effects of Nigella sativa and saffron (Crocus sativus) on chemical carcinogenesis in mice. Nutr Cancer; 16, 67-72, Salomi, N.J., et al. Antitumour principles from Nigella sativa seeds. Cancer Lett., 63, 41-46, resistant bacteria. Acta Microbiol Pol., 49, 63 74, Abdel-Fattah, M., et al. Anti-nociceptive effects of Nigella sativa oil and its major components in mice. Eur J Pharmacol., 400, 89 97, Houghton, P.J., et al. Fixed oil of Nigella sativa and derived thymoquinone inhibit eicosanoid generation in leukocytes and membrane lipid peroxidation. Planta Medica, 61, 33-36, Mutabagani, A., et al. Study of the anti-inflammatory activity of Nigella sativa L. and thymoquinone in rats. Saudi Pharm J., 5, 110 3, Chehl, N., et al. Anti-inflammatory effects of the Nigella sativa seed extract, thymoquinone, in pancreatic cancer cells. HPB (Oxford), 11, , Mahfouz, M., et al. The effect of nigellon therapy on the histaminopexic power of blood sera asthmatic patients. Arzneimittelforschung; 15, , Boskabady, M.H., et al. Antiasthmatic effect of Nigella sativa in airways of asthmatic patients. Phytomedicine.; 17(10), , Medinica, R., et al. Immunomodulatory and anticancer activity of Nigella sativa plant extract in humans. Proceedings of the American Association for Cancer Research Annual Meeting. p A2865, El Kadi, M., et al. Nigella sativa and cell mediated immunity. Arch of Aids Res 1, , El Tahir, K.E., et al. The cardiovascular actions of the volatile oil of the black seed (Nigella sativa) in rats: elucidation of the mechanism of المجلد الرابع العدد التاسع جمادى األول 1434 آذار )مارس(

53 المجلة العربية للعلوم الصيدلية- مجلة اتحاد الجامعات العربية seeds of Nigella sativa. Planta Medica; 67, 29-32, Swamy, S.M., et al. Intracellular glutathione depletion and reactive oxygen species generation are important in alpha-hederin-induced apoptosis of P388 cells. Mol Cell Biochem., 24, , Swamy, S.M., et al. Cytotoxic and immunopotenciating effects of ethanolic extract of Nigella sativa L. seed. J. Ethnopharmacol. 70(1), 1 7, Farah IO, et al. Effect of Nigella sativa (N. sativa L.) and oxidative stress on the survival pattern of MCF-7 breast cancer cells. Biomed Sci Instrum., 39, , Hall, P.A., et al. Proliferating cell nuclear antigen (PCNA) immunolocalization in paraffin sections: an index of cell proliferation with evidence of deregulated expression in some neoplasm. J Pathol., 162, , Zhang, X.Q. Progress of study on suppresser, EGFR and PCNA in colorectal cancer. Xin Xiaohuabingxue Zazhi, 4, , Zheng, Y., et al. Prevention by retinoids of azoxymethane induced tumors and aberrant crypt foci and their modulation of cell proliferation in the colon of rats. Carcinogenesis, 18, , Jia XD, Han C. Chemoprevention of tea on colorectal cancer induced by dimethylhydrazine in Wistar rats. World J Gastroentero, 6(5), Shpitz B, et al. Proliferating nuclear antigen as a marker of cell kinetics in aberrant crypt foci hyperplastic polyps, adenomas, and 28- Worthen, D.R., et al. The in vitro anti-tumor activity of some crude and purified components of blackseed, Nigella sativa L. Anticancer Res; 18, , El-Najjar, N., et al. Reactive oxygen species mediate thymoquinone-induced apoptosis and activate ERK and JNK signaling. Apoptosis; 15, , Gali-Muhtasib, H., et al. Thymoquinone triggers inactivation of the stress response pathway sensor CHEK1 and contributes to apoptosis in colorectal cancer cells. Cancer Res., 68, , Richards, L.R., et al. The physiological effect of conventional treatment with epigallocatechin-3-gallate, thymoquinone, and tannic acid on the LNCaP cell line. Biomed Sci Instrum., 42, , Richards, L.R., et al. A comparison of the morphological changes associated with conventional and sustained treatment with pigallocatechin- 3gallate, thymo-quinone, and tannic acid on LNCaP cells. Biomed Sci Instrum., 44, , Alhosin, M., et al. Induction of apoptosis by thymoquinone in lymphoblastic leukemia Jurkat cells is mediated by a p73-dependent pathway which targets the epigenetic integrator UHRF1. Biochem Pharmacol., 79, , Womack, K., et al. Evaluation of bioflavonoids as potential chemotherapeutic agents. Biomed Sci Instrum., 42, , Swamy, S.M.K., et al. Isolation and characterization of antitumor principle, alpha-hederin, from the المجلد الرابع العدد التاسع جمادى األول 1434 آذار )مارس(

54 growth in vivo. Fundam Clin Pharmacol. doi: /j x. [Epub ahead of print] 2012 Jun Yi, T., et al. Thymoquinone inhibits tumor angiogenesis and tumor growth through suppressing AKT and ERK signaling pathways. Mol Cancer Ther, 7(7), , Rooney, S., et al. Modes of action of alpha-hederin and thymoquinone, active constituents of Nigella sativa, against HEp-2 cancer cells. Anticancer Res., 25, , adenocarcinomas of the human colon. Am J Surg., 174,425 30, Longo D, HARRISON S Hematology and Oncology, Page 325, McGraw Hill, New York, Gali-Muhtasib, H., et al. Thymoquinone reduces mouse colon tumor cell invasion and inhibits tumor growth in murine colon cancer models. Journal of Cellular and Molecular Medicine, 12(1), , Attoub, S., et al. Thymoquinone as an anticancer agent: evidence from inhibition of cancer cells viability and invasion in vitro and tumor المجلد الرابع العدد التاسع جمادى األول 1434 آذار )مارس(

55 المجلة العربية للعلوم الصيدلية- مجلة اتحاد الجامعات العربية دراسة الثبات الضوئي المسرع لسيبروفلوكساسين و لوميفلوكساسين في المضغوطات و القطرات العينية Studying the accelerated photostability of ciprofloxacin and lomefloxacin in tablets and eye drops زينب مندو محمد عامر المارديني قسم الكيمياء الصيدلية و المراقبة الدوائية- كلية الصيدلة جامعة دمشق سورية الملخص Abstract جرى في هذا العمل تحري الثبات الضوئي الثنين من الفلوروكينولونات: سيبروفلوكساسين ولوميفلوكساسين في شكلين صيدالنيين: مضغوطات وقطرات عينية ضمن حجيرة الثبات الضوئي. تم تعريض سيبروفلوكساسين ولوميفلوكساسين للشروط القاسية وأمكن فصل نواتج التخرب بشكل جيد عن قمة المادة الفعالة. درس ثبات هذين المركبين بعد التعرض للضوء مباشرة دون تغليف وكذلك ضمن العبوات داخل حجيرة الثبات. تمت مقايسة المادة الفعالة في العينات مباشرة وبعد أشهر باستخدام طرائق استشراب سائل رفيع اإلنجاز مؤشرة للثبات مع مكشاف مصفوف الديودات و باستخدام عمود (250x4.6mm,5µm) C18. تألف الطور المتحرك من حمض الفوسفوريك 0.025M و أسيتونتريل )13:87( بمعدل تدفق 2 مل/د وبطول موجة 278 نانومتر من أجل سيبروفلوكساسين في حين تألف من ماء : أسيتونتريل: تري إيتيل أمين) 0.3:20:80 ) بمعدل تدفق 1 مل/د و بطول موجة 288 نانومتر من أجل لوميفلوكساسين. تم التحقق من مصدوقية هاتين الطريقتين بشكل مالئم من أجل الخطية المضبوطية الدقة اإلنتقائية والمتانة فكانت جميع معايير المصدوقية ضمن المجال المقبول. أظهر تحليل البيانات أن العبوات البالستيكية والكهرمانية غير قادرة على حماية سواء سيبروفلوكساسين أو لوميفلوكساسين في القطرات العينية من التخرب الضوئي بعد شهر واحد ضمن الحجيرة بينما يحمي البليستر الحليبي كال العاملين في صيغة المضغوطات من التخرب بعد 6 أشهر من التعرض للضوء داخل الحجيرة. In this work the photostability of two fluoroquinolones: Ciprofloxacin and lomefloxacin has been detected in tablets and eye drops formulations using light-stability cabinet. Ciprofloxacin and lomefloxacin were subjected to stress conditions. The degradeation products were well separated from the peak of the active substance. The stability of these compounds has been studied both in containers and under direct light in the light-stability cabinet. Samples were assayed immediately and at 1,3,6 months by stability-indicating high performance liquid chromatography methods with photodiode array detector. The determination was performed on C18 (250x4.6mm,5µm). The first mobile phase consisted of 0.025M phosphoric acid and acetonitrile (87:13) pumped at a flow rate 2ml/min for ciprofloxacin, while the second consisted of water, acetonitrile, triethylamine (80:20:0.3) pumped at a flow rate 1ml/min for lomefloxacin. The UV detector was operated at 278 nm for ciprofloxacin and 288 nm for lomefloxacin. The methods was suitably validated for linearity, accuracy, precision, robustness and selectivity. All validation parameters were within the acceptance range. Data analysis revealed that plastic and amber containers can not protect either ciprofloxacin or lomefloxacin in eye drops formulation from photodegradation after one month in the cabinet. White blister protect the two agents in tablets formulation after six months in the cabinet. الكلماااااااااات المفتااااااااااح :Key Words سيبروفلوكساسيييييييييين Ciprofloxacin لوميفلوكساسيييييييييين Lomefloxacin االستشييييراب السييييائل رفيييييع اإلنجيييياز High performance liquid chromatography طييييرق تحليلييييية مؤشييييرة للثبيييييات Stability-indicating analytical methods الثبيييييات الضيييييوئي Photostability مضيييييغوطات Eye drops قطرات عينية Tablets المجلد الرابع العدد التاسع جمادى األول 1434 آذار )مارس(

56 مقدمة :Introduction اكتسبت الفلوروكينولونات خالل األعوام الخمسة عشر الماضية شهرة كبيرة في عالج األخماج الجرثومية حيث تمثل الفلوروكينولونات صفا من المضادات الحيوية ذات القدرة العالجية الممتازة والتي ترتبط بطيفها الواسع المضاد للجراثيم فعاليتها عن طريق الفم ألفتها للدسم وارتباطها المنخفض ببروتينات البالسما مما يسمح باختراق وتراكيز نسيجية ممتازة. )6 1( حظيت الكينولونات منذ اكتشافها عام 1960 باهتمام واسع فأجريت حولها دراسات مستفيضة من حيث عالقة البنية ب: التأثير الطيف الجرثومي الحرائك الدوائية واآلثار الجانبية وبشكل خاص السمية الضوئية حيث يقدر أن هناك أكثر من مضاهئ لحمض النالديكسيك تم اصطناعه )3 13(. تقسم الكينولونات إلى أربعة أجيال استنادا إلى طيفها الجرثومي )9( ويمثل الشكل )1( نواة الكينولون. )13( الشكل )1( نواة الكينولون تتعلق السمية الضوئية بمدى قابلية المركب الكينولوني للتخرب الضوئي وقدرته على توليد جذور أوكسجين حرة oxygen free radicals حيث تهاجم هذه األنواع الفعالة من األوكسجين الغشاء الليبيدي الخلوي مما يؤدي إلى تشكل فوق أكاسيد الليبيدات وحدوث االلتهاب الالحق lipid )2(. peroxidation and subsequent inflammation يعد سيبروفلوكساسين أكثر الفلوروكينولونات استخداما وذلك بسبب طيفه الواسع و توافره الحيوي الفموي الممتاز )1( أما لوميفلوكساسين فهو أكثر الفلوروكينولونات سمية ضوئية يعرف الثبات على أنه قدرة المادة الدوائية أو المنتج الدوائي على البقاء ضمن المواصفات المحددة للحفاظ على الذاتية identity القوة strength الجودة quality والنقاوة purity خالل إعادة االختبار أو فترات تاريخ الصالحية )10(.expiration date periods Stabilityindicating assay كما تعرف المقايسة المؤشرة للثبات حسب الدليل اإلرشادي لل FDA أنها طريقة تحليلية كمية مصدوقة يمكن أن تتحرى مع الزمن التغيرات في خواص المادة الدوائية والمنتج الدوائي. تقيس المقايسة المؤشرة للثبات المكونات الفعالة بدقة دون تداخل مع نواتج التخرب السواغات أو الشوائب المحتملة األخرى. )4( وضع المؤتمر العالمي للمواءمة في تشرين األول عام 1993 الدليل الخاص باختبار الثبات الضوئيQ1B وقد ورد فيه أن اختبار الضوء يجب أن يكون جزءا مكمال من اختبارات اإلجهاد المجراة لتوضيح خصائص الثبات الحقيقية كما يقدم دليل ICH خيارين لمصادر الضوء المستخدمة في اختبار الثبات الضوئي. )7( يهدف البحث إلى دراسة تأثير الشدة الضوئية على ثبات سيبروفلوكساسين ولوميفلوكساسين في شكلين صيدالنيين هما المضغوطات والقطرات العينية كما جرت دراسة تأثير عبوات التغليف على حمايتهما من الضوء. وقد تم اختيار طرائق مقايسة والتحقق من كونها مؤشرة للثبات ومن ثم التحقق من مصدوقيتها لنتمكن من اعتماد نتائجها. المواد والطرائق Materials and Methods األجهزة Instruments جهاز االستشراب السائل رفيع اإلنجاز HPLC من شركة Hitachi مزود بحاقن آلي طراز 2200-L مضخة تعمل بالنمطين Isocratic Gradient طراز 2130-L جهاز تسخين العمود طراز 2300-L و مكشاف مصفوف الديودات Photodiode array طراز 2450-L وكان العمود المستخدم من شركة KnauerC18.5µm أبعاد جزيئاته (250x4.6mm). )5( المجلد الرابع العدد التاسع جمادى األول 1434 آذار )مارس(

57 المجلة العربية للعلوم الصيدلية- مجلة اتحاد الجامعات العربية )20 5N مل( ثم يعدل التركيز بتمديد المحلول حتى 100 مل باستخدام الماء منزوع الشوارد. -2 يعرض 10 مل من المحلول األم للغليان لمدة ساعة ضمن حمام مائي بعد قلونته ب 20 مل من هيدروكسيد الصوديوم 5N. يتم تعديل الوسط بمحلول حمض كلور الماء )20 5N مل( ثم يعدل التركيز بتمديد المحلول حتى 100 مل باستخدام الماء منزوع الشوارد. -3 يعامل 10 مل من المحلول األم بمحلول الماء األوكسجيني ذو التركيز المحلول لمدة %20 مع التحريك الجيد. يترك 30 دقيقة ثم يعدل التركيز بتمديد المحلول حتى 100 مل باستخدام الماء منزوع الشوارد. -4 يتم حضن 10 مل من المحلول األم في حاضنة ذات درجة حرارة -5 60ºم لمدة أسبوع ثم يعدل التركيز بتمديد المحلول حتى 100 مل باستخدام الماء منزوع الشوارد. يتم حضن 10 مل من المحلول األم في حاضنة ذات درجة حرارة 25ºم مع تعريضها للضوء األبيض لمدة أسبوع ثم يعدل التركيز بتمديد المحلول حتى باستخدام الماء منزوع الشوارد. التحقق من مصدوقية الطرق التحليلية المستخدمة 100 مل جرى التحقق من متثابتات اإلنجاز للطرق التحليلية كما هو مذكور في الدليل اإلرشادي للمؤتمر العالمي للمواءمة حول مصدوقية الطرق التحليلية (R1) )8( ICH Q2 طرق دراسة الثبات: تم إجراء مقايسة للمضغوطات قبل حضن العينات ( الزمن صفر ( بعدها تم حضن عينات من المستحضرات الجاهزة لكل من لوميفلوكساسين و سيبروفلوكساسين ( مضغوطات قطرات عينية ) في حجيرة خاصة باختبارات الثبات الضوئي تتوافق والخيار الثاني لمصادر الضوء المحددة في دليل ICH بحيث تتم المحافظة على درجة حرارة 25ºم ورطوبة نسبية %40 خالل فترة الدراسة البالغة 6 أشهر. تم حضن قسم من العينات بتعريضها للشدة الضوئية مباشرة وقسم آخر تم تعريضه للضوء ضمن عبوته المباشرة أما جهاز أمواج فوق صوتية لطرد الغازات من محاليل األطوار المتحركة من شركة.Rocker.Mettler Toledo جهاز قياس الحموضة من شركة ميزان حساس شركة Sartorius تبلغ حساسيته 0.01 مغ. Sartorius شركة 0.45µm HPLC مراشح المواد Materials خاص بHPLC أسيتونتريل ماء خاص بHPLC حمض الفوسفوريك حمض هيدروكلوريك هيدروكسيد الصوديوم ماء أوكسجيني من شركة Merck وتري إيتيل أمين من شركة.Panreac معياريات standards( )working من مخابر الرقابة الدوائية وزارة الصحة- سورية و مضغوطات وقطرات عينية مصنعة محليا حديثا لكل من لوميفلوكساسين و سيبروفلوكساسين. الطرق Methods طرق المقايسة )12 14( يبين الجدول )1( طريقتي مقايسة سيبروفلوكساسين ولوميفلوكساسين. التحقق من كون الطرق المستخدمة في المقايسة مؤشرة للثبات )11( اعتمد في دراسة كون الطريقة مؤشرة للثبات أقسى الشروط الممكن تطبيقها والتي تشمل: التخريب في وسط حمضي و قلوي التعرض للماء األوكسجيني والتعرض للحرارة و الشدة الضوئية وذلك لتسريع تخريب المادة الفعالة. يتم أوال تحضير محلول معياري لسيبروفلوكساسين ولوميفلوكساسين ثم يتم تحضير محلول ثان )المحلول األم( ذي تركيز يعادل عشرة أضعاف تركيز المحلول المعياري و يعامل كما يلي: 1- يعرض 10 مل من المحلول األم للغليان لمدة ساعة ضمن حمام مائي بعد تحميضه ب 20 مل من حمض كلور الماء. 5N يتم تعديل الوسط بمحلول هيدروكسيد الصوديوم المجلد الرابع العدد التاسع جمادى األول 1434 آذار )مارس(

58 بقية العينات فتم حضنها بعد تغليفها بما يضمن حمايتها من الضوء. تم بعد ذلك مالحظة التغيرات التي طرأت على العينات التي تم حضنها من حيث المظهر ومقايسة المادة الفعالة بطريقة تم التحقق من مصدوقيتها ومقارنة النتائج لمعرفة أثر عامل الشدة الضوئية على ثبات هذه المواد الفعالة في أشكالها الصيدالنية أثناء عمليات التخزين واالستهالك وتحديد أثر عبوات التغليف على ثباتها. )15( االختبارات اإلحصائية: اختبار فيشر :Fisher test تم استخدام اختبار فيشر للمقارنة بين تباينات نتائج مقايسة المادة الفعالة في كل مجموعة من العينات عند درجة الثقة.%95 اختبار ستودنت :Student test تم إجراء اختبار ستيودنت للمقارنة بين األوساط الحسابية لتراكيز المادة الفعالة في كل من الشروط المستخدمة )ضوء ظالم بلستر حليبي عبوة بالستيكية عبوة كهرمانية( باحتمال %95. النتائج والمناقشة Results and discussion التحقق من كون طرق المقايسة مؤشرة للثبات تم التأكد من كون طريقتي مقايسة سيبروفلوكساسين ولوميفلوكساسين مؤشرتان للثبات حيث جرى استخدام أقسى الشروط الممكن تطبيقها لتسريع تخريب المادة الفعالة وأثبتت الطريقة أنها مالئمة لالستخدام في المقايسة الكمية للوميفلوكساسين وسيبروفلوكساسين و دراسة ثباتهما حيث أمكنها أن تفرق إنتقائيا بين المادة الدوائية ونواتج تخربها حيث كان معامل الميز> 1.5 ذلك في المخططات االستشرابية في جميع األوساط و يظهر 2 13 كما بينت الطريقة ثبات كال المركبين في درجات الحرارة المرتفعة حيث لم يحصل أي تخرب بعد حضنهما في درجة حرارة 60º م مدة أسبوع كما يظهر في المخططين االستشرابيين وكذلك حساسيتهما للشدة الضوئية والذي اتضح من خالل التناقص الكبير في تركيزهما بعد التعريض للضوء األبيض مدة أسبوع كما يظهر في المخططين االستشرابيين بالنسبة لألوساط الحمضية والقلوية لم يالحظ أي تخرب عند استخدام حمض هيدروكلوريك وهيدروكسيد الصوديوم بتركيز 0.5N األمر الذي استدعى زيادة التركيز تدريجيا حتى األشكال حيث 5N حصلنا على التخرب المطلوب. تبين المخططات االستشرابية التي تم الحصول عليها بعد تطبيق الشروط القاسية. يبين الجدول )2( معامل الميز و نسب تخرب لوميفلوكساسين الحاصلة بعد تطبيق الشروط القاسية. كمايبين الجدول) 3 ( معامل الميز و نسب تخرب سيبروفلوكساسين الحاصلة بعد تطبيق الشروط القاسية. التحقق من مصدوقية الطرق التحليلية عند التحقق من مصدوقية طريقة مقايسة لوميفلوكساسين وجد أنها طريقة تحليلية ذات مصدوقية أعطت قمة جيدة بزمن احتباس )7.7 الواحد )0.9994( دقيقة( وقيمة معامل انحدار قريبة من مما يدل على خطيتها )الشكل ) 14 وكانت قيمة وسطي النسبة المئوية لالستعادة عند إجراء المضبوطية )102.18( أما عند إجراء التكرارية والدقة الوسطى فكانت قيم االنحراف المعياري النسبي أقل من %2 ) ( على الترتيب. وفي اإلنتقائية كانت نسبة السواغات للمعياري أقل من %2)0.22(. وعند تغيير التدفق إلجراء المتانة ليكون ) ( كانت قيم وسطي النسبة المئوية لالستعادة ) ( وأزمنة االحتباس النسبي ) ( على الترتيب. يوضح الجدول )4( نتائج مصدوقية لوميفلوكساسين. وعند التحقق من مصدوقية طريقة مقايسة سيبروفلوكساسين وجد أنها طريقة تحليلية ذات مصدوقية أعطت قمة جيدة بزمن احتباس )12.2 دقيقة( وقيمة معامل انحدار قريبة من الواحد )0.9983( مما يدل على خطيتها )الشكل )15 وكانت قيمة وسطي النسبة المئوية لالستعادة عند إجراء المضبوطية )101.68( أما عند إجراء التكرارية والدقة المجلد الرابع العدد التاسع جمادى األول 1434 آذار )مارس(

59 المجلة العربية للعلوم الصيدلية- مجلة اتحاد الجامعات العربية الوسطى فكانت قيم االنحراف المعياري النسبي أقل من %2 ) ( على الترتيب وفي اإلنتقائية كانت نسبة السواغات للمعياري أقل من %2 )0.18(. وعند تغيير التدفق إلجراء المتانة ليكون ) ( كانت قيم وسطي النسبة المئوية لالستعادة ) ( وأزمنة االحتباس النسبي ) (على الترتيب. يوضح الجدول )5( نتائج مصدوقية سيبروفلوكساسين. دراسات الثبات على األشكال الصيدالنية: عند تعريض المضغوطات )سيبروفلوكساسين و لوميفلوكساسين( للضوء ضمن حجيرة الثبات لم يكن هناك تناقص في تركيز المادة الفعالة بعد مرور شهر/ 3 أشهر وبعبارة أخرى كان الفارق بين تركيزي المادة الفعالة في الظالم والضوء ظاهريا ليس له داللة إحصائية وفي نهاية فترة التعرض بعد 6 أشهر كان التناقص في تركيز المادة الفعالة جوهريا ذا داللة إحصائية )حوالي %1.5 %4.5 على الترتيب( أي أنه ناتج عن التخرب بفعل الضوء وليس عائدا لقوى الحظ والمصادفة أو إلى أخطاء تحليلية. وعند تعريض المضغوطات للضوء ضمن البلستر الحليبي لم يالحظ تناقص في نسبة المادة الفعالة حتى بعد 6 أشهر من التعرض للضوء وكانت الفوارق ظاهرية. يظهر الجدول) 6 ( مقارنة النتائج اإلحصائية في المضغوطات بعد التعرض للشدة الضوئية. أما بالنسبة للقطرة العينية فقد كان التخرب واضحا منذ الشهر األول من التعرض للضوء )حوالي %30 %84 على الترتيب( كذلك األمر عند تعريض القطرة العينية للضوء ضمن العبوتين الكهرمانية والبالستيكية حيث كان التناقص في تركيز المادة الفعالة جوهريا ذا داللة إحصائية بعد شهر واحد )حوالي %2 في كال العبوتين بالنسبة لسيبروفلوكساسين و 1.5 % في العبوة الكهرمانية و %9 في العبوة البالستيكية بالنسبة للوميفلوكساسين( أي أنه ناتج عن التخرب بفعل الضوء. يظهر الجدول )7( مقارنة النتائج اإلحصائية في القطرة العينية بعد التعرض للشدة الضوئية. الشكل )2( المخطط االستشرابي للمحلول المعياري للوميفلوكساسين الشكل )3( المخطط االستشرابي للمحلول المعياري لسيبروفلوكساسين الشكل )4( المخطط االستشرابي لمحلول لوميفلوكساسين المعالج بحمض هيدروكلوريك 5N الشكل )5( المخطط االستشرابي لمحلول سيبروفلوكساسين المعالج بحمض هيدروكلوريك 5N المجلد الرابع العدد التاسع جمادى األول 1434 آذار )مارس(

60 الشكل )6( المخطط االستشرابي لمحلول لوميفلوكساسين المعالج بهيدروكسيد الصوديوم 5N الشكل )7( المخطط االستشرابي لمحلول سيبروفلوكساسين المعالج بهيدروكسيد الصوديوم 5N الشكل )8( المخطط االستشرابي لمحلول لوميفلوكساسين المعالج بالماء األوكسجيني 20%. الشكل )9( المخطط االستشرابي لمحلول سيبروفلوكساسين المعالج بالماء األوكسجيني 20% الشكل )10( المخطط االستشرابي لمحلول لوميفلوكساسين المحضون في درجة حرارة º60 م لمدة 7 أيام الشكل )11( المخطط االستشرابي لمحلول سيبروفلوكساسين المحضون في درجة حرارة º60 م لمدة 7 أيام الشكل )12( المخطط االستشرابي لمحلول لوميفلوكساسين المعرض للضوء األبيض لمدة 7 أيام الشكل )13( المخطط االستشرابي لمحلول سيبروفلوكساسين المعرض للضوء األبيض لمدة 7 أيام المجلد الرابع العدد التاسع جمادى األول 1434 آذار )مارس(

61 م م المجلة العربية للعلوم الصيدلية- مجلة اتحاد الجامعات العربية الجدول )1 ) طرق مقايسة سيبروفلوكساسين ولوميفلوكساسين المتبعة طريقة مقايسة لوميفلوكساسين طريقة مقايسة سيبروفلوكساسين حرارة العمود حمض الفوسفور : أسيتونتريل بنسبة )13:87(. يتم ضبط ph حمض الفوسفور إلى 3 بواسطة تري إيتيل أمين. )14( 2 مل/ د 278 نانومتر 300 مكغ/مل ماء: أسيتونتريل: تري إيتيل أمين بنسبة ) 0.3:20:80 (على الترتيب. يتم ضبط ph المحلول النهائي إلى 3.3 بواسطة حمض الفوسفور. )12( 1 مل/ د 288 نانومتر 60 مكغ/مل الطور المتحرك معدل االنسياب طول الموجة تركيز المعياري حمض كلور الماء 5N الجدول) 2 ( نتائج تعريض لوميفلوكساسين للشروط القاسية هيدروكسيد الصوديوم 5N الماء األوكسجيني %20 حرارة 60ºم مدة 7 أيام شدة ضوئية مدة 7 أيام %50 %0 %5 %39 %23 نسبة التخرب معامل الميز حمض كلور الماء 5N الجدول) 3 ( نتائج تعريض سيبروفلوكساسين للشروط القاسية هيدروكسيد الصوديوم 5N الماء األوكسجيني %20 حرارة 60ºم مدة 7 أيام شدة ضوئية مدة 7 أيام % %0 - % % % نسبة التخرب معامل الميز الجدول )4( نتائج مصدوقية لوميفلوكساسين زمن االحتباس الخطية المضبوطية الدقة اإلنتقائية المتانة التكرارية الدقة الوسطى R 2 = المجلد الرابع العدد التاسع جمادى األول 1434 آذار )مارس(

62 الجدول )5( نتائج مصدوقية سيبروفلوكساسين زمن االحتباس الخطية المضبوطية الدقة اإلنتقائية المتانة التكرارية الدقة الوسطى R 2 = الجدول )6( مقارنة النتائج اإلحصائية في المضغوطات بعد التعرض للشدة الضوئية متوسط تراكيز العينات لوميفلوكساسين سيبروفلوكساسين الزمن صفر شهر 3 أشهر 6 أشهر الزمن صفر شهر 3 أشهر 6 أشهر ظالم ظالم ضوء ضوء الفارق ظاهري ظاهري جوهري الفارق ظاهري ظاهري جوهري ظالم ظالم بلستر بلستر الفارق ظاهري ظاهري ظاهري الفارق ظاهري ظاهري ظاهري - - الجدول )7( مقارنة النتائج اإلحصائية في القطرات العينية بعد التعرض للشدة الضوئية متوسط تراكيز العينات لوميفلوكساسين سيبروفلوكساسين الزمن صفر شهر 3 أشهر 6 أشهر الزمن صفر شهر 3 أشهر 6 أشهر ظالم ظالم ضوء ضوء الفارق جوهري جوهري جوهري الفارق جوهري جوهري جوهري ظالم ظالم الكهرمانية الكهرمانية المجلد الرابع العدد التاسع جمادى األول 1434 آذار )مارس(

63 المجلة العربية للعلوم الصيدلية- مجلة اتحاد الجامعات العربية البالستيكية البالستيكية الفارق جوهري جوهري جوهري الفارق جوهري جوهري جوهري y = x R² = y = x R² = الشكل) 14 ( الخط البياني لمعادلة االرتداد الخطي للوميفلوكساسين االستنتاجات Conclusions قمنا في هذه الدراسة باستخدام طرائق استشراب سائل رفيع اإلنجاز لمقايسة كل من سيبروفلوكساسين ولوميفلوكساسين حيث تم التحقق من كونها مؤشرة للثبات فقد أمكن من خاللها فصل المادة الفعالة عن نواتج تخربها كما تم التحقق من مصدوقيتها مما يسمح باستخدام هذه الطرق في التحليل الكمي لهذين المركبين بشكلهما الصرف وضمن أشكالهما الصيدالنية في دراسات الثبات بكافة أهدافها. كما تبين إمكانية اعتماد التغليف المصنوع من البلستر الحليبي لتغليف المضغوطات بدال من األغلفة الشفافة التي تمتص الضوء والتي يمكن أن تعرض المضغوطات للتخرب كذلك تجنب العبوات الشفافة في تعبئة القطرات العينية بشكل كامل مع التأكيد على ضرورة االحتفاظ بالقطرة ضمن العبوة النهائية )عبوة داخلية و عبوة خارجية( وليس ضمن عبوتها المباشرة سواء البالستيكية منها أو الكهرمانية. المراجع References 1- Andriole V. The Quinolones.Third Eddition. Academic Press. Pages 33-98, De Sarro A., De Sarro G.. الشكل) 15 ( الخط البياني لمعادلة االرتداد الخطي لسيبروفلوكساسين Adverse Reactions of Fluoroquinolones. An Overview on Mechanistic Aspects. Current Medicinal Chemistry. Volume 8, Emami S., Shafiee A., Foroumadi A. Quinolones: Recent Structural and Clinical Developments. Iranian Journal of Pharmaceutical Research. Volume 3, , Food and Drug Administration, Guidance for Industry: Analytical procedures and methods validation Fish DN. Fluoroquinolone Adverse Effects and Drug Interactions: Specific Adverse Effects. Pharmacotherapy. Volume21(10 pt 2), 253S- 272S Fitton A. The Quinolones. An overview of their pharmacology. Clinical Pharmaco-kinetics. 22(1), 1-11, International Conference on Harmonaization Topic Q1B. Photostability Testing of New Active Substances and Medicinal Products المجلد الرابع العدد التاسع جمادى األول 1434 آذار )مارس(

64 Quantitative determination of gatifloxacin, levofloxacin, lomefloxacin and pefloxacin fluoroquinolonic antibiotics in pharmaceutical preparations by high-performance liquid chromatography. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis.40(1), , Tillotson G.S. Quinolones: structure-activity relationships and future predictions. Journal of Medicinal Microbiology.44, , United States Pharmacopoeia (USP ). 15- آغا ع و حميدان ع. اإلحصاء الحيوي- منشورات جامعة دمشق International Conference on Harmonaization Q2 (R1). Validation of Analytical procerdres:text and Methodology King D., et al. New classification and update on the quinolone antibiotics. American family physician.volume 61, Lucas T., et al. A Stability Program for the Distribution of Drug Products. Pharmaceutial technology , Nilsen C. Managing the Analytical Laboratory. Interpharm Press Inc Santoro M. et al. المجلد الرابع العدد التاسع جمادى األول 1434 آذار )مارس(

65 المجلة العربية للعلوم الصيدلية- مجلة اتحاد الجامعات العربية عزل خاليا ثديي ة جذعية سرطانية من سرطانات ثدي أولي ة وتكثيرها وتنميطها: تأسيس نموذج لتقييم االستجابة ألدوية المعالجة الكيميائية Isolation, Proliferation, and Phenotyping of Cancer Stem Cells from Primary Breast Cancers: Establishing A Model for Evaluating the Response to Chemotherapeutic Agents 1 لمى يوسف 1 ماهر سلمون 2 عصام قاسم 4 3 مجد الجمالي كلية الصيدلة جامعة دمشق مستشفى البيروني الجامعي بدمشق الهيئة العامة للتقانة الحيوية في جامعة دمشق العلوم جامعة دمشق سورية 4 كلي ة الملخص Abstract الخلفي ة: يتعاظم االهتمام بالخاليا الجذعي ة الس رطاني ة (CSCs) cancer stem cells ود ورها البازغ في نشوء وتطو ر السرطانات نظرا لما تمتلكه هذه الجمهرة من الخاليا من خصائص تسمح لها بال تجدد الذاتي وبذر النقائل ومقاومة المعالجات الش عاعي ة والكيميائي ة مم ا يجعل من وجودها بنسب مرتفعة في كتلة الورم مؤش را إنذاري ا سي ئا للن كس وحدوث النقائل وفي اآلن ذاته هدفا عالجي ا واعدا لسرطانات الثدي ضعيفة اإلنذار والناكسة والمعن دة على المعالجة. وبناء على ذلك تزداد الحاجة إليجاد نماذج خلوي ة في الزجاج in vitro cellular models تصون الخصائص األصلي ة للخاليا الجذعي ة الس رطاني ة في الحي بما في ذلك مقاومتها للمعالجات الكيميائي ة وامتالكها القدرة على الت جد د الذاتي self-renewal والت مايز الحقا إلعطاء جمهرات خلوي ة متغايرة ضمن كتلة الورم. الهدف: يهدف هذا البحث إلى الت وصل لنموذج خلوي بحثي يمث ل خاليا بشري ة ثديي ة جذعي ة س رطاني ة يمك ن الباحثين من اختبار عالجات كيميائي ة جديدة و/أو مشاركات عالجي ة ألدوية متوف رة. الطرائق: تم زرع خاليا سرطاني ة من سرطانات ثدي بدئي ة مستأصلة من مريضات سوريات تال ذلك قيامنا بعملي ة تمديد مقي د للحصول على نسائل تم تنميطها باستعمال تقني ة الت دف ق/الجريان الخلوي وعزل جمهرة الخاليا الجذعي ة بناء على مرتسم مستضداتها السطحي ة ) -/low (CD44 +/high / CD24 ومن ثم إغناؤها وتكثيرها عددي ا في أوساط زرعي ة مناسبة في شروط االلتصاق أو شروط ضعيفة االلتصاق واختبار عيوشيتها بصورة تالية لتجميدها وحفظها في اآلزوت الس ائل. النتائج: تمكن ا في هذ البحث من عزل خاليا جذعي ة س رطاني ة من سرطانات ثدي أو لي ة بنقاوة عالية قاربت ال %99 وأثبتنا امتالكها للخصائص الممي زة للخاليا الجذعي ة الس رطاني ة والتي اشتملت على i( مرتسم واسمات سطح الخلي ة D44 high /CD24 -/low )ii وقدرة هذه الجمهرة الخلوي ة عالية الن قاوة على تشكيل مستعمرات كروي ة الشكل تعرف بالكرات الثديي ة الورمي ة Tumorspheres في أوساط الزرع المعل قة غير الملتصقة وiii ( وقدرة جمهرات ال CSCs على إبداء مقاومة أكبر ألدوية المعالجة الكيميائي ة وذلك بالمقارنة مع خاليا ثديي ة ورمي ة غير منق اة. االستنتاج: تبي ن نتائج هذه الد راسة توصلنا لنموذج خلوي بحثي ممث ل لخصائص جمهرة الخاليا الجذعي ة الس رطاني ة يمكن التأسيس عليه للقيام ببحوث مستقبلي ة تسهم في الكشف عن اآلليات المستبطنة لمقاومة سرطان الثدي للمعالجات الكيميائي ة و/أو لحدوث الن قائل ويتيح إجراء اختبارات لتنويعات دوائي ة جديدة أو تحسين االستراتيجات العالجي ة القائمة حاليا من خالل تقييم مشاركات دوائي ة جديدة ألدوية معتمدة في العالجات الحالي ة وبما يمك ن من استهداف مختلف الجمهرات الخلوي ة المكو نة للورم )الخاليا الورمي ة غير الجذعي ة والخاليا الجذعي ة الس رطاني ة( ويؤد ي إلى تحقيق المحصالت العالجي ة المرجو ة لدى المريض. Background: Recent years have witnessed mounting interest in cancer stem cells (CSCs) research due to their unique characteristics including self-renewal, promoting metastasis, and resisting radio- and chemotherapies. High percentage of CSCs in tumor mass is linked to poor prognosis, relapse and metastasis. These properties have led to recognizing CSCs as promising therapeutic targets and necessitated the establishment of in vitro cellular models that preserve the original characteristics of CSCs, i.e. their ability to resist chemotherapy, self-renew and differentiate into heterogeneous cellular populations within the tumor mass. المجلد الرابع العدد التاسع جمادى األول 1434 آذار )مارس(

66 Objective: This study aims at establishing a CSC cellular model that enables evaluating new chemotherapeutics and/or combinatorial therapies of currently existing agents. Methods: We cultured tumor cells obtained from primary breast tumors of Syrian patients. This step was followed by isolating single clones by means of serial dilution. A stem cell population was characterized based on their morphology and surface antigen profile (CD44 +/high /CD24 -/low ) using flow cytometry. Enriched CSCs were cultured in both adherent and non-adherent conditions. The viability of CSCs was evaluated after cryopreservation in liquid nitrogen. Results: In this study, we were able to isolate CSCs from primary breast tumors with approximately 99% purity and well-preserved CSC characteristics including: i) CD44 high /CD24 -/low profile, ii) ability to form tumorspheres in non-adherent/ultra-low adherence conditions, iii) and ability to resist chemotherapeutic agents in comparison with breast tumor non-stem cells. Conclusions: Our findings reveal the establishment of a cellular model that preserves the original characteristics of cancer stem cells. This model may serve as a research tool needed in the efforts to identify the molecular and cellular mechanisms underlying breast cancer resistance to chemo-therapeutics and/or involvement in metastasis. Furthermore, this model might enable evaluating new therapeutic agents or combinatorial therapeutics and/or enhancing the currently approved treatment strategies. Comparative assessment of the effectiveness of drug combinations targeting the different heterogeneous tumor cell populations, i.e. non-stem as well as stem cells, is an obvious application of this model. المقدمة Introduction يعد مرض السرطان أحد أكبر التحديات التي تواجه منظومات الرعاية الصحية في العالم نظرا النتشاره والتكاليف المرتفعة جدا لتدبيره والتي تعكس جزءا من حجمها الميزاني ات الضخمة التي ت رصد في العديد من دول العالم لوسائل تشخيص السرطان ومعالجاته الش عاعي ة والكيميائي ة والجراحي ة. واستنادا إلى مؤشرات المراضة والحالة الصحية للسكان في سورية والتي تضم نتها تقارير صادرة عن وزارة الص حة وتبنتها مسودة الخط ة الخمسي ة الحادية عشرة يتبي ن أن الس رطانات/األورام الخبيثة تشك ل السبب الرابع للوفيات بعد أمراض القلب واألوعية الدموية وأمراض جهاز التنفس وأمراض الخدج في سورية إذ يعزى للسرطانات ما نسبته )%6.7( من مجمل الوفيات في عام )1( يعد سرطان الثدي المسبب الثاني الزدياد معدالت المراضة والوفاة الناجمة عن السرطانات في سورية بعد سرطان الرئة وتبي ن مؤشرات المراضة في سورية أن سرطان الثدي قد احتل المرتبة الرابعة عشر بين أهم األمراض المسببة للعبء المرضي في سورية في عام 2004 ويتوق ع أن يتقد م إلى المرتبة الثامنة وفق اإلسقاطات التنبؤي ة لعام بلغ عدد النساء المصابات/المشخ صات حديثا بالسرطان 2039 امرأة في الفئة العمرية [49-15] في عام 2009 وهذا الر قم يشك ل مانسبته )%26( من إجمالي المرضى الجدد في ذات العام. ورغم ماشهدته العقود المنصرمة من تطوير وتبن للعديد من البروتوكوالت العالجية بما في ذلك العالجات الجراحي ة والكيميائي ة والشعاعي ة ونقل نقي العظام والتي أثبتت جدواها في تحسين البقيا survival وتقليل المراضة morbidity في عدد من السرطانات المختلفة إال أن عودة المرض )أو النكس )recurrence وحدوث النقائل metastasis بعد تطبيق هذه المعالجات أمران شائعا الحدوث وعادة ما يؤديان إلى تردي الحالة الصحي ة للمريضة وقد ينتهيان بها إلى الموت. تم في السنوات األخيرة ربط النكس الحاصل بعد المعالجة المجلد الرابع العدد التاسع جمادى األول 1434 آذار )مارس(

67 المجلة العربية للعلوم الصيدلية- مجلة اتحاد الجامعات العربية وقابلية حدوث النقائل على األقل جزئيا بوجود ما يسم ى "الخاليا الجذعية الس رطاني ة" Cancer Stem Cells (CSCs) والتي توصف بأنها خاليا غير متمايزة تتواجد في العديد من أنماط السرطان وتتصف بمعدل نمو بطيء مع امتالكها لكمون عال النتاج خاليا سلفية Progenitor Cells للخاليا السرطانية تتمايز الحقا إلى خاليا ورمية )2(. وفي حين تبدي الخاليا السرطانية غير الجذعية استجابة لبروتوكوالت مختلفة من العالجات الكيميائية فإن الخاليا الجذعية السرطانية تبدي مقاومة مستمرة لتلك المعالجات وتتميز بمعدالت بقيا مرتفعة. قد ي نقص المعدل البطيء لنمو هذه الخاليا من استجابتها لمعظم العوامل السامة للخاليا والتي تستهدف غالبا االنقسام الخلوي وذلك على عكس الخاليا السرطانية غير الجذعية سريعة النمو. إضافة إلى ذلك فقد أشارت تقارير حديثة إلى أن الخاليا الجذعية السرطانية تعب ر عن مستويات مرتفعة من النواقل البروتينية Transporters التي تقوم بطرد المواد الحيوية الدخيلة Xenobiotics ومنها األدوية إلى خارج تلك الخاليا وهو ما يفسر أيضا معاندة تلك الخاليا للمعالجات الكيميائي ة التقليدي ة على تنوعها من حيث البنية الكيميائية وآليات التأثير )3(. يتعاظم االعتقاد في وقتنا الر اهن بأن جميع أنواع األورام الصلبة تتألف من ثالثة أنماط رئيسي ة من الخاليا خاليا جذعية متجددة ذاتيا وخاليا سلفية متكاثرة بشكل عابر Transit Amplifying Progenitors وأخيرا خاليا سلفية تخضع لتمايز محدود. وقد تم حديثا اقتراح نموذجين لتفسير تطور األورام يسم ى األول بنموذج الفوضى أو العشوائية Stochastic Model ويفترض أن لدى جميع الخاليا المكو نة للورم غير المتجانس كمونا متساويا لتوليد الورم أما النموذج الثاني ويسم ى بالنموذج التراتبي Hierarchical Model فيفترض وجود جمهرة صغيرة جد ا من الخاليا التي تمتلك كمونا عاليا لتشكيل الورم. وقد أطلق على هذه األخيرة اسم الخاليا الجذعية السرطانية CSCs وهي تشبه الخاليا الجذعية البالغة Adult Stem Cells (ASCs) في العديد من خواصها من حيث عدم تمايزها وقدرتها على التجدد الذاتي Self-renewal واالنقسام المستمر واستخدام سبل متماثلة للشارة الخلوية Cell-Signalling والتعبير عن عوامل انتساخ متماثلة وفعالية مرتفعة ألنزيم التيلوميراز وأخيرا التعبير المرتفع عن بروتينات ABC التي تساهم في طرد المواد الدخيلة -2(. )4 وعلى الر غم من انخفاض نسبتها التي قد ال تتجاوز ال %1 من الخاليا المكو نة للورم في العديد من أنواع السرطان )4( تشير جملة من األدل ة إلى المسؤولية المباشرة ل CSCs عن توليد الخاليا المكو نة للورم حيث تبي ن التجارب التي تقوم على حقن خاليا الورم في الفئران منقوصة المناعة CSCs أن جمهرة immuno-compromised mice وعلى الرغم من ندرتها هي المسؤولة مباشرة عن توليد الورم في حين ال تستطيع خاليا الورم األخرى غير الجذعية توليد الورم حتى ولو تم حقنها بأعداد أكبر بعدة مراتب Orders بالمقارنة مع األعداد المستخدمة من )4( CSCs. لقد ثبت امتالك الخاليا الجذعية السرطانية قدرة كبيرة على مقاومة األدوية الكيميائية ويمكن أن تعزى هذه المقاومة إلى عدد من األسباب من أهمها التكاثر البطيء لهذه الخاليا وهو ما قد يعط ل عمل العديد من األدوية الكيميائية التي تستهدف الخاليا المتكاثرة في طوري تضاعف الدنا S phase أو االنقسام M phase وسكنى هذه الخاليا ضمن بيئة قليلة األكسجة مما يجعل تشكل الجذور الحر ة القاتلة للخاليا والناجم عادة عن المعالجة الكيميائية أمرا متعذ را وامتالك هذه الخاليا نواقل ABC والتي يعزى إليها طرد المواد الغريبة Xenobiotics ومن بينها األدوية الكيميائية السرطانية إلى خارج الخاليا. )8-5( تعد الخاليا الجذعية المسببة لسرطان الثدي Breast (BCSCs) CSCs أحد أكثر أنماط CSCs تشخيصا وأسهلها دراسة ويعزى ذلك إلى تواتر وجودها العالي نسبيا في النسج الورمية الثديية )والذي قد يصل إلى أكثر من %10 من خاليا النسيج الورمي( في حين قد اليتجاوز تواتر الخاليا الجذعية البيضاض الدم Leukemic Stem (LSCs) Cells أكثر من %0,001 من مجمل خاليا الدم المجلد الرابع العدد التاسع جمادى األول 1434 آذار )مارس(

68 لدى المرضى )9(. يمكن استعمال عدة طرائق مخبرية لتشخيص الخاليا الجذعية السرطانية ومن أهمها تحديد مرتسمها من عناقيد التمايز Clusters of Differentiation بواسطة تقنية الت دفق/الجريان الخلوي )3 2( Flow Cytometry حيث تعر ف خاليا الثدي الجذعية السرطانية BCSCs بكونها - /CD24 (CD44 +/hi /low ) أي أنها تعب ر عن بروتين CD44 بشكل مرتفع بينما يكون التعبير عن بروتين CD24 منعدما أو منخفضا. من جهة أخرى ولدى زرع الخاليا الجذعية السرطانية في ظروف غير مساعدة على اإللتصاق conditions فإنها تبدي قدرة على توليد non-adherent كرات ثديي ة تدعى بالكرات الثديية الورمي ة. )2( Mammospheres/Tumorspheres قامت فرضية بحثنا على أن الخاليا الجذعية السرطانية هي الخاليا المسؤولة عن توليد خاليا أورام الثدي وعن مقاومة األدوية الكيميائية وأيضا عن النكس الحاصل بعد إتمام المعالجة الكيميائية للورم وبالتالي يمث ل عزل الخاليا الجذعية السرطانية وتكثيرها وتنميطها ومن ثم حفظها بطرق التجميد في اآلزوت الس ائل خطوة مفتاحي ة ألي ة دراسات مستقبلي ة تستهدف تحري إمكانية استخدام مشاركات دوائي ة أو إضافة أدوية مساعدة إلى األدوية الكيميائية المستعمل حالي ا وذلك بهدف زيادة تحسيسها Sensitization لألدوية الكيميائي ة ومؤازرة المعالجات الكيميائية الشائعة لدى مريضات سرطان الثدي بما يؤدي إلى زيادة فعالية المعالجة لديهن والتقليل من النكس الالحق لتلك المعالجات. يهدف هذا البحث إلى عزل خاليا س رطاني ة أو لي ة من نسج ورمية مستأصلة جراحيا لمريضات سرطان الثدي وزرعها خارج العضوية ex vivo في شروط تفضيلي ة لنمو وتكاثر الخاليا الجذعية السرطانية وتنميط هذه الخاليا اعتمادا على الواسمات السطحية الممي زة لهذه الجمهرة من الخاليا. كما تهدف هذه الد راسة إلى تقييم قدرة هذه الخاليا على تشكيل الكري ات الثديية الورمي ة وتقص ي قدرتها على مقاومة األدوية الكيميائية إذ تعد هاتان الخاصتان ممي زتين للخاليا الثديية الجذعي ة السرطانية.Breast Cancer Stem Cells (BCSCs) المواد والطرائق Materials and Methods.1 االعتيان Sampling شملت الدراسة عينات سرطان ثدي أولي مستأصلة جراحي ا من 5 مريضات حديثات التشخيص ممن راجعن مستشفى البيروني الجامعي لألورام في مدينة دمشق نهاية العام وقد تمت مراعاة الحصول على موافقة المريضات المستنيرة informed consent إغفال المعلومات الشخصية للمريضة..2 المواد Reagents تم شراء أوساط الز رع قبل جمع العينات مع Dublicco s Modified Eagle (DMEM) Medium منخفض تراكيز الغلوكوز ومصل Phopsphate ومحلول Fetal Bovine Serum (FBS) Buffered Saline (PBS) Trypsin 0.05% والصادات الحيوية ومحلول أنزيم التريبسين Penicillin and Strepromycin الملتصقة من شركة والغلوتامين وأطباق زرع الخاليا غير (Stem Cell Technologies) الكندية وتم الحصول على المضاد الفطري Amphotericine من شركة Euroclone اإليطالية ومحلول DMSO من شركة Sigma األمريكية وأضداد (IgG1) Fluorescein Isothiocyanate (FITC)- conjugated anti-cd44 وأضداد IgG1 موسومةanti-CD24 - Phycoerythrin (PE) IgG1 موسومة موجهة ل وأضداد CD117(FITC anti- CD117) وأضداد األضداد الشاهدة شركة CD105) (PE- anti إضافة إلى (FITC IgG1) و (PE IgG1) Serotec وفالسكات الزرع الخلوي من شركة من اإلنكليزية. في حين تم شراء أطباق SPL Scientific الكوري ة. تم عد الخاليا باستعمال عدادة نيوبار الخلوية بوجود أزرق التريبان. تم قياس الجريان الخلوي بجهاز FACS Calibure من شركة Becton Dickinson (BD) األمريكية وتم تحليل النتائج باستخدام برمجية المجلد الرابع العدد التاسع جمادى األول 1434 آذار )مارس(

69 المجلة العربية للعلوم الصيدلية- مجلة اتحاد الجامعات العربية.CellQuest درست الخاليا بالمجهر المقلوب من شركة Olympus وباستخدام كاميرا توثيق خاص ة. في دراسات المقاومة للمعالجات الكيميائي ة استخدمت األدوية الكيميائية التجارية )Hospira( Docetaxel و Doxorubicin.)Ebewe( 3. عزل وزرع الخاليا الجذعية السرطانية من الورم األو لي Cell Isolation & Culturing تم الحصول على موافقات مستنيرة مكتوبة من مريضات سرطان الثدي الالتي خضعن لعمل جراحي بهدف استئصال الورم الس رطاني في مستشفى البيروني. بعد استئصال الكتلة السرطاني ة تم وضعها في وسط مغذي DMEM يحوي %5 مصل جنين بقري إضافة إلى صادات حيوية )بنسلين + ستربتومايسين( ومضاد فطري. قس مت العينة إلى قطع بأبعاد 0.5 x 0.2 سم بواسطة مشارط معقمة. حضنت العينات بوجود إنزيمين حالي ن للنسج هما اإلنزيم الحال للكوالجين/الكوالجينازCollagenase واإلنزيم الحال للحمض الهيالوروني Hyalloronidase لمد ة 6 ساعات بالدرجة 37 م. بعثرت العينات بواسطة مالقط معقمة وتم فصل الخاليا المتحررة من النسج اعتمادا على عد ة عمليات متعاقبة من التثفيل بسرعة 800g وزرعت الخاليا في أطباق زرع خلوي tissue culture plates تسمح بااللتصاق وذلك في الوسط الزرعي +DMEM %10 FBS بدرجة حرارة 37 م وبشروط حضانة بلغت فيها تراكيز CO2 ال %5 وتم ت تغذية الخاليا بتبديل الوسط كل 4-3 أيام. لدى وصولها إلى مرحلة %70-%80 من التمادي الخلوي األعظمي Confluence غ س لت الخاليا بتلك الخالية من األدوية بعد الغسل المتكرر للخاليا بمحلول.PBS تمت مراقبة عودة نمو الخاليا في الوسط المغذي بغياب األدوية الكيميائية..4 تكو ن الكرات الثديية/الكرات الورمي ة Formation of Mammosphere/Tumorsphere تم زرع الخاليا بشروط غير ملتصقة Non-adherent باستخدام أطباق زرع خلوي فائقة القدرة على منع االلتصاق وبتراكيز %5 من.CO2 ultra-low adherent plates تم ت مراقبة نمو الكرات المتشك لة وقدرتها على الت جد د الذاتي في أوساط منخفضة االلتصاق بحضنها مع التريبسين وغسلها وزرعها مجد دا في الشروط المبي نة أعاله. بعد تشك ل الكرات الورمية تمت بعثرة الكرات الورمية باستعمال التربسين )%0.05( وإمرار الخاليا بالشروط غير الملتصقة عدة مرات مع تبديل األوساط المغذ ية كل ثالثة أيام..5 الجريان/الت دف ق الخلوي Flow Cytometry ب تم ت بعثرة الكرات الثديي ة/الورمي ة المزروعة بشروط غير ملتصقة باستعمال التريبسين وتم الت حقق من تفريدها )أي وصولها لمرحلة الخاليا المفردة مجهري ا (. بعد العد و زعت الخاليا على األنابيب المخص صة للجريان الخلوي )2 x 10 /األنبوب( 5 وغسلت بوقاء PBS مزو د ب %2 FBS + EDTA وبعثرت الخاليا في مكل من الوقاء وحضنت مع األضداد على الثلج مد ة نصف ساعة في الظالم وأزيل الفائض من األضداد غير المرتبطة بالغسل مل من الوقاء. تم تحر ي تعبير الخاليا عن معق دات التمايز الس طحي CD44 وCD24 و CD117 و CD105 بالمقارنة مع أضداد شاهدة سلبي ة بإمرار الخاليا في جهاز الت دفق الخلوي ثنائي اللون. أم ا بالنسبة للخاليا الملتصقة فقد استخدم أنزيم التربسين أيضا لفك التصاقها عن أطباق الزرع وتم عد الخاليا وتوزيعها على األنابيب المخص صة للجريان الخلوي كما ورد أعاله. بمحلول 1xPBS تال ذلك إضافة أنزيم التريبسين Trypsinبتركيز %0.05 )EDTA+( وذلك لمد ة 5 دقائق وتم إيقاف فعل التريبسين بإضافة وسط + DMEM FBS %10 ووزعت الخاليا على األطباق أو الفالسكات الخاصة بالزرع. بالنسبة لتجارب االستجابة لألدوية تم حضن الخاليا بعد زرعها مع التراكيز المحددة من األدوية الكيميائية لفترة معينة ومن ثم استبدال األوساط المغذية المجلد الرابع العدد التاسع جمادى األول 1434 آذار )مارس(

70 النتائج Results عزل خاليا ورم الثدي األولية وخاليا الثدي الجذعية السرطانية قمنا أوال بتحديد شروط هضم عينات لسرطانات ثدي مستأصلة من مريضات سوري ات وذلك باستعمال توليفات مختلفة من األنزيمات الهاضمة وبتعديل مد ة الحضانة. تمك نا لدى استعمال أنزيمي الكوالجيناز والهيالورونيداز من هضم العينات وقمنا الحقا بعزل الخاليا الجذعية السرطانية وتكثيرها وتنميطها وزرعها في أوساط الزرع التفضيلي ة بشروط تسمح باإللتصاق )على أطباق تحر ض على التصاق الخاليا وبوجود المصل(. بعد التمديد المتوالي للخاليا تفاوتت سرعة نمو الخاليا البدئي ة المعزولة من العينات السرطاني ة البدئي ة إذ ات سمت بعض المستعمرات بسرعة النمو خالل أيام قليلة في حين بدأت المستعمرات األولى للخاليا التي بدت مورفولوجيتها مجهريا مقاربة لمورفولوجية الخاليا المتوسطة Mesenchymal بالت شك ل بعد ما يقارب الخمسة إلى ستة أسابيع )الشكل B 1 و C(. تم عزل عدد من المستعمرات/الن سائل األولى )الش كل A1( وزرعت هذه الخاليا وتم ت تغذيتها وتكثيرها باستعمال اإلمرار المتوالي serial passaging بصورة متواترة كل 10-7 أيام. تبي ن من خالل تجارب اإلمرار المتوالي وجود نسائل Clones تمي زت بالبقيا ألمد طويل واالستدامة في االنقسام طوال مدة الزرع ولعدد إمرار بلغ 10 إمرارات حتى كتابة هذه النتائج. استطاعت خاليا هذه النسيلة لدى زرعها في أطباق ال تحر ض على التصاق الخاليا أن تنمو خالل 92 ساعة وتشك ل خالل هذا الوقت القصير نسبيا كرات ثديية/ورمية نمطية وبتواتر وحجم كبيرين )الشكل D( 1 األمر الذي يعد مميزا لخاليا الثدي الجذعية السرطانية. إثر ذلك تابعنا تنميط خاليا هذه النسائل وقارن ا خواصها الشكليائية ومرتسمات بروتيناتها السطحية مع مجموع خاليا تم عزلها من ورم ثدي ولم ا تخضع للتمديد المتوالي بعد. A B C D الشكل 1: النمط المورفولوجي لخاليا الثدي السرطانية المعزولة. A( إحدى المستعمرات لخاليا ورم أولية نمت بعد 72 ساعة من زرع النسيج الورمي األو لي )التكبير B X40(. و C( خاليا جذعية سرطانية معزولة بالتمديد المتوالي لخاليا الورم البدئي )التكبيرين X40 وX100 على التوالي( )اإلمرار الثامن(. D( تشكيل خاليا الثدي الجذعية السرطانية لكرات ورمية خالل 92 ساعة من الزرع في أطباق فائقة القدرة على منع التصاق الخاليا )اإلمرار األول والتكبير X(. 100 المجلد الرابع العدد التاسع جمادى األول 1434 آذار )مارس(

71 PE-Isotype CD24-PE المجلة العربية للعلوم الصيدلية- مجلة اتحاد الجامعات العربية.IgG1) لدى وسم الخاليا وسما مضاعفا بأضداد وحيدة الن سيلة موجهة لCD44 وCD24 واستعمال الت دفق الخلوي مضاعف اللون أبدت الخاليا بصورة جلي ة النمط الظاهري للخاليا الجذعي ة السرطانية )الش كل B2( مقارنة باألضداد الشاهدة )الشكل A(. 2 تدعم هذه البيانات قو ة البرهان على هوية هذه الخاليا بصفتها خاليا جذعي ة سرطانية أي ( - /CD24 )CD44 + حيث لوحظ وجود انزياح لجمهرة الخاليا الموسومة بضد FITC-CD44 مقارنة بالشاهد بينما لم يالحظ أي انزياح في شدة الفلورة عند الوسم بضد PE-CD24 مقارنة بالشاهد )الشكل D و C على التوالي(. التعبير عن واسمات سطح الخاليا Expression of cell surface makers تعر ف الخاليا الجذعي ة السرطانية بناء على واسمات سطح الخاليا بأن ها خاليا قادرة على الت عبير عن الواسم CD44 وعدم/أو ضعف تعبيرها عن الواسم CD24 أي أن ها خاليا.CD44 + /CD24 -/LO قمنا بدراسة الواسمات السطحي ة لخاليا الكرات الورمي ة من النسيلة التي أنتجت تلك الكرات بطريقة الجريان الخلوي باستعمال أضداد موجهة ل CD44 موسومة ب (FITC-anti CD44) FITC وأضداد موسومة موجهة ل (PE-anti-CD24) CD24 وذلك بالمقارنة مع أضداد شاهدة (FITC-IgG1) و- PE ) A B %0.16 %0.39 %0.0 %0.61 %99 %0.55 %0.15 %99 FITC-Isotype CD44-FITC C D IgG1-PE Isotype acd24-pe IgG1-FITC Isotype acd44-fitc CD24-PE CD44-FITC الشكل 2: يبين تنميط خاليا الثدي الجذعية السرطانية باستعمال تقنية الجريان الخلوي وتقييم التعبير عن المستضدين السطحيين CD44 و CD24 بواسطة أضداد موسومة موج هة لكال البروتينين. A( ارتباط االضداد الشاهدة الموسومة ب FITC و PE على سطح خاليا B(.BCSCs ارتباط أضداد FITC-CD44 و PE-CD24 على سطح خاليا C(.BCSCs شدة الفلورة الصادرة عن الخاليا الموسومة بضد PE- anti CD24 مقارنة بنظيراتها التي حضنت مع الضد الشاهد D(.PE-IgG1 مقارنة شدة الفلورة الصادرة عن الخاليا الموسومة بضد FITC- anti CD44 مقارنة بنظيراتها التي حضنت مع الضد الشاهد FITC-.IgG1 المجلد الرابع العدد التاسع جمادى األول 1434 آذار )مارس(

72 حفظ خاليا BCSCs باآلزوت السائل Preservation in Liquid Nitrogen تم زرع خاليا BCSCs في الوسط المغذ ي DMEM/10%FBS إلى أن نمت لتصل إلى %80 من حد التمادي األعظمي. ف ص لت الخاليا عن أطباق الزرع بإضافة أنزيم التريبسين %0.05 ومن ثم تم ت بعثرتها في وسط مغذ يحتوي على DMSO بتركيز نهائي %10. تم تجميد الخاليا في علب اإليزوبروبانول بدرجة حرارة - 80 م لمدة 24 ساعة ثم نقلت الخاليا إلى حاوية اآلزوت السائل.Liquid N2 تم اختبار عيوشية Viability الخاليا بعد إعادة زرع الخاليا المجم دة في الوسط المغذي ووصلت عيوشيتها إلى ما يفوق ال %70 حسب البروتوكول الذي قمنا بات باعه. مقارنة جمهرة خاليا الثدي الجذعية السرطانية بجمهرات مختلطة لخاليا ورم ثدي Mixed Tumor قمنا بمقارنة خصائص الخاليا المغناة إلحدى الن سائل المعزولة مع خاليا ورمي ة ثديي ة لم تخضع لعمليات االنتقاء بالتمديد المتوالي والتي تمث ل بالتالي خليطا مكو نا من كثرة من جمهرات خلوي ة سرطاني ة غير جذعي ة ونسبة أقل بكثير من الخاليا الجذعي ة واشتملت المقارنة على تقييم القدرة على تشكيل كرات ثديي ة والتعبير عن المستضد الس طحي CD44 ودراسة االستجابة للمعالجة باثنين من أكثر األدوية الكيميائي ة استعماال في عالج سرطان الثدي دوكسوروبيسين ودوسيتاكسيل. أ. القدرة على تشكيل الكرات الثديي ة/الكرات الورمي ة Mammosphere-Initiating Capacity أبدت خاليا BCSCs قدرة على تشكيل كرات ورمي ة بعد 72 ساعة من زرعها في شروط ال التصاقي ة- non adherent conditions في أطباق خلوي ة تمتاز بكونها منخفضة االلتصاق بصورة فائقة ultra-low adherent )الشكل C( 3 بينما كان تشك ل الكرات الورمية ضعيفا جدا في اآلبار الحاوية على خاليا مستأصلة من نسيج ثدي طبيعي )خاليا شاهدة معر فة بناء على نتائج الت حليل المرضي( أو من خاليا ثديية ورمية مختلطة لم يتم إغناؤها ب BCSCs بعد ( الشكل A 3 و B على التوالي(. A B C الشكل 3: القدرة على تشكيل الكرات الثديية/الورمية Mammospheres/Tumorspheres لخاليا ثدي طبيعية شاهدة (A) وخاليا ثديي ة ورمي ة (B) وخاليا (C) BCSCs بعد 72 ساعة من الزرع بأطباق منخفضة االلتصاق بصورة فائقة )التكبير 100.)X المجلد الرابع العدد التاسع جمادى األول 1434 آذار )مارس(

73 المجلة العربية للعلوم الصيدلية- مجلة اتحاد الجامعات العربية B ب. التعبير عن البروتينات والمستضدات السطحية قمنا بدراسة الواسمات السطحي ة لخاليا BCSCs المزروعة بشروط االلتصاق بواسطة الجريان الخلوي وتم ت مقارنتها بالجمهرات الخلوي ة الخليطة لورم أو لي وذلك باستعمال األضداد CD44) (FITC-anti و( PE-anti-CD24 ) و( CD117 (FITC-anti و( CD105 (PE-anti إضافة إلى األضداد الشاهدة (FITC-IgG1) و- PE ) IgG1) )الشكل.)4 تبي ن النتائج بصورة جلي ة الفارق الكبير في الت عبير عن المستضد الس طحي CD44 وذلك لدى مقارنة الخاليا المغناة للنسائل المعزولة والتي تبدو كجمهرة خلوي ة متجانسة في تعبيرها بشكل مرتفع عن CD44 مع خاليا الورم التي تنتمي لجمهرات خلوي ة غير متجانسة في تعبيرها عن CD44 وبمستويات منخفضة حيث بلغت نسبة الخاليا - /CD24 CD44 + في عينة خاليا %91.7 BCSCs بينما كانت نسبتها أقل من %30 في عينة خاليا الورم المختلطة )الشكل A(. 4 من جانب آخر كان التعبير عن البروتين السطحي CD117 أقل في خاليا BCSCs منه في خاليا الورم المختلطة حيث بلغت نسبة الخاليا إيجابية CD117 حوالي %5 في عينة BCSCs بينما وصلت نسبتها إلى %18.6 في عينة خاليا الورم المختلطة )الشكل B( 4 في حين كان التعبير عن البروتين السطحي CD105 أصغريا في كلتا العينتين. A IgG1 Tumor BCSCs IgG1 Tumor BCSCs الشكل 4: مقارنة التعبير عن المستضدات السطحية CD44 وCD24 و CD117 و CD105 في خاليا BCSCs وخاليا ورم ثديي مختلط الجمهرات. A( التعبير عن المستضدين CD44 و CD24 مقاسا بالجريان الخلوي. B( التعبير عن مستضدي CD117 و CD105 في نفس الخاليا مقاسا بالجريان الخلوي. ج. االستجابة لتراكيز متزايدة من األدوية الكيميائية لمقارنة استجابة/مقاومة خاليا BCSCs مع خاليا الورم المختلطة قمنا بزرع كل من نمطي الخاليا بوجود تراكيز متزايدة من الدوسيتاكسل 5( نانوغرام/مل( والدوكسوروبيسين 50( نانوغرام/مل( بالمقارنة مع الخاليا الشاهدة التي تلق ت DMSO فقط. تم اختيار هذين الدوائين اعتمادا على شيوع استعمالهما في البروتوكوالت العالجية لمريضات سرطان الثدي عموما وفي مستشفى البيروني الجامعي على وجه الخصوص )10(. بلغت مدة حضن الخاليا مع الدواء 92 ساعة تم خاللها تجديد األوساط الحاوية على األدوية بعد 48 ساعة. بعد انتهاء فترة الحضن مع األدوية تم غسل الخاليا في آبار أطباق الزرع )12 بئر/طبق( بصورة متكررة للتخلص من جميع الخاليا الطافية والمحافظة على الملتصق منها فقط والذي يعكس بقيا تلك الخاليا الملتصقة. يظهر الشكل )A 5 وB ( تأثر العديد من الخاليا في كلتا العينتين بتراكيز الدوائين حت ى الضعيفة منها. إال أنه من الواضح أن تأثر خاليا BCSCs كان أقل بكال الدوائين من خاليا الورم المختلطة حيث استطاع كال الدوائين القضاء على النسبة األكبر من خاليا الورم المجلد الرابع العدد التاسع جمادى األول 1434 آذار )مارس(

74 Docetaxel BCSCs Tumor BCSCs Tumor Doxorubicin المختلطة بتراكيز أعلى من 0 ng/ml 5 ng/ml ng/ml ng/ml ng/ml ng/ml 500 ng/ml Tumor BCSCs Tumor BCSCs 0 ng/ml 50 ng/ml ng/ml 500 ng/ml 1000 ng/ml نانوغرام/مل بينما بقيت 5 نسبة معتبرة من خاليا BCSCs ملتصقة حتى في تراكيز مرتفعة جدا وصلت إلى 500 نغ/مل دوسيتاكسل أو 1000 نغ/مل دوكسوروبيسين )الشكل 5(. ويشير ذلك إلى أن مقاومة خاليا BCSCs لكال الدوائين أفضل من تلك العائدة لخاليا جمهرات الورم المختلطة. الشكل 5: مقارنة استجابة الخاليا الثديية الجذعية السرطانية BCSCs وخاليا ورم ثدي مختلطة للمعالجة بالتراكيز المتزايدة المبي نة من الدوسيتاكسل Docetaxel أو الدوكسوروبيسين Doxorubicin مدة 92 ساعة مع تجديد وسط الزرع الحاوي على الدواء مرة واحدة بعد 48 ساعة. المجلد الرابع العدد التاسع جمادى األول 1434 آذار )مارس(

75 المجلة العربية للعلوم الصيدلية- مجلة اتحاد الجامعات العربية تقييم استجابة خاليا الثدي الجذعية السرطانية لتراكيز مرتفعة جدا من األدوية الكيميائية نظرا للمقاومة التي أبدتها الخاليا الجذعي ة الس رطاني ة لكل من دوسيتاكسيل ودوكسوروبيسين بالت راكيز المبي نة أعاله فقد قمنا بتحر ي استجابة الخاليا الجذعية الس رطاني ة لتراكيز أعلى ب 5-10 أضعاف من المستويات القصوى للدوسيتاكسل ودوكسوروبيسين المستعملة في تجربتنا أعاله وذلك بهدف تحديد إمكانية الحصول على خاليا مقاومة لهذه التراكيز العالية جدا من أي من الدوائين المستخدمين. كما تقصينا مدى قدرة خاليا ال CSCs المقاومة للمعالجة بتراكيز مرتفعة من أحد أو كال الد وائين على االنقسام والت كاثر لدى إزالة الوسط الحاوي على الدواء واستبداله بوسط مغذ خال من أي عالج كيميائي. استطاع دوكسوروبيسين بتركيز قدره 5 مكغ/مل القضاء على خاليا BCSCs بصورة تام ة )الش كل C( 6 في حين قاومت هذه الخاليا الدوسيتاكسل بتراكيز وصلت 5 مكغ/مل )الش كل B6( بحيث استعادت الشكلياء النمطية والمشابهة لخاليا المجموعة الشاهدة التي تلق ت DMSO )الشكل A(. 6 وبشكل عام حافظت خاليا BCSCs المقاومة للدوسيتاكسل على مرتسم مشابه لخاليا BCSCs األصلية.)DMSO( A DMSO B Docetaxel 5 ug/ml C Doxorubicin 5 ug/ml D DMSO Docetaxel 5 ug/ml 99% 83% شكل 6: مقارنة استجابة BCSCs لتراكيز مرتفعة جدا من Docetaxel و Doxorubicin مقارنة بالشاهد DMSO وذلك بعد حضن الخاليا بوجود الدواء لمدة 72 ساعة ومن ثم تبديل الوسط وحضن الخاليا بغياب الدواء لمدة 10 أيام. A( الشاهد DMSO تنميط الخاليا المعالجة بالشاهد D( دوكسوروبيسين 5 مكغ/مل C( دوسيتاكسل 5 مكغ/مل B( DMSO وDocetaxel بالجريان الخلوي باستخدام الضدين الموسومين FITC-CD44 و.PE-CD24 المناقشة والتوصيات Discussion& Conclusion تعد مراقبة Monitoring المعالجة أمرا حاسما للتحق ق من تلقي المريض لبرنامج عالجي فع ال والت وصل إلى المحصالت العالجي ة المستهدفة وتستند الدالئل اإلرشادي ة المعتمدة في الوقت الر اهن في تقييمها الستجابة الورم للمعالجة وبصورة أساسي ة إلى رصد التناقص في حجم الورم. غير أن هذا المتثابت المستند إلى فروقات حجمي ة تشريحي ة ال يعد مؤش را مبك را لنجاعة المعالجة إذ أن المجلد الرابع العدد التاسع جمادى األول 1434 آذار )مارس(

76 بعين االعتبار خصوصية الورم في كل مريض من حيث تركيز وخصائص تلك الخاليا. )12( وبناء على هذه المعطيات البحثي ة فإن مفهوم المعالجة الفع الة المضادة للورم بما اكتسبه من أبعاد جديدة يحت م ضرورة إيجاد أدوات بحثي ة مبتكرة قادرة على تزويد األطباء الس ريريين بتقديرات دقيقة لنسب الخاليا الجذعية الس رطاني ة في كتلة الورم بما يمك نهم من اختيار البرنامج العالجي األمثل القادر على استهداف كل من جمهرتي الخاليا السرطاني ة )الجذعي ة وغير الجذعي ة( وكذلك تحديد اإلنذار لدى المرضى الخاضعين للمعالجة بصورة أكثر موثوقي ة. كما أن مقايسة عيوشي ة الخاليا الس رطاني ة استجابة ألدوية أو مشاركات دوائية جديدة تواجه معضلة هذا التمثيل غير المتكافئ لكال نمطي الخاليا والذي قد يعكس االنحياز للخاليا التي تشك ل األكثرية العددية أي الخاليا الس رطاني ة غير الجذعي ة. ولهذا فإن األبحاث الهادفة إلى نخل عوامل/مشاركات عالجي ة جديدة قادرة على قتل ال CSCs بصورة نوعي ة وتفضيلي ة تحت م تكثير جمهرات من ال CSCs مستقرة ومغناة بصورة فائقة )13(. حت ى تاريخه فإ ن هذا الهدف صعب التحقيق بالنسبة للخاليا الجذعية الس رطاني ة من األورام الصلبة نظرا للتعقيد الشديد طبيعة الخاليا المكو نة للورم. في عملياتي ا يقاس تمثيل ال CSCs في جمهرة خاليا الورم بناء على القدرة على بذر Seeding أورام في الكائن الحي in وذلك بتمديدات مقي دة vivo Limiting Dilutions إلى حين الوصول إلى التركيز األمثل المشك ل للورم غير أن هذه الطريقة ليست بالسهلة من الناحية التطبيقي ة بما تتطلبه من حيوانات تجربة موهنة مناعي ا باهظة الت كلفة ومتطلبة لبيئة عقيمة )مثل الفئران المصابة بعوز مناعي مشترك وخيم SCID Sever Combined Immuno-deficient )Mice إضافة إلى المدد الزمني ة الطويلة نسبي ا الالزمة إلجراء هذه الت جارب. يمكن أن يستعاض عن الحقن داخل الحي بعدد من الطرائق التي ت جرى في الزجاج in vitro والتي تشمل )13( تكوين جمهرات الخاليا الجذعية التغيرات التي تطرأ على شكلياء الورم محكومة بتبدالت عديدة في الفيزيولوجيا اإلمراضي ة للورم كما يربط عدد من الد راسات الحديثة هذه االستجابة بنسبة الخاليا الجذعية السرطاني ة CSC من مجمل خاليا الورم إذ يتعزز االعتقاد بقيام هذه الخاليا بأداء أدوار بالغة األهمي ة في نمو الورم Tumor Growth ونكسه Recurrence وبمقاومتها للعديد من المعالجات المتوف رة حاليا بما في ذلك المعالجة الش عاعي ة والمعالجات الكيميائي ة (11(. وتقترح هذه الد راسات بأن قيام العديد من هذه المعالجات باستهداف الخاليا الس رطاني ة غير الجذعي ة وقتلها بما تمثله من الكتلة األكبر من الورم قد ينتهي بالفشل في نهاية األمر لعدم تمكن هذه العالجات من القضاء على CSCs التي تنجو لتعود فتول د أوراما جديدة. وبالتالي فإن التراجع الحاصل في حجم الورم أو انكماش كتلته والذي ي عتم د كمؤش ر على نجاعة المعالجة قد يكون في حقيقة األمر مضل ال لكونه يعكس استجابة الخاليا السرطاني ة غير الجذعي ة دون أن يواكب هذه التضاؤل في حجم الورم اجتثاث للخاليا الجذعية السرطاني ة المقاومة للمعالجة والتي تمث ل جمهرة نادرة أو أقلية عددي ة ضمن جمهرة مجمل خاليا الورم التي تسودها غالبي ة عددي ة من الخاليا السرطاني ة غير الجذعي ة. أي أن القياس الكم ي للتناقص الحاصل في كتلة الورم ال يعبر عن ال CSCs بالمقارنة مع الخاليا الس رطاني ة غير الجذعي ة والتي تمث ل الغالبية العددي ة. وتتفق حقيقة نجاة جمهرة صغيرة من الخاليا للمعالجة الكيميائي ة مع وجهة الن ظر التي تقول بأن الخاليا المول دة للورم الناجية من المعالجة هي المسؤولة عن معد ل الن كس الذي يصل إلى %40 في سرطان الثدي الغازي. ولهذا تبرز أهمي ة استهداف هذه الخاليا ( - CD24 )CD44 + بمعالجات بديلة مثل أضداد وحيدة الن سيلة أو مثبطات جديدة صغيرة الجزيئة. زيادة على ذلك فقد بينت إحدى الدراسات الحديثة أن CSCs المعزولة من أورام ثدي أولية وخطوط خلوية لسرطان الثدي تبدي عدم تجانس خاص ة من حيث تعبيرها عن المستضدات السطحية األمر الذي قد يدعم مفهوم تفريد المعالجة therapy individualization ويشد د على أهميته وبحيث يتم األخذ المجلد الرابع العدد التاسع جمادى األول 1434 آذار )مارس(

77 المجلة العربية للعلوم الصيدلية- مجلة اتحاد الجامعات العربية السرطاني ة لمستعمرات كروي ة الشكل في أوساط الزرع المعل قة Suspension Cultures والتي تعرف ب الكرات الثديي ة الورمية Tumorspheres وإغناء جمهرات فرعي ة من CSC اعتمادا على مرتسم الواسمات على سطح الخلي ة وقدرة جمهرات ال CSCs ألدوية المعالجة الكيميائي ة. تظهر نتائج هذا على إبداء مقاومة متزايدة البحث تمكننا من عزل وتكثير خاليا من عينات أورام ثدي خبيثة أولي ة مستأصلة من مريضات في مستشفى البيروني الجامعي كما تبي ن توصلنا إلى عزل وتنميط نسائل تمتلك كامل خصائص الخاليا الجذعية الس رطاني ة في الز جاج من حيث مرتسمها من الواسمات يعز ز الن ظرة إليها بوصفها خز انا خلويا متجد دا يؤم ن عودة نمو الكتلة الورمي ة ويؤد ي بالتالي إلى فشل المعالجات الكيميائي ة المستعملة في البروتوكوالت العالجي ة الحالي ة. من جهة أخرى وعلى الر غم من البطء الذي يتسم به انقسام ال CSCs وتضاعفها فقد استطعنا إكثار هذه الن سائل من خالل عمليات الز رع المتتالي والتي وصلت حت ى تاريخه إلى عشرة إمرارات. كما تمك نا من تجميد أعداد كافية من هذه الخاليا وحفظها في اآلزوت السائل وأثبتنا عيوشيتها بعد عملي ة التجميد مم ا يتيح االستمرار بهذه الن سيلة واختبار إمكانية تحو لها إلى خط خلوي ثابت وهو أمر يستغرق وقتا أطول وتقييما مستمرا إلثبات محافظتها على خصائص الخاليا األو لية. CD44 high /CD24 low وقدرتها على تشكيل الس طحي ة الخالصة: كرات ورمي ة وصفي ة. من جانب آخر فقد وجدنا انخفاضا تكمن أهمي ة هذا البحث في تطويره نموذجا model يسمح في التعبير عن المستضد السطحي (ckit) CD117 في مستقبال بدراسة استجابة الخاليا الجذعي ة لبروتوكوالت خاليا BCSCs بالمقارنة مع خاليا الورم المختلطة األمر دوائية نوعية وتوليفية Combinatorial مختلفة وننظر الذي يتفق مع ما أشير إليه سابقا عن انخفاض التعبير عن إلى أن محصالت هذا العمل ستمهد الطريق إلمكانية عزل هذا البروتين عند تحول الخلية الجذعية البالغة إلى خلية وزرع الخاليا الجذعية السرطانية األولية المحضرة من جذعية سرطانية في أورام الثدي. النسج الورمية المأخوذة من مريضات حديثات التشخيص إضافة لذلك فقد بينت نتائجنا أن خاليا BCSCs التي تمكن ا ومن ثم تحديد البروتوكول التوليفي األكثر نجاعة في من عزلها قاومت إثنين من أكثر أدوية المعالجة الكيميائي ة القضاء على الخاليا السرطانية الجذعية وغير الجذعية المستعملة في عالج سرطان الثدي شيوعا دوستاكسيل وبما يدعم القرار السريري الختيار البروتوكول الدوائي و دوكسوروبيسين. على الر غم من الت غيرات المورفولوجي ة التوليفي األفضل لمعالجة مرضى السرطانات. وأخيرا التي طرأت على خاليا ال CSCs خالل فترة المعالجة يمكن تعظيم االستفادة من بروتوكوالت العزل والتنميط بتراكيز شديدة االرتفاع من الدوسيتاكسيل فقد أبدت الخاليا الناجية قدرة على االستمرار في االلتصاق بأطباق الزرع والعالج المستخدمة في هذه الدراسة لتشمل أوراما أخرى غير سرطان الثدي. الخلوي واألهم فقد تمك نت هذه الخاليا من متابعة االنقسام والت كاثر واللحاق بنظيراتها من الخاليا الشاهدة غير References المراجع المعالجة. إن هذه القدرة التي أبدتها الخاليا الجذعي ة الس رطاني ة على استعادة خصائص الن مو واالنقسام تحليل الوضع الراهن للقطاع الصحي لفريق عمل -1 إستراتيجية بحوث القطاع الصحي. تقرير أعد بإشراف الهيئة العليا للبحث العلمي دمشق والمحافظة على نمطها الظاهري من حيث تعبيرها عن المستضد الس طحي CD44 بعد تعرضها لتراكيز مرتفعة A. 2- Saxena M and Rangarajan جد ا من الدوسيتاكسيل في الز جاج in vitro قد تتماهى مع Isolation and characterization of breast and brain cancer stem cells. P In. الد ور الذي تقوم به هذه الخاليا في الحي in vivo في Cancer Stem Cells: identifications and مقاومة العالجات الكيميائي ة والت سبب بنكس الورم مما targets. Edited by SharmilaBapat. John 77 المجلد الرابع العدد التاسع جمادى األول 1434 آذار )مارس( 2013

78 8- Patel SA, et al. Challenges in the development of future treatments for breast cancer stem cells. Breast Cancer; 2: Vezzoni LK, and Parmiani G. Limitations of the cancer stem cell theory. Cytotechnology, 58: كتي ب الدالئل اإلرشادية لمعالجة مرضى السرطانات -10 في مستشفى البيروني الجامعي مستشفى البيروني الجمهورية العربية السورية 11- Phuc PV, et al. الجامعي لألورام دمشق Downregulation of CD44 reduces doxorubicin resistance of CD44+CD24 breast cancer cells. OncoTargets and Therapy; 4: Hwang-Verslues WW, et al. Multiple lineages of human breast cancer stem/progenitor cells identified by profiling with stem cell markers. PLoS One, 4(12): e Gupta PB, et al. Identification of selective inhibitors of cancer stem cells by high-throughput screening. Cell, 138(4): Kondi-Pafiti A, et al. Expression of c-kit in common benign and malignant breast lesions. Tumori, 96(6): Wiley & Sons, Inc. Hoboken, New Jersey, USA Gold B, and Dean M. Breast cancer stem cells. P In. Stem cells and cancer. Edited by Sadhan Majumder. Springer Dordrecht, Heidelberg, Germany Bapat S, et al. Cancer stem cells: similarities and variation in the theme of normal stem cells. P In. Cancer Stem Cells: identifications and targets. Edited by Sharmila Bapat. John Wiley & Sons, Inc. Hoboken, New Jersey, USA Nicolini A, et al. Stem cells: their role in breast cancer development and resistance to treatment. Curr Pharm Biotechnol, 12(2): Kakarala M, and Wicha MS. Implications of the cancer stem-cell hypothesis for breast cancer prevention and therapy. J. Clinical. Oncology; 26: Charafe-Jauffret E, et al. Breast cancer cell lines contain functional cancer stem cells with metastatic capacity and a distinct molecular signature. Cancer Research; 69: المجلد الرابع العدد التاسع جمادى األول 1434 آذار )مارس(

79 المجلة العربية للعلوم الصيدلية- مجلة اتحاد الجامعات العربية معايرة كل من الدورزوالميد هيدروكلوريد والتيمولول ماليات في شكلها الصيدالني /قطرة عينية/ باستخدام مقياس الطيف الضوئي Spectroscopic method for the determination of Dorzolamide hydrochlorid and timolol maleate in it dosage form / Eye drops/. الملخص Abstract ** رشاد مراد *و جمعه الزهوري** قسم األدوية و السموم- كلي ة الصيدلة جامعة دمشق سورية * قسم الكيمياء التحليلية و الغذائية- كلي ة الصيدلة جامعة دمشق سورية تم في هذا البحث تطوير طريقة بسيطة ونوعية وحساسة لمعايرة كل من الدورزوالميد هيدروكلوريد والتيمولول ماليات في القطورات العينية وذلك باستخدام تقنية الطيف الضوئي في مجال األشعة فوق البنفسجية حيث تعتمد الطريقة على تمديد حجم من القطرة العينية 100 مرة بالماء المقطر ومن ثم يؤخذ 10 مل من المحلول الناتج ويمدد ل 50 مل بالماء المقطر ثم تؤخذ قراءات األمتصاص مقابل الماء عند الموجة 254 نم وكذلك عند الموجة 295 نم. طبقت الطريقة لمعايرة المواد المذكورة في مستحضر Timodors وكانت نسبة المردود واألنحراف المعياري )10=n ). %0.92 ± 98.8 للدورزوالميد و ± للتيمولول كما تم مقارنة الطريقة مع طريقة ال ] HPLC 2 [ فكانت قيمة كل من اختبار F و T هي 1.9 و 3.25 للدورزوالميد و للتيمولول. Simple, sensitive and specific method for the simultaneous determination of Dorzolamid HCl and Timolol maleate in its dosage form /Eye drops/. The method depented on dilution of 1 volume of the Eye drops 100 time with distillers water, then 10 ml from the resulting solution to 50 ml of water and measure the absorbance at 258 nm and 295 nm against water. The proposed UV-method was successfully applied to the determination of sibotramin in commercial product Timodors (diamondpharm). The percentage recoveries and the standard division (n=10) were 98.8 ± 0.92%. For Dorzolamide and 98.1 ± 0.95 for timolol. The suggested method was compared with HPLC method while the result was conform with the standard method according to statistic Value for F and T tests. الكلمات المفتاحية :Key words دورزوالميد هيدروكلوريد تيمولول ماليات جهاز الطيف فوق البنفسجي قطرة عينية Dorzolamide Hydrochloride, Timolol maleate, UV-Spectrophotometer المقدمة Introduction ينطوي الدورزوالميد هيدروكلوريد تحت زمرة األدوية المضادة للغلوكوما ( الماء األزرق( Antiglucoma Anhydouse( )Carbonic بينما ينطوي التيمولول ماليات تحت زمرة األدوية التالية: Cardiovascular agent. -3 Antiglucoma Beta-Adrenergic blocker,nonselective -1-2 وقد استخدم في قطرة التيمودور مزيج كل من الدورزوالميد هيدروكلوريد واتيمولول ماليات في معالجة الماء األزرق )الغلوكوما( حيث يعتبر المزيج ككل Antiglucoma من نمط: Beta-Adrenergic Bloker/Carbonic Anhydrase Inhibitor Combination ويطبق عادة المجلد الرابع العدد التاسع جمادى األول 1434 آذار )مارس(

80 بنسبة تتراوح ما بين % حيث يستخدم بحاالت.Open angle glaucoma الدورزوالميد هيدروكلوريد I( ) حسب ] [4 7 كان هدفنا هو تطوير طريقة بسيطة وحساسة لمعايرة هاتين المادتين بالقطرة العينة باستخدام التقنيات الضوئية لتكون طريقة رديفة لطريقة ال. HPLC المواد العيارية Standards Substances Dorzolamide دورزوالميد هيدروكلوريد Hydrochloride مادة عيارية من شركة BDR للمواد الصيدالنية رقم الطبخة. HM5097 تيمولول ماليات Timolol Maleate مادة عيارية من شركة Linneas A رقم الطبخة TML H 3 C O O S HN S CH 3 O O S NH 2 (I) C10 H16 N2O4S3.HCl, MW= مسحوق بلوري أبيض الى أبيض مطفأ منحل بالماء وهذه المادة غير مدرجة في الدستور البريطاني 2007 وإنما مدرجة بالدستور األمريكي 26 كمادة أولية فقط وقد أفردت لها بنفس الدستور طريقةHPLC لمعايرتها. أما مادة التيمولول ماليات )II( Timolol maleate فهي مدرجة في كل من الدستور األمريكي والبريطاني أنفي الذكر. وهي مسحوق أبيض أو غالبا أبيض عديم الرائحة أو عمليا عديم الرائحة ينحل بالماء الكحول الميثانول وقليل األنحالل بالكلوروفورم والبروبيلين غليكول وعديم األنحالل في األيثر والسيكلوهكزان. (II) C13H24N4O3S.C4H4O9, MW = لم توفر دساتير األدوية حتى تاريخه طريقة تحليلية لمعايرة الدورزوالميد هيدروكلوريد والتيمولول ماليات بآن واحد وعالميا سجلت بعض طرائق هذه المعايرات باستخدام ال ] HPLC 2 [ كما سجلت بعض الطرائق الضوئية بألعتماد على األشتقاق األول [3]. األشكال الصيدالنية Dosage forms مستحضر Timodor التابع لشركة دياموند للصناعات الدوائية Diamond Pharma على شكل قطرة 1 [كل عينية هيدروكلوريد )تكافىء مل يحتوي ملغ دورزوالميد ملغ دورزوالميد( و 6.85 تيمولول ماليات )تكافىء 5 ملغ تيمولول( ]. األجهزة Instrumentation التابع جهاز امتصاص الطيف الضوئي موديل لشركة ملغ CE7200 Cecil البريطانية Cecil instrument,limited,england كوارتز 1 سم. تحضير المحاليل:.1 تحضير المحلول العياري للدورزوالميد: مع استخدام خاليا يحضر هذا المحلول بتركيز مول/ل )54.1 ملغ من المادة العيارية تحل بقليل من الماء المقطر وتكمل ليتر باستخدام بالون معاير )محلول( 1 الى.2 تحضير المحلول العياري للتيمولول ماليات: يحضر هذا المحلول بتركيز مول/ل )64.5 ملغ تحل يقليل من الماء المقطر وتكمل الى بالون معاير )محلول B( 1.3 تحضير عياري مزيج :)A+B( يحضر بمزج حجم من + A حجم من B..4 تحضير محاليل السلسلة العيارية للدورزوالميد: ليتر باستخدام المجلد الرابع العدد التاسع جمادى األول 1434 آذار )مارس(

81 المجلة العربية للعلوم الصيدلية- مجلة اتحاد الجامعات العربية يحل 100 ملغ من الدورزوالميد هيدروكلوريد في 100 مل ماء ثم يؤخذ من المحلول الناتج و 5 مل ويمدد كل منهما الى 100 مل بستخدام بالون معاير. 5. تحضير محاليل السلسلة العيارية للتيمولول: يحل 100 ملغ من التيمولول ماليات في 100 مل من الماء المقطر ثم يؤخذ من المحلول الناتج و 5 مل ويمدد كل منهما الى 100 مل باستخدام بالون معاير. 6. تحضير محلول عياري بنفس تركيز المواد في القطرة العينية: )556 5 ملغ دورزوالميد هيدروكلوريد ملغ تيمولول( يوضعان في بالوم معاير سعة 25 مل حيث يحالن بقليل من الماء ثم يمددان الى 25 مل بعد ذلك يؤخذ 1 مل من المحلول الناتج ويمدد ل 100 مل بالماء ثم يؤخذ من المحلول الناتج 10 مل ويمدد ل 50 مل بالماء(. 7. تحضير محلول العينة: ينقل 1 مل من محلول القطرة العينية باستخدام ممص معاير سعة 1 مل ثم يوضع في بالون معاير سعة 100 مل ويمدد بالماء ل 100 مل حيث يؤخذ 10 مل من المحلول الناتج ويوضع في بالون معاير سعة 50 حيث يكمل بالماء المقطر الى خط العيار. 8. تحضير محلول غفل ( بالسيبو(: ينقل 1 مل من محلول البالسيبو باستخدام ممص معاير سعة 1 مل ثم توضع في بالون معاير سعة 100 مل ويتابع العمل كما هو الحال بتحضير محلول العينة. شروط العمل على الجهاز: المسح الطيفي كان ضمن المجال من نم مقابل الماء. تم استخدام خليو كوارتز بسماكة 1X 1 تم أحذ القياس لألمتصاص عند األمواج 254 نم وكذلك عند األمواج 295. النتائج: تم العمل بالشروط المشار إليها أعاله فحصلنا على مسح طيفي جيد للدورزوالميدد هيدروكلوريد حيث أبدى قمة أمتصاص أعظمي عند الموجة 254 نم )الشكل 1 (.كما قمنا بعمل مسح طيفي وفق الشروط الوارد أعاله فحصلنا على مسح طيفي لمادة التيمولول ماليات التي أبدت قمة امتصاص أعظمي عند الموجة 295 نم )الشكل 2( حيث أخذنا قياسات السلسلة العيارية عند الموجة 254 وكذلك عند هذه الموجة كما قمنا أيضا بحساب قيم A(1%,1cm وكذلك قيم ε طبقا للمعطيات التي حصلنا عليها وذلك عند كال الموجتين المذكورتين أعاله حيث أدرجنا النتائج بالجدولين 1 و 2. الشكل) 1 ( امتصاص محلول مائي من الدورزوالميد بالماء بتركيز مول/ل الشكل )2( امتصاص محلول التيمولول في الماء بتركيز مول/ل المجلد الرابع العدد التاسع جمادى األول 1434 آذار )مارس(

82 الجدول )1( قياسات السلسلة العيارية للدورزوالميد Dorzolamide Flask Nr. A at 254 nm A at 295 nm C% w/v A(1%,1cm) at 254 A(1%,1cm) at 295 nm ε at 254 nm ε at 295nm N= القيمة الوسطى 1 القيمة الوسطى الجدول )2( قياسات السلسلة العيارية للتيمولول ماليات Timolol maleat Flask Nr. A at 254 nm A at 295 nm C% w/v A(1%,1cm) at 254 A(1%,1cm) at 295 nm ε at 254 nm ε at 295 nm, N= حساب تركيز كل مادة على حدا وفقا لما هو معروف بأن كما يبين الجدول 3 القراءات التي حصلنا عليها من تحضير امتصاص المزيج عند الموجة 245 نم يساوي امتصاص I محلول السلسلة العيارية لمحلول المزيج مع تبيان طريقة عند هذه الموجة + امتصاص II عند نفس الموجة وكذلك التحضير تحديد الكميات المكتشفة ونسبتها حيث أننا قمنا فإن امتصاص المزيج عند 295 نم يساوي امتصاص I عند بداية بإجراء مسح طيفي للمزيج وفق شروط العمل [5-6]. عند نفس الموجة II هذه الموجة + امتصاص المذكورة أعاله والتي يوضحه الشكل )3( ثم قمنا بإجراء المجلد الرابع العدد التاسع جمادى األول 1434 آذار )مارس(

83 المجلة العربية للعلوم الصيدلية- مجلة اتحاد الجامعات العربية الشكل )3( امتصاص مزيج من الدورزوالميد هيدروكلورايد والتيمولول بتركيز مول لكل منهما في الماء الجدول )3( قراءات األمتصاص للمزيج في محلول السلسلة العيارية Sol.A ml Sol B ml Dist. Water Conc. I mg/ml Conc. II mg/ml A at 295nm A at 254nm Detection Quantity I mg/ml % I Detection Quantity II mg/ml % II المجلد الرابع العدد التاسع جمادى األول 1434 آذار )مارس(

84 المناقشة: بناء على حقيقة أن أمتصاص المزيج عند الموجة 254 نم يساوي لمجموع امتصاص كل مادة على حدا عند نفس طول الموجة فإننا نستطيع ان نعبر رياضيا عن ذلك : A mix(254) = A I (254) + A II (254) (1) Amix(295) = A II (295) + AI ( 295) وانطالقا من قانون المبير بير A = ε bc استطعنا أن نحسب قيمة ε للمركب I وكذلك للمركب II كما هو موضح بالجدول )3(. أما تركيز كل من I و II فتم حسابهما من المعادالت التي تم التوصل لها رياضيا : Conc I = A mix 254. ε II 295 A mix 295. ε II 254 ε I 254. ε II 295 ε I 295. ε II 254 أما حساب تركيز II فيحسب كما يلي: Conc II = A mix 295. ε I 295 A mix 254. ε I 295 ε I 254. ε II 295 ε I 295. ε II 254 المخطط 1 المخطط 2 ويبين المخطط )1( خطية الدورزوالميد مقابل األمتصاص وفق القيم المرجة بالجدول وأما المخطط )2( فيبن خطية التيمولول مقابل األمتصاص وفق القيم المدرجة بالجدول 4. لقد تم تطبيق الطريقة بنجاح على المستحضر بعد أن تم إجراء مسح طيفي للمستحضر الغفل Placebo المعالج بنفس الطريقة فلم نحصل على أي قمة امتصاص ضمن مجال العمل وتم التأكد من صالحية الطريقة من خالل مقارنتها مع طريقة بالجدول 4. من خالل مقارنة قيم اختبار t و حدود الثقة [2] HPLC و كانت النتائج كما هي f مع قيمها الجدولية عند %95 كانت ضمن الحدود المقبولة مما يوحي بصالحية الطريقة المقترحة. المجلد الرابع العدد التاسع جمادى األول 1434 آذار )مارس(

85 المجلة العربية للعلوم الصيدلية- مجلة اتحاد الجامعات العربية الجدول )4( نتائج تطبيق الطريقة المقترحة على مستحضر تيمولول ومقارنتها مع طريقة الHPLC )عدد العينات =10(: طريقة ال ] HPLC 2 [ الطريقة المقترحة 0.7 ± 99.2 T= 3.25 F= ± 99.8 T= 4.1 F=3.2 الدورزوالميد 0.92 ± التمولول ± 98.1 )1 )2 References 1- British pharmacopoeia Erk N. Rapid and sensitive HPLC method for the simultaneous determination of dorzolamide hydrochloride and timolol maleate in eye drops with arry and UV-detection. Pharmazie, (7); Erk N. Simultaneous determination of dorzolamide HCl and timolol maleate in eye drops by two defferent spectroscopic methods. J.Pharm.Biomed Anal. (28); The Merck index 5- Skoog A.D., et al. Fundamentals of Analytica Chemistry 8 th edition. Tomson, Skoog A.D., et al. Instrumental analysis 5.edition. Saunnders college Puplishing, The United States Pharmacopeia XXX, NF 25. The Us Convention, Rockville, MD المجلد الرابع العدد التاسع جمادى األول 1434 آذار )مارس(

86 المجلد الرابع العدد التاسع جمادى األول 1434 آذار )مارس(

87 المجلة العربية للعلوم الصيدلية- مجلة اتحاد الجامعات العربية دراسة في الزجاج لفعالية بعض الصادات الحيوية في منع التصاق بعض الجراثيم الهوائية المعزولة من لب اللوزتين Study In Vitro Study of the Efficacy of some Antibiotic in Preventing the adherence of some aerobic bacteria Isolated from Tonsil's Core الملخص Abstract عبدالغني كدو و مصطفى العموري قسم الكيمياء الحيوية و األحياء الدقيقة- كلية الصيدلة جامعة دمشق سورية أصبح مؤكدا الادور الهاام للبياوفيلم فاي حااالت الانكس و مقاوماة الجاراثيم للصاادات الحيوياة المشااهدة فاي العاداوى الجرثومياة المتكررة. و يعتبر البيوفيلم الجرثومي الم تشكل داخل لاب اللاوزتين العامال الرئيساي لحالاة اإلزماان و فشال المعالجاة بالصاادات الحيوية عند مرضى التهاب اللوزتين المتكرر. وألهمية ذلك هادفت دراساتنا إلاى دراساة و تقيايم فعالياة بعاض الصاادات الحيوياة المستخدمة في معالجة التهاب اللوزتين المتكرر في منع تشكل البيوفيلم في الزجاج من قبل جراثيم معزولة مان لاب اللاوزتين. تمت الدراسة على خمساة أناواع جرثومياة هوائياة ع زلات جميعهاا مان لاب اللاوزتين ألطفاال كاانوا يعاانون مان التهااب لاوزتين متكاارر و خضااعوا لعمليااة استئصااال لااوزتين و هااي المكاورات العنقوديااة الذهبيااة و المكااورات العنقوديااة الجلديااة والمكااورات العقدية المقيحة من إيجابيات الغرام و الكلبسيلة الرئوية و اإلشريكية القولونية من سلبيات الغرام. قمناا بدراساة فعالياة خمساة صادات حيوية من زمر مختلفة هي األموكسيسايلين /حماض الكالفوالنياك و األزيثرومايساين و اللينكومايساين و السيفروكسايم و السيفترياكسون. أ جريت اختبارات العزل و االستعراف واختبارات الحساسية للصادات الحيوية حسب الطرق المرجعية لاذلك كما تم تقييم فعالياة الصاادات الحيوياة المضاادة لاللتصااق وفاق طريقاة المعاايرة الميكروياة باساتخدام صافيحة وذلاك مان خاالل قيااااس الكثافاااة البصااارية للجاااراثيم الملتصاااقة باساااتخدام جهااااز إليااازا عناااد طاااول موجاااة 550 ناااانومتر. أظهااارت دراساااتنا أن لألزيثرومايسااااين أعلااااى فعاليااااة فااااي منااااع التصاااااق المكااااورات إيجابيااااة الغاااارام تاااااله السيفالوساااابورينات )السيفروكساااايم و السيفترياكسون( فاألوغمنتين بينما أدى اللينكومايساين إلاى زياادة االلتصااق. كماا أظهارت دراساتنا أن أعلاى فعالياة مضاادة اللتصاق العصايات سالبية الغارام كانات للسيفترياكساون فاي حاين لام ي باد كاال مان األوغمنتاين و األزيثرومايساين أي تاأثير أماا اللينكومايسين و السيفروكسيم فقد سببا زيادة االلتصاق. It was proven that biofilm formation had an important role in relapse infections and bacterial resistance against antibiotics in recurrent bacterial infections. Bacterial biofilm formation in crypts of tonsil's Core is considered as a major factor in the chronicity and treatment failure in patients with recurrent tonsillitis.according to that, we aimed in our study to evaluate the efficacy of some antibiotics recommended in recurrent tonsillitis in preventing the biofilm formation by some bacteria isolated from tonsil's core. We had worked on five aerobic species, isolated from tonsil's core of children suffering from recurrent tonsillitis and undergoing tonsillectomy, three were Gram Positive Cocci (Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Streptococcus pyogenes), and two were Gram Negative bacilli (Klebsiella pneumonia, Escherichia coli). We evaluated efficacy of five different antibiotics, Amoxicillin\ clavulanic acid, Azithromycin, Lincomycin, Cefuroxime, and Ceftriaxone. Bacterial identification and Disk diffusion test were carried out through standard procedures. Evaluation of the anti adherence efficacy of the antibiotics were carried out by using "The microtiter plate assay". Our study shows that Azithromycin has the best efficacy on the Gram Positive Cocci adherence, followed by Cephalosporin, and Augmentin, while Lincomycin increased the adherence 's rate. Ceftriaxone has the best efficacy on the Gram Negative Bacilli adherence, while Lincomycin and Cefuroxime المجلد الرابع العدد التاسع جمادى األول 1434 آذار )مارس(

88 increased the adherence's rate, and Augmentin and Azithromycin have no effect on the adherence. الكلمات المفتاحية :Key words البيوفيلم biofilm االلتصاق adherence لب اللوزتين tonsil's core -1 المقدمة :Introduction إن أول من وصف البيوفيلم الجرثومي هو العالم األلماني أنطون فان ليفنهوك Anton Van Leewenhoek وذلك عام )11( ولكن التوصيف الفعلي له جاء بعد أبحاث Costeron و زمالئه )13(. تجم عات كثيفة و معقدة لخاليا جرثومية قد واحد أو من عدة أنواع جهة ي عرف البيوفيلم الجرثومي بأنه تكون من نوع مرتبطة مع بعضها البعض من و من جهة أخرى م لتصقة بشكل غير عكوس irreversibly إلى سطح حيوي biotic )كأنسجة اللوزتين و أنسجة األذن الوسطى...الخ( أو غير حيوي abiotic )كالقثاطر البولية و الشبكات القلبية.. الخ( و م غلفة enclosed بمطرس matrix متكون بشكل أساسي من عديدات سكاريد خارج خلوية Extracellular Polysaccharides تفرزها الجراثيم الملتصقة (.) بعد أن تلتصق الجراثيم على السطح و تبدأ في تشكيل البيوفيلم تزداد مقاومتها للصادات الحيوية بحوالي ) ( 1000( مرة بالمقارنة مع أشكالها الحرة )52 هذه المقاومة يمكن أن تتم بآلية واحدة أو بعدة آليات حيث أشارت دراسات عديدة )54 5 2( إلى أن وجود المطرس الحاوي على عديد السكاريد يلعب دورا في منع الصاد الحيوي من اختراق البيوفيلم. أخرى ) ( كما أكدت دراسات أن تغي ر تركيز المواد المغذية و الظروف البيئية داخل البيوفيلم يؤثر على فعالية الصادات الحيوية. كما أشار بعض الباحثين )32 55( إلى حدوث تناقص في معدل النمو و االستقالب للجراثيم داخل البيوفيلم األمر الذي يجعلها أكثر مقاومة للصادات الحيوية. بعض الدراسات ) ( كما وجود تجم ع صغير اقترحت لخاليا جرثومية يمثل حوالي واحد بالمليون من التجمع األساسي للخاليا الجرثومية الم شكلة للبيوفيلم ت دعى الصوامد persisters تتميز هذه الخاليا بكونها ذات تحمل عال لتراكيز مرتفعة من الصادات الحيوية و ي عزى ذلك إلى حدوث طفرات جينية وأهمها في الجين.hipA إن فشل المعالجة بالصادات الحيوية و حدوث حاالت نكس أمران شائعان في العداوى الجرثومية المتكررة التي تصيب األطفال ( 48(. و يعتبر تشكل البيوفيلم ضمن أنسجة اللوزتين من األسباب األساسية لحالة اإلزمان 18 9( chronicity المشاهدة في التهاب اللوزتين المتكرر. )28 27 إن أول من أثبت وجود البيوفيلم ضمن أنسجة اللوزتين عند مرضى التهاب اللوزتين المتكرر هما الباحثان Chole و )9( Faddis حيث قد ما أدلة تشريحية على ذلك بعد دراستهما لعينات نسيجية مأخوذة من لب اللوزات بعد استئصالها لمرضى كان لديهم التهاب لوزتين متكرر. أكدت دراسات أخرى وجود البيوفيلم بنسبة )28 27 )% 18( 85-70( كما تمت في دول مختلفة في أنسجة ألطفال كان لديهم قصة التهاب لوزتين متكرر. اللوزتين يتشكل البيوفيلم ضمن أنسجة اللوزتين بداية بالتصاق الخاليا الجرثومية بأنسجة اللوزتين )مع السطح الرطب لخبايا اللوزتين( وبمرور الوقت تزداد شدة التصاقها على األنسجة وتتغطى بغالف عديد سكاريد ليتشكل بعدها البيوفيلم الناضج المتكون من طبقتين خارجية هوائية متعرضة بشكل مباشر لتأثير الصادات الحيوية ومكونات جهاز المناعة وتحوي خاليا نشيطة و داخلية ال هوائية محمية من تأثير الصادات الحيوية وحاوية على الخاليا الجرثومية الم قاو مة. يزداد عدد الخاليا الجرثومية الملتصقة بمرور الوقت و يبدأ نظام إشارة خاص ي دعى ال Quorum sensing بالتشكل للمساهمة في نشاط الخاليا ونموها و تصبح اللوزتين مستودعا جرثوميا لعداوى متكررة 11( ) المجلد الرابع العدد التاسع جمادى األول 1434 آذار )مارس(

89 المجلة العربية للعلوم الصيدلية- مجلة اتحاد الجامعات العربية عند وضع خطة عالجية لتدبير البيوفيلم المتشكل عند مرضى التهاب اللوزتين الجرثومي المتكرر البد من دراسة حساسية الجراثيم للصادات الحيوية في شكليها الحر و الملتصق ) ( البنيوية و الشكلية للبيوفيلم و األخذ بعين االعتبار الخواص ( 36(. لذلك هدفت دراستنا لدراسة و معرفة قدرة الصادات الحيوية المستخدمة في معالجة التهاب اللوزتين المتكرر على منع التصاق الجراثيم المعزولة من لب اللوزتين و بالتالي منع تشكيل البيوفيلم و بتراكيز لتلك الصادات قريبة من تلك التي يمكنها وصولها إلى األنسجة داخل اللوزتين. -2 المواد و الطرائق :Materials and Methods ذراري الدراسة - المكورات العنقودية الذهبية : تم العمل على ذريتين S.aureus من كل من و المكورات العنقودية الجلدية S.epidermidis و المكورات العقدية المقيحة S.pyogenes و الكلبسيلة الرئوية K.pneumoniae و اإلشريكية القولونية E.coli.ع زلت جميعها من لب اللوزتين ألطفال تراوحت أعمارهم بين )5-12 سنة( كانوا يعانون من التهاب لوزتين متكرر و خضعوا لعملية استئصال لوزتين في مشفى المواساة الجامعي و مشفى حرستا الوطني. تم استعراف الجراثيم المعزولة و دراسة حساسيتها للصادات الحيوية حسب الطرق المرجعية لذلك. - الصادات الحيوية المدروسة : استخدمنا مساحيق جافة من األموكسيسيلين / حمض الكالفوالنيك (AUG) و السيفروكسيم )CRX) من شركة GlaxoSmithKline و )إنكلترا( األزيتروميسين )AZM( من شركة )الواليات المتحدة األمريكية( من شركة و السيفترياكسون Pfizer (CTR) Sandoz )فرنسا( أما اللينكوميسين )LIN( فاستخدمنا منه محلوال م عدا للحقن من شركة Obari )سورية(. - األوساط الزرعية المستخدمة : المرق المغذي Nutrient Broth األغار المغذي مرق موللر هينتون Muller Hinton Broth Nutrient Agar موللر هينتون أغار Muller Hinton agar األغار بالشوكوال األغار بالدم Blood agar Chocolate agar أغار شابمان Salt Manitol Agar األغار باأليوزين زرقة الميتيلين EMB Agar و أغار ماكونكي و جميعها من شركة Biomêrieux الفرنسية. Mackonkey Agar - المواد المستخدمة قي طريقة المعايرة المكروية : صفيحة بالستيكية عقيمة تحتوي 96 حفرة حرف well ذات قعر بشكل V و محلول البنفسجية المتبلرة Crystal violet % 0.1 و محلول اإليتانول مناسبة لغسل الصفيحة % 95 و م م ص م كروي و أحواض مائية micropipet و سواتر زجاجية مناسبة و صفيحة عقيمة ذات قعر مسطح بشكل حرف إليزا و جهاز U ELISA (Enzyme-( linked immune sorbent assay 550 نانو متر. - ذو طول موجة تقييم فعالية الصادات الحيوية في منع تشكل البيوفيلم الجرثومي : درسنا الفعالية المضادة لاللتصاق وفق طريقة المعايرة الم كروية باستخدام صفيحة "The Microtiter 14 10( Assay" 25( Plate. وذلك بتحضير معلقا جرثوميا لكل ذرية بتركيز يعادل و حضرنا أجزاء ال ) CFU/ml( (( تراكيز من الصادات الحيوية المدروسة تمثل Maximum concentration in Cmax serum المتناقصة 1/4 Cmax 1/2 Cmax Cmax( Cmax 1/8(.]إن قيم ال 9 µg /ml Cmax لألوغمنتين = = و لألزيتروميسين = /ml µg و للسيفترياكسون 351 µg /ml و للسيفروكسيم = و للينكوميسين = /ml.] 11.6 µg وضع تم 5.13 µg /ml 100 الحفر ثم أضفنا ميكرولتر من المعلق الجرثومي في كل ميكرولتر 100 من تراكيز الصادات الحيوية المراد دراستها )مع مالحظة اإلبقاء على حفر دون إضافة أي تركيز من الصاد الحيوي كعياري.)Control غ طيت صفيحة االختبار بواسطة ساترة زجاجية عقيمة بعد الحضن 48 ساعة ب º 37 م غ سلت الصفيحة ثالث مرات ضمن حوض مائي مع التحريك بشكل خفيف للتخلص من المجلد الرابع العدد التاسع جمادى األول 1434 آذار )مارس(

90 1- دراسة التأثير المضاد لاللتصاق للصادات الحيوية ضد المكورات العنقودية الذهبية: تم العمل على ذرية من المكورات العنقودية الذهبية الحساسة للميثاسيللين MSSA وأخرى من المكورات العنقودية الذهبية المقاومة للميثاسيللين MRSA أ- ال :MSSA لقد كانت هذه الذرية حساسة لكل الصادات الحيوية المدروسة و أظهرت نتائجنا أن أعلى فعالية كانت مع األزيثرومايسين عند التركيز Cmax حيث كانت النسبة المئوية لنقص االلتصاق %33.6 و انخفضت الفعالية مع تناقص تركيز الصاد الحيوي إلى أن وصلت إلى %5.7 مع Cmax 1/8. و جاء السيفترياكسون بالمرتبة الثانية و بنفس السلوك حيث كانت أعلى فعالية عند و انخفضت إلى %2.8 مع )%25( Cmax 1/8.وبنفس الشكل جاء Cmax األوغمنتين بالمرتبة الثالثة بنسبة نقص %21 عند و %2.8 عند نقص %14.4 عند Cmax Cmax Cmax 1/8. ومن ثم السيفروكسيم بنسبة و %1.9 عند 1/8. أما Cmax اللينكوميسين فقد كان تأثيره مخالفا تماما حيث أنه حر ض الجرثوم على تشكيل البيوفيلم و زيادة االلتصاق بالتراكيز العالية حيث كانت نسبة الزيادة في االلتصاق %20 مع Cmax مع و انخفضت هذه الزيادة بتناقص التركيز إلى %0.9 1/8. و يبين الجدول )1( و الشكل )1( الفعالية Cmax المضادة لاللتصاق الجرثومي للصادات المدروسة و بالتراكيز المختلفة. الجراثيم غير الملتصقة. أ ضيف 200 ميكرولتر من محلول البنفسجية المتبلرة % 0.1 إلى كل الحفر. و بعد 10 دقائق )بحرارة الغرفة( غ سلت بالماء للتخلص من كمية الملون الزائدة و بعد جفافها تماما أ ضيف 200 ميكرولتر من اإليتانول % 95 و بعد 15 دقيقة بحرارة الغرفة أ خذ 125 ميكرولتر من المحلول الموجود في الحفر و و ض ع في حفر الصفيحة U بنفس ترتيب الصفيحة V. ثم و ض عت الصفيحة U في جهاز اإلليزا ELISA وقيست الكثافة الضوئية Optical Density للمحلول عند طول موجة 550 نانومتر. تم العمل بشكل مضاعف duplicate وتم أخذ وسطي القراءتين ثم ك ررت كل تجربة ثالث مرات ثم على ثالثة أيام ثم أ خذ و سطي القراءات الثالث. قمنا بمقارنة الكثافة الضوئية للعينة الحاوية على الصاد الحيوي مع الكثافة الضوئية للعياري ( يأ الجرثوم بدون الصاد الحيوي( و حددنا النسبة المئوية للفعالية المضادة لاللتصاق للصاد الحيوي بحساب مقدار التناقص في قيمة الكثافة الضوئية و التي تعكس بالمقابل التناقص في عدد الجراثيم الملتصقة. النسبة المئوية لفعالية الصاد الحيوي المضادة لاللتصاق الجرثومي = -3 النتائج :Results الجدول )1(: الفعالية المضادة لاللتصاق ضد )MSSA( LIN CRX AUG CTR AZM %24+ %21- % %25- % Cmax %20+ %14- %9.60- % %24-1\2 Cmax %3.80+ %5.70- %9.60- % %18-1\4 Cmax %0.90+ %2.80- %1.90- %2.80- %5.70-1\8 Cmax المجلد الرابع العدد التاسع جمادى األول 1434 آذار )مارس(

91 المجلة العربية للعلوم الصيدلية- مجلة اتحاد الجامعات العربية 140% 120% 100% االلتصاق 80% 60% 40% 20% 0% Cmax 1\2 Cmax 1\4 Cmax 1\8 Cmax AZM 66% 76% 82% 94% CTR 75% 87% 89% 97% AUG 79% 86% 94% 97% CRX 86% 90% 90% 98% LIN 124% 120% 104% 101% التركيز الشكل )1(: العالقة بين التراكيز المختلفة للصادات الحيوية و االلتصاق الجرثومي في حالة ال )MSSA( ب- ال :MRSA لقد كانت هذه الذرية مقاومة لكل الصادات الحيوية المدروسة و في نتائجنا كانت أعلى فعالية مع السيفترياكسون عند التركيز Cmax حيث كانت نسبة نقص االلتصاق 17.6 % و انخفضت الفعالية بتناقص التركيز إلى أن وصلت إلى % 0.9 مع التركيز Cmax 1/8 و جاء األزيثرومايسين بالمرتبة الثانية حيث كانت نسبة االلتصاق عند التركيز التركيز Cmax Cmax %13.2 وتناقصت إلى %12.3 عند 1/2 أما تراكيزه المنخفضة فقد حر ضت على زيادة االلتصاق و بلغت نسبة الزيادة %12.3 مع 1/4 و %8.8 مع Cmax Cmax 1/8. و لم ي بد األوغمنتين فعالية واضحة حيث كانت نسبة النقص في االلتصاق أقل من %1 عند التركيز Cmax في حين أدت تراكيزه المنخفضة إلى زيادة االلتصاق بنسبة %6.1 عند التركيز 1/4 و Cmax 1/2 و %0.8 عند التركيزين Cmax Cmax. 1/8 أما السيفروكسيم و اللينكومايسين فقد كان تأثيرهما واضح في زيادة االلتصاق و تشكيل البيوفيلم كما هو مبين في الجدول )2( و الشكل )2(. الجدول )2(: الفعالية المضادة لاللتصاق ضد المكورة العنقودية الذهبية الحساسة للميثاسللين MRSA( ) LIN CRX AUG CTR AZM Cmax \2 Cmax \4 Cmax \8 Cmax المجلد الرابع العدد التاسع جمادى األول 1434 آذار )مارس(

92 140% 120% 100% 80% االلتصاق 60% 40% 20% 0% Cmax 1\2 Cmax 1\4 Cmax 1\8 Cmax AZM 87% 88% 88% 109% CTR 82% 84% 84% 99% AUG 99% 84% 101% 101% CRX 108% 0% 101% 101% LIN 131% 122% 118% 115% التركيز الشكل )2(: العالقة بين التراكيز المختلفة للصادات الحيوية و االلتصاق الجرثومي في حالة )MRSA( 3- المكورات العنقودية الجلدية الحساسة للصادات المدروسة: حصلنا على أعلى نسبة نقص في االلتصاق مع األزيثرومايسين بتركيز ال Cmax )%29.8( و تناقصت فعاليته مع تناقص تركيزه إلى أن وصلت إلى %14 مع Cmax 1/8 و جاء السيفروكسيم بالمرتبة الثانية و بنفس السلوك وكذلك السيفترياكسون بالمرتبة الثالثة ثم األوغمنتين. أما اللينكومايسين فقد اختلف تأثيره باختالف تركيزه حيث أنه حر ض على زيادة االلتصاق عند التركيز Cmax وبنسبة %5.2 و لكنه أبدى فعالية في إنقاص االلتصاق عند التركيز 1/2 بنسبة %14.9. و يبين Cmax الجدول )3( والشكل )3( الفعالية المضادة لاللتصاق الجرثومي للصادات المدروسة و بالتراكيز المختلفة: الجدول )3(: الفعالية المضادة لاللتصاق ضد المكورة العنقودية الجلدية الحساسة للصادات المستعملة LIN CRX AUG CTR AZM Cmax \2 Cmax \4 Cmax \8 Cmax المجلد الرابع العدد التاسع جمادى األول 1434 آذار )مارس(

93 المجلة العربية للعلوم الصيدلية- مجلة اتحاد الجامعات العربية 120% 100% 80% 60% االلتصاق 40% 20% 0% Cmax 1\2 Cmax 1\4 Cmax 1\8 Cmax AZM 70% 77% 83% 86% CTR 79% 83% 86% 90% AUG 93% 87% 91% 97% CRX 75% 88% 87% 89% LIN 105% 115% 85% 88% التركيز الشكل )3(: العالقة بين التراكييز المختلفية للصيادات الحيويية و االلتصياق الجرثيومي فيي حالية المكورات العنقودية الجلدية الحساسة للصادات المستخدمة 4- المكورات العنقودية الجلدية المقاومة للصادات المدروسة: الحظنا اختالف التأثير باختالف التركيز حيث أظهرت نتائجنا أن أعلى نسبة نقص في االلتصاق كانت مع األزيثرومايسين عند التركيز )7.9 %( و تراجعت Cmax الفعالية بتناقص التركيز وتراجعت بفعل نقص التركيز إلى أن التراكيز 1/4 و Cmax 1/8 حر ضت على زيادة Cmax االلتصاق )بنسبة %4.2 و %1.7 على التوالي(. و لوحظ السلوك نفسه مع السيفترياكسون. أما األوغمنتين فقد حافظ على فاعلية مضادة لاللتصاق بالتراكيز المختلفة مع مالحظة أن الفاعلية تناقصت مع تناقص التركيز. و أخيرا ل وحظ أن السيفروكسيم كان فعال فقط عند التركز Cmax و بنسبة نقص %5.1 فقط و لم ت بد تراكيزه األخرى أي تأثير مهم. أما اللينكومايسين فقد كان تأثيره واضحا في تحريض الجرثوم على زيادة االلتصاق و تشكيل البيوفيلم بكل تراكيزه. و الجدول )4( مع الشكل )4( يوضحان ذلك. الجدول )4(: الفعالية المضادة لاللتصاق ضد المكورة العنقودية الجلدية المقاومة للصادات المستعملة LIN CRX AUG CTR AZM Cmax \2 Cmax \4 Cmax \8 Cmax المجلد الرابع العدد التاسع جمادى األول 1434 آذار )مارس(

94 120% 100% 80% 60% االلتصاق 40% 20% 0% Cmax 1\2 Cmax 1\4 Cmax 1\8 Cmax AZM 92% 97% 102% 104% CTR 94% 98% 103% 100% AUG 95% 98% 98% 99% CRX 95% 100% 103% 103% LIN 103% 107% 101% 101% التركيز الشكل )4(: العالقة بين التراكييز المختلفية للصيادات الحيويية و االلتصياق الجرثيومي فيي حالية المكورات العنقودية الجلدية المقاومة للصادات المستخدمة 5- المكورات العقدية المقيحة الحساسة للصادات الحيوية: أظهرت نتائجنا أن أعلى فعالية كانت مع األزيترومايسين عند التركيز Cmax )%23.5( و تناقصت فعاليته مع تناقص تركيزه إلى أن وصلت إلى )%7.5( مع.1/8 Cmax وجاء السيفترياكسون بالمرتبة الثانية حيث بلغت أعلى فعالية )%18.8( عند Cmax وتناقصت بنقص التركيز حتى أنه حصل زيادة بنسبة االلتصاق وصل %2.8 عند Cmax 1/8. و جاء السيفروكسيم بالمرتبة الثالثة و بنفس سلوك السيفترياكسون في حين حافظ األوغمنتين على فاعليته في انقاص االلتصاق مع تراكيزه المختلفة و استمر اللينكومايسين في تحر يضه على زيادة االلتصاق بكل التراكيزكما هو مبين في الجدول )5( و الشكل )5(: الجدول )5(: الفعالية المضادة لاللتصاق ضد المكورة العقدية المقيحة الحساسة للصادات الحيوية المستخدمة LIN AUG CRX CTR AZM Cmax \2 Cmax \4 Cmax \8 Cmax المجلد الرابع العدد التاسع جمادى األول 1434 آذار )مارس(

95 المجلة العربية للعلوم الصيدلية- مجلة اتحاد الجامعات العربية التأثير المضاد لاللتصاق ضد ال S.pyogens 140% 120% 100% االلتصاق 80% 60% 40% 20% 0% Cmax 1\2 Cmax 1\4 Cmax 1\8 Cmax AZM 76% 80% 84% 92% CTR 81% 84% 100% 100% CRX 88% 102% 103% 107% AUG 89% 91% 93% 94% التركيز الشيكل )5(: العالقية بيين التراكييز المختلفية للصيادات الحيويية و االلتصياق الجرثيومي فيي حالية المكورات العقدية المقيحة الحساسة للصادات المستخدمة 6- المكورات العقدية المقيحة المقاومة للصادات المدروسة: الحظنا اختالف التأثير باختالف التركيز حيث ظهرت أعلى نسبة نقص في االلتصاق مع السيفروكسيم عند التركيز )13.7 %( وبدأ هذا التأثير يتراجع مع نقص Cmax التركيز لدرجة أنه مع 8/1 ال Cmax كان هناك زيادة في نسبة االلتصاق )2.9 %(. و لوحظ السلوك نفسه في حالة األزيثرومايسين و األوغمنتين و السيفترياكسون. أما اللينكومايسين فقد كان تأثيره واضحا في تحريض الجرثوم على زيادة االلتصاق و تشكيل البيوفيلم بكل تراكيزه و يوضح كل من الجدول )6( و الشكل )6( ذلك. الجدول )6(: الفعالية المضادة لاللتصاق ضد المكورة العقدية المقيحة المقاومة للصادات الحيوية المستخدمة LIN CRX AUG CTR AZM Cmax \2 Cmax \4 Cmax \8 Cmax المجلد الرابع العدد التاسع جمادى األول 1434 آذار )مارس(

96 120% 100% 80% 60% االلتصاق 40% 20% 0% Cmax 1\2 Cmax 1\4 Cmax 1\8 Cmax AZM 90% 97% 105% 105% CTR 96% 99% 103% 101% AUG 94% 98% 107% 105% CRX 86% 100% 104% 104% LIN 108% 105% 105% 102% التركيز الشيكل )6(: العالقية بيين التراكييز المختلفية للصيادات الحيويية و االلتصياق الجرثيومي فيي حالة المكورات العقدية المقيحة المقاومة للصادات المستخدمة )%3.8( عند Cmax 7- الكلبسيله الرئوية الحساسة للصادات المدروسة كان للسيفترياكسون تأثير مضاد لاللتصاق عند التركيز Cmax )%13.3( و تناقص هذا التأثير مع خفض التركيز لدرجة أنه مع 1/8 ازداد االلتصاق بنسبة %13.3. Cmax وجاء األزيثرومايسين بالمرتبة الثانية حيث بلغت الفعالية )%5.7( عند Cmax و تناقصت الفعالية بتناقص التركيز وجاء األوغمنتين بالمرتبة الثالثة حيث أعطى فعالية أما تراكيزه األقل فقد أدت إلى زيادة االلتصاق بنسبة %4.7 عند.1/4Cmax أما اللينكومايسين و السيفروكسيم فقد كان لهما تأثير واضح في تحر يض الجرثوم على االلتصاق وتشكيل البيوفيلم و يبين الجدول )7( والشكل )7( الفعالية المضادة لاللتصاق الجرثومي للصادات المدروسة و بالتراكيز المختلفة: الجدول )7(: الفعالية المضادة لاللتصاق ضد الكلبسيله الرئوية الحساسة للصادات الحيوية المستخدمة LIN CRX AUG CTR AZM Cmax \2 Cmax \4 Cmax \8 Cmax المجلد الرابع العدد التاسع جمادى األول 1434 آذار )مارس(

97 المجلة العربية للعلوم الصيدلية- مجلة اتحاد الجامعات العربية 140% 120% 100% االلتصاق 80% 60% 40% 20% 0% Cmax 1\2 Cmax 1\4 Cmax 1\8 Cmax AZM 94% 97% 99% 100% CTR 87% 98% 126% 113% AUG 96% 100% 105% 102% CRX 93% 105% 104% 103% LIN 120% 114% 112% 107% التركيز الشكل )7(: العالقة بين التراكييز المختلفية للصيادات الحيويية و االلتصياق الجرثيومي في حالة الكلبسيلة الرئوية الحساسة للصادات المستخدمة 8- الكلبسيله الرئوية المقاومة للصادات المدروسة: أظهر السيفروكسيم عند التركيز Cmax نسبة نقص في االلتصاق % 7.8 ثم بدأت فاعليته تنخفض مع تراجع التركيز إلى أنه عند 4/1 ال Cmax أدى إلى زيادة في نسبة االلتصاق بلغت %5.5 و لوحظ السلوك نفسه مع السيفترياكسون و كذلك األوغمنتين. أما اللينكومايسين و األزيثرومايسين فقد كان تأثيرهما واضحا في تحريض الجرثوم على زيادة االلتصاق و تشكيل البيوفيلم بكل التراكيز كما هو مبين في الجدول )8( و الشكل )8(: الجدول )8(: الفعالية المضادة لاللتصاق ضد الكلبسيله الرئوية المقاومة للصادات الحيوية المستخدمة LIN CRX AUG CTR AZM Cmax \2 Cmax \4 Cmax \8 Cmax المجلد الرابع العدد التاسع جمادى األول 1434 آذار )مارس(

98 120% 100% 80% 60% االلتصاق 40% 20% 0% Cmax 1\2 Cmax 1\4 Cmax 1\8 Cmax AZM 92% 96% 101% 100% CTR 95% 97% 102% 101% AUG 97% 101% 101% 99% CRX 92% 96% 106% 103% LIN 106% 102% 102% 100% التركيز الشكل )8(: العالقة بين التراكيز المختلفة للصادات الحيوية و االلتصاق الجرثومي في حالة الكلبسيلة الرئوية المقاومة للصادات المستخدمة 9- اإلشريكية القولونية الحساسة للصادات المدروسة: أظهرت نتائجنا أن أعلى فعالية كانت مع السيفترياكسون عند التركيز )%26.2( و تناقصت هذه الفعالية مع Cmax تناقص التركيز و جاء األزيثرومايسين و األوغمنتين بالمراتب التالية و بالسلوك نفسه. غير أن الفرق كان مالحظا مع اللينكومايسين الذي عند ال فقط سبب Cmax نقص في االلتصاق بنسبة % 8 و سبب زيادة خفيفة في االلتصاق )%2( عند Cmax 1/2. و أخيرا جاء السيفروكسيم بنسبة )%5( عند Cmax و بتناقص التركيز نقصت الفاعلية و الجدول )9( و كذلك الشكل )9( يوضحان ذلك: الجدول )9(: الفعالية المضادة لاللتصاق ضد اإلشريكية القولونية الحساسة للصادات الحيوية المستخدمة LIN CRX AUG CTR AZM Cmax \2 Cmax \4 Cmax \8 Cmax المجلد الرابع العدد التاسع جمادى األول 1434 آذار )مارس(

99 المجلة العربية للعلوم الصيدلية- مجلة اتحاد الجامعات العربية 120% 100% 80% 60% االلتصاق 40% 20% 0% Cmax 1\2 Cmax 1\4 Cmax 1\8 Cmax AZM 77% 80% 86% 99% CTR 74% 85% 94% 96% AUG 99% 94% 97% 101% CRX 95% 99% 100% 99% LIN 92% 102% 100% 100% التركيز الشكل )9(: العالقة بين التراكييز المختلفية للصيادات الحيويية و االلتصياق الجرثيومي فيي حالية اإلشريكية القولونية الحساسة للصادات المستخدمة 10- بالنسبة لإلشريكية القولونية المقاومة للصادات المدروسة: )%21( أعطى األزيثرومايسين أعلى فعالية عند Cmax و تناقصت الفعالية بتناقص التركيز و بالمرتبة الثانية جاء اللينكوميسين بنسبة )%15.4( عند Cmax و تناقصت الفعالية بالتراكيز األقل. أما الصادات األخرى فقد حر ضت على زيادة االلتصاق و أكبر زيادة كانت مع األوغمنتين عند )%14.4( Cmax و تناقص تأثيره بتناقص تركيزه حتى 1/8 الجدول )10( و الشكل )10( )%3( عند Cmax يوضحان ذلك: الجدول )10(: الفعالية المضادة لاللتصاق ضد اإلشريكية القولونية المقاومة للصادات الحيوية المستخدمة LIN CRX AUG CTR AZM Cmax \2 Cmax \4 Cmax \8 Cmax المجلد الرابع العدد التاسع جمادى األول 1434 آذار )مارس(

100 E.coli 2 120% 100% 80% 60% االلتصاق 40% 20% 4 -المناقشة :Discussion الشكل )10(: العالقة بين التراكيز المختلفة للصادات الحيوية و االلتصياق الجرثيومي فيي حالية اإلشريكية القولونية المقاومة للصادات المستخدمة أظهرت دراستنا قدرة جميع الجراثيم الهوائية المدروسة على تشكيل بيوفيلم جرثومي في الزجاج وهذا يشير إلى إمكانية تشكيلها للبيوفيلم ضمن نسج اللوزتين. و قد توافقت هذه النتيجة مع عدة دراسات عالمية ) ( أشارت إلى قدرة الجراثيم المعزولة من لب اللوزتين على تشكيل البيوفيلم في الزجاج و في خبايا اللوزتين. أما بالنسبة لفعالية الصادات المضادة لاللتصاق الجرثومي فكانت نتائجنا كما يلي: - ايجابيات الغرام أظهرت نتائجنا أن كال من األزيثرومايسين و السيفترياكسون لهما فعالية جيدة مضادة لاللتصاق تالهما و بدرجة أقل األوغمنتين في حين أن اللينكومايسين سبب زيادة في االلتصاق الجرثومي.أما السيفروكسيم فقد تباينت فعاليته حيث أعطى مع الذرية الحساسة له تأثيرا مضادا لاللتصاق بينما ساهم في زيادة االلتصاق مع الذرية المقاومة له و ذلك كان م الحظا أيضا مع الصادات األخرى بالتراكيز المنخفضة. و ت عزى الفعالية الجيدة نسبيا لكل من األزيثرومايسين و السيفترياكسون إلى كونها من الصادات ذات التأثير المثبط لنظام اإلشارة الخاص بين الخاليا باإلضافة إلى فعاليتها الجيدة على األشكال الحرة ( ). أما أن بعض الصادات وبالتراكيز المنخفضة أو عندما تكون غير فعالة على الجرثوم فإنها تزيد االلتصاق فذلك يفسر أن استخدام الصادات بجرعات غير كافية تكون من األسباب الرئيسية لحدوث حاالت النكس في التهاب اللوزتين 8 المتكرر 6( )21. أما تأثير اللينكوماسين على زيادة االلتصاق في المكورات العنقودية و العقدية فيفسر بكونه صاد ذو فعالية قليلة على المكورات العنقودية و العقدية بشكلها الحر ال و بالتالي يستطيع استئصالها بل على العكس يعرضها إلى شدة stress تؤدي بها إلى زيادة االلتصاق كآلية لحماية نفسها كما أنه لم ت شر أي دراسة إلى تأثير اللينكوميسين على نظام اإلشارة الخاص بين الخاليا. - الكلبسيله الرئوية و اإلشريكية القولونية: أظهرت دراستنا أن أعلى فعالية مضادة اللتصاق الكلبسيله الرئوية و اإلشريكية القولونية كانت للسيفترياكسون بالتراكيز العالية فقط. 0% Cmax 1\2 Cmax 1\4 Cmax 1\8 Cmax AZM 78% 81% 88% 1% CTR 108% 108% 103% 103% AUG 114% 110% 106% 103% CRX 104% 105% 112% 106% LIN 85% 89% 96% 96% التركيز و األزيثرومايسين أي تأثير مهم في حين لم ي بد كل من األوغمنتين أما اللينكوميسين المجلد الرابع العدد التاسع جمادى األول 1434 آذار )مارس(

101 المجلة العربية للعلوم الصيدلية- مجلة اتحاد الجامعات العربية Insight into biofilm-associated microbial life. J Mol Microbiol Biotechnol; 10(1): Branda S.S., et al. Biofilm: the matrix revisited. Trends Microbial; 13(1): Baroom A., et al. A dose response study of antibiotic resistance in Pseudomonas aeroginosa biofilm. Antimicrobial Agents Chemother; 44(3): Brook I., and Dohar J. Management of group A beta-haemolytic streptococcal pharyngotonsillitis in children. J Fam Pract; 55: S Capoor MR., et al. Resistance to erythromycin and rising penicillin MIC in Streptococcus pyogenes in India. Japanese J Infect Dis; 59: Chole R.A., and Faddis B.T. Anatomical evidence of microbial biofilm in tonsillar tissues: a possible mechanism to explain chronicity. Arch Otolaryngol Head Neck Surg; 129(6): Christensen GD., et al. Adherence of Coagulase-negative staphylococci to plastic tissue culture plates: quantitative model for the adherence of staphylococci to medical devices. J Clin Microbiol; 22: Costeron, J.W., et al. How bacteria stick. Sci Am; 223(1): Costeron J., et al. Bacterial Biofilm: a common cause of persistence infections. Science; 284(5418): Costerton W., et al. The application of biofilm science to the study and control of chronic bacterial infections. J Clin Invest.;112: Djordjevic D., et al. و السيفروكسيم فقد سببا تأثيرا سلبيا بزيادة االلتصاق بكل التراكيز. ويعزى السبب كون السيفترياكسون من الصادات ذات الفعالية الجيدة على الجراثيم سلبية الغرام وخاصة اإلشريكية القولونية وبالتالي فإن قدرته على استئصال جزء من أشكالها الحرة يقلل من عدد الخاليا الملتصقة كما و يتآزر ذلك مع تأثير السيفالوسبورينات المثبط اإلشارة الخاص بين الخاليا الملتصقة. لنظام و بشكل عام الحظنا أن كل الصادات الحيوية المدروسة ال تؤدي إلى إنقاص االلتصاق بشكل كامل بل يحصل تناقص متفاوت في معدل االلتصاق و ي عزى ذلك إلى أن االستئصال الكامل للجراثيم ضمن البيوفيلم يستلزم اعتماد مشاركات دوائية بين أكثر من صاد. 6- التوصيات و المقترحات: 1- يفضل أخذ رشفة aspiration من لب اللوزتين من أجل الزرع الجرثومي و إجراء اختبارات التحسس للجراثيم العزولة. 2- االلتزام بجرعات الصادات الحيوية الموصى بها. -7 المراجع References 1- Amorena B., et al. Antibiotic susceptibility assay for Staphylococcus aureus in biofilms developed in vitro. J. Antimicrob Chemother. 44: Anderal J.N., et al. Role of antibiotic penetration limitation in Klebsiella pneumonia biofilm resistance to ampicillin and ciprofloxacin. Antimicrob Agents Chemother; 44(7): Anderal J.N., et al. Role of nutrient limitation and stationary phase existence in Klebsiella pneumonia biofilm resistance to ampicillin and ciprofloxacin. Antimicrob Agents Chemother; 47(4): Bhinu V.S. المجلد الرابع العدد التاسع جمادى األول 1434 آذار )مارس(

102 Microtiter plate assay for assessment of Listeria monocytogenes biofilm formation. Appl Environ Microbiol.; 68: Donlan RM. Role of biofilms in antimicrobial resistance. ASAIO J. 46;S47 S Donlan R.M., and Costeron J.W. Biofilm: survival mechanism of clinically of relevant microorganism. Clin Microbial Rev; 15(2): Flemming H C., et al. Physico-chemical properties of biofilms. In: Evans LV, editor. Biofilms: recent advances in their study and control. Amsterdam: Harwood Academic Publishers; Galli J., et al. Biofilm formation by Haemophilus influenzae isolated from adeno- tonsil tissue samples, and its role in recurrent adenotonsillitis. Acta Otorhinolaryngol Ital; 27(3): Gilbert P., et al. Biofilms in vitro and in vivo: do singular mechanisms imply cross-resistance?. J. Appl. Microbiol. 92, S98 S Hall-Stoodley L., et al. Bacterial biofilm: from the nature environment to infectious diseases. Nat Rev Microbial; 2(2): Hajdu S., et al. Effects of vancomycin, daptomycin, fosfomycin, tigecycline and ceftriaxone on Staphylococcus epidermidis biofilms. J. Orthop. Res. doi: 24 April; /jor Heydorn A., et al. Quantification of biofilm structure by the novel computer program COMSTAT. Microbiology; 146(10): Hoffmann N., et al. Azithromycin blocks quorum sensing and alginate polymer formation and increases the sensitivity to serum and stationary-growthphase killing of Pseudomonas aeroginosa and attenuates chronic P.; Antimicrob Agents Chemother. 51: Jafferson K.K. What drives bacteria to produce a biofilm? FEMS Microbial Lett; 236(2): Judith H., et al. Growing and Analyzing Static Biofilms. Current Protocols in Microbiology. 1B.1.1-1B Karen I., et al. Persisters cells and tolerance to antibiotic. FEMS Microbiol Lett; 230(1): Kania R.E., et al. Characterization of mucosal biofilm on human adenoid tissues. Laryngoscope; 118(1) : Kania R.E., et al. Demonstration of bacterial cells and glycocalyx in biofilms on human tonsils. Arch Otolaryngol Head Neck Surg; 133(2): Kaplan JB., et al. Enzymatic detachment of Staphylococcus epidermidis biofilms. Antimicrob Agents Chemother; 48: Kim S., Lee NY. Epidemiology and Antibiotic Resistance of Group A Streptococcus Isolated from Healthy School Children in Korea. J Antimicrob Chemother; 54: Kober D.R., et al. Growth of microorganism on surfaces in Microbial Biofilm. Cambridge, UK: Cambridge Univ.Press Konig C., et al. Factors compromising antibiotic activity against biofilm of Staphylococcus epidermidis. Eur J Clin Microbiol Infect Dis; 20(1): Kuhn S M., et al. Evaluation of potential factors contributing to microbiological treatment failure in المجلد الرابع العدد التاسع جمادى األول 1434 آذار )مارس(

103 المجلة العربية للعلوم الصيدلية- مجلة اتحاد الجامعات العربية 44- Osterlund A., et al. Intracellular reservoir of Streptococcus pyogenes in vivo: a possible explanation for recurrent pharyngotonsillitis. Laryngoscope; 107: O Toole G. A., et al. Biofilm formation as microbial development. Annu Rev Microbiol 54: Parsek MR., et al. Bacterial biofilms: an emerging link to disease pathogenesis. Annu Rev Microbiol. 57: Performance standard for antimicrobial susceptibility testing; NCCLS global informational supplement WHO: Vol. 22 No. 1 P.: Prince A. S. Biofilm and antimicrobial resistance in airway infections. N. Engl. J. Med. 347: Roberts M. E., Stewart P. S. Modeling protection from antimicrobial agents in biofilms through the formation of persisters cells. Microbiology, 151, Saginur R, et al. Multiple combination bactericidal testing of staphylococcal biofilms from implantassociated infections. Antimicrob Agents Chemother, 50: Schultz MJ. Macrolide activities beyond their antimicrobial effects: macrolides in diffuse panbronchiolitis and cystic fibrosis. J Antimicrob Chemother, 54: Stewart P.S. Mechanisms of Antibiotic resistance in bacterial biofilm. Int J Med Microbiol; 292 (2): Sutherland I. W. Biofilm exopolysaccharides: a strong and sticky framework. Microbiology; 147: Sutherland I. Streptococcus pyogenes pharyngitis. Can. J. Infect. Dis. 12: Lasa I. Towards the identification of the common features of bacterial biofilm development. Int Microbial; 9(1): Leriche V., et al. Use of an enzyme-linked lectinsorbent assay to monitor the shift in polysaccharide composition in bacterial biofilms. Appl Environ Microbiol; 66: Lewandowski Z. Structure and function of biofilms. In: Evans LV, editor. Biofilms: recent advances in their study and control. Amsterdam: Harwood Academic Publishers; Lewis K. Riddle of biofilm resistance. Antimicrob. Agents Chemother. 45: Lewis K. Persisters cells and the riddle of biofilm survival. Biochemistry (Mosc);70(2): Luppens S B., et al. Development of a standard test to assess the resistance of Staphylococcus aureus biofilm cells to disinfectants, Appl. Environ. Microbiol. 68, Mah T. F., O Toole G. A. Mechanisms of biofilm resistance to antimicrobial agents. Trends Microbiol. 9, Morris D.P., and Hager A. Biofilm: why the sudden interest? J Otolaryngol; 34(2): S National Committee For Clinical Laboratory Standards. Performance Standards For Antimicrobial Disk Susceptibility testing, 4ed, M2-A4, NCCL, Villanova, PA,USA, Olson M,. et al. Biofilm bacteria: formation and comparative susceptibility to antibiotics. Can. J. Vet. Res. 66: المجلد الرابع العدد التاسع جمادى األول 1434 آذار )مارس(

104 metabolic activity to tolerance of Pseudomonas aeroginosa biofilm to ciprofloxacin and tobramycin. Antimicrob Agents Chemother; 47(1): W. The biofilm matrix an immobilized but dynamic microbial environment. Trends Microbial; 9 (5): Walter M.C., et al. Contribution of antibiotic penetration, oxygen limitation, and low growth rate, المجلد الرابع العدد التاسع جمادى األول 1434 آذار )مارس(

105 المجلة العربية للعلوم الصيدلية- مجلة اتحاد الجامعات العربية دراسة ثباتية فيتامين C في بعض أغذية األطفال A Study for Vitamin C Stability in some kinds of Baby Food الملخص Abstract منال ديب و ميسم سالمي قسم الكيمياء التحليلية والغذائية- كلية الصيدلة جامعة دمشق سورية نظرا لألهمية الحيوية لفيتامين C وقابليته الكبيرة للتخرب أجريت الدراسة لتحديد مستوى فيتامين C في 152 عينة من ثالثة منتجات غذائية من أغذية األطفال )األغذية الرطبة و األغذية الجافة وبعض العصائر(. تمت مقايسة فيتامين C بواقع ثالثة مكررات باستخدام طريقة الكروماتوغرافيا السائلة عالية األداء و باستخدام عمود الفصل C18 ومتحري األشعة فوق البنفسجية وتمت مقارنة النتائج مع التراكيز المصرح عنها في بطاقة البيان. كما تمت دراسة ثباتية فيتامين C في العينات المختلفة بإخضاعها لشروط فحوص الثبات المسرعة وطويلة األمد. و دراسة ثباتية فيتامين C في بعض عينات العصائر واألغذية الرطبة بعد فتحها وحفظها في شروط حفظ نظامية) 4 م(. بينت النتائج صدق المصرح عنه في بطاقة البيان بالنسبة لمختلف العينات باستثناء بعض العينات التي أظهرت إما زيادة أو نقصان في تراكيز فيتامين C وبينت دراسات الثبات المسرعة أن نسبة الفقد من فيتامين C تزداد بارتفاع درجات الحرارة والفقد األكبر لفيتامين C كان عند حفظ العينات بدرجة حرارة ± 40 2 م و كانت نسبة الفقد من فيتامين C تزداد بتعريض العينات لضوء الشمس عند نفس درجة الحرارة 25 ± 2 م كما تبين أن محتوى العينات من فيتامين C يتناقص تحت تأثير عامل الزمن لدى تخزينها في الشروط النظامية ) 4 م( ويتناقص محتوى عينات العصائر الجاهزة والمحضرة منزليا واألغذية الرطبة من فيتامين C بشكل كبير لدى فتح العبوة وتخزينها في الشروط النظامية 4 م(. Due to the biological importance of vitamin C and the high ability of degradation, vitamin C content was studied on 152 samples of three baby food products (wet food, dry food, some fruit juices). The vitamin C composition of all samples was determined in triplicate, using the method of High Performance Liquid Chromatography HPLC (C18 Colum and UV-Detector) and the results were compared with the concentrations which are mentioned on the label of the samples. Vitamin C stability was studied in different samples by exposing them to the accelerated and long duration stability tests conditions.in addition to the study of vitamin C stability in different kinds of fruit juices and wet baby food after opening the samples and preserving them in normal conditions (4 c).the results showed that the concentrations which are mentioned on the label of different samples were true except some of them which showed either increase or decrease in the concentration of vitamin C. And the accelerated stability studies showed that the Vitamin C content declined when the temperature increased and the largest lost was when the samples exposed to the temperature of (40 ± 2 c), and this content of vitamin C declined when the samples exposed to the sun light at the same temperature (25 ± 2 c). And the results showed that Vitamin C content in the samples declined and affected by the time factor when the samples were preserved in the normal conditions (4 c), and this content in the stored and handmade fruit juices and wet baby food declined in large percentage after opening these samples and preserving them in normal conditions (4 c). الكلمات المفتاح : Key words فيتامين ث vitamin C أغذية األطفال HPLC High Performance baby food accelerated and long duration stability دراسة الثبات المسرعة وطويلة األمد Liquid Chromatography.Degradation تخرب stability ثباتية conditions المجلد الرابع العدد التاسع جمادى األول 1434 آذار )مارس(

106 فيتامين C عرضة بشكل كبير لألكسدة واألنزيمية )5( والكيميائية )6( خالل عمليات التحضير. تأثير بعض العوامل في تفاعالت تفكك الفيتامين : C تتأثر تفاعالت تفكك فيتامين C بالعديد من العوامل مثل: الضوء األكسجين المعادن الماء درجة الحرارة وتأثير درجة ال )7(. ph )8( ونظرا لألهمية الحيوية الكبيرة لفيتامين C وقابليته الكبيرة للتخرب نظرا لحساسيته الشديدة للضوء والحرارة هدف هذا البحث إلى دراسة محتوى بعض أغذية األطفال من فيتامين C وبعض العوامل المؤثرة في تخربه. المقدمة Introduction يعد فيتامين C ذو أهمية كبيرة للجسم ويؤدي نقصه لجملة من االضطرابات وبشكل خاص مرض األسقربوط و ضعف مناعة الجسم. البنية الكيميائية: يستخدم مصطلح فيتامين C للداللة على جميع المركبات التي لها نفس الفاعلية الحيوية لفيتامين )1(. C المركب الطبيعي األساسي الذي له نفس فعالية فيتامين C هو L-Ascorbic Acid والذي له الصيغة المجملة.MW ووزنه الجزيئي = C6H8O6 الدور الحيوي: C فيتامين مادة مرجعة ووسيط ضروري في االستقالب الخلوي ويعمل كناقل للهيدروجين في التنفس الخلوي وله وظائف حيوية هامة )2( الكوالجين-اصطناع النوربنفرين ندرجها فيما يلي :اصطناع األسكوربات تلعب دورا هاما في استقالب الفينيل االنين والتيروزين واصطناع الكارتينين األسكوربات ضروري من أجل الخطوات الثالث األخيرة في اصطناع األلدوستيرون- استقالب الحديد: حيث يقوم الفيتامين C بعدد من العمليات الكيميائية لتحويل مركبات الحديد الموجودة في األغذية من مركبات غير قابلة لالمتصاص إلى مركبات قابلة لالمتصاص في األمعاء وهو ضروري إلنتاج خاليا الدم الحمراء والهيموغلوبين وبفقدانه تنشأ فاقة الدم الغذائية باإلضافة إلى الدور الهام المضاد لألكسدة لفيتامين C حيث يخلص الجسم من الجذور الحرة ويحمي الخاليا من الضرر الناتج عن المؤكسدات. الخصائص الكيميائية: يكون فيتامين C ثابتا عندما تحفظ بلوراته الجافة بمعزل عن الضوء والهواء والحرارة والرطوبة )3( وكذلك عندما يكون مذابا في وسط حمضي ولكنه سهل التخرب في الوسط القلوي وال سيما عند تعرضه للحرارة والضوء والهواء و يسهل تأكسده بوجود أمالح المعادن الثقيلة حيث يشكل معها أمالح تدعى أسكوربات هذه المعادن )4(. المواد والطرائق :Materials and Methods 1 -طرائق االعتيان :Sampling Methods شملت الدراسة ثالثة منتجات : )1 أغذية األطفال الرطبة: تم اختيار سبعة أنواع مختلفة تابعة لشركة محلية واحدة وتم ترميزها على الشكل التالي:.)CF-AP-AB-AK-PE-BA-PO( )2 أغذية األطفال الجافة: كانت العينات من أربعة أنواع مختلفة تابعة لشركة محلية واحدة وتم ترميزها على الشكل التالي:.)WM-WMH-WMF-WMB( 3( العصائر: كانت عينات العصائر من خمسة عشر نوعا مختلفا وعائدة لخمس شركات مختلفة رمزت على الشكل التالي: O1-O1C1-M1-O2-O2C2-M2-( -تنشيط الهرمونات- C2F2-L3-M3-O3-O3C3-O4-O4C4-O5-.)O5C5 جميع عينات األغذية الخاصة باألطفال وعددها 152 عينة أخذت بطريقة االعتيان المنتظم ( عينات النوع الواحد من الطبخة ذاتها ( على الشكل التالي: عينة من األغذية 64 الرطبة و 12 عينة من األغذية الجافة في حين أخذت 76 عينة من العصائر. ولدراسة الثبات طويلة األمد تم اختيار 52 عينة عائدة لنوعين من العصير ونوعين من األغذية الرطبة وحفظت المجلد الرابع العدد التاسع جمادى األول 1434 آذار )مارس(

107 م م ت- المجلة العربية للعلوم الصيدلية- مجلة اتحاد الجامعات العربية 2( مقايسة فيتامين C: 3( األجهزة المستخدمة:. حمام أمواج فوق صوتيةUltrasonic HPLC جهاز كروماتوغرافيا سائلة عالية األداء األلمانية KNAUER Smart Line من انتاج شركة وفق شروط العمل حسب )9( )10( KNAUER من انتاج شركة C18 عمود فصل األلمانية بقطر داخلي 4.6 مم وأبعاد جزيئات 5 ميكرولتر وبطول 250 مم الطور المتحرك: %0.2 حمض ميتافوسفوريك يرشح بمضخة سارتيريوس. سرعة التدفق: 1 مل/ دقيقة. درجة حرارة ثابتة ومساوية ل 35 م. وتم الكشف باستخدام متحري األشعة فوق البنفسجية 243 الموجة المستخدم طول :UV Detector 2500 نانومتر. )11( المحاليل والمواد المستخدمة: SIGMA من انتاج شركة HPLC ماء معد لل.Aldrich C للفيتامين stock solution عياري محلول أم :1000PPM يحضر بحل 0.1 غ من فيتامين C النقي ) )PANREAC من إنتاج شركة L-Ascorbic Acid في 100 مل من محلول حمض ميتافوسفوريك % PPM C: محلول عياري بنت ممدد للفيتامين Meta- Phosphoric حمض ميتافوسفوريك ( %0.2.)PANREAC من إنتاج شركة Acid النتائج والمناقشة : Results and Discussion بدرجة الحرارة 4 م و قد جرى االعتيان شهريا لمدة عام كامل. أما دراسة الثبات المسرعة فتمت على 60 عينة عائدة لنفس األنواع المدرجة في دراسة الثبات طويلة األمد تم حفظ قسم منها بدرجات حرارة توافق درجات الحرارة العظمى خالل العشر سنوات الماضية ) م( بعد اللجوء إلى الجداول الحرارية الخاصة بمراكز األرصاد الجوية أي بدرجة حرارة 2 42± وتعد هذه الحرارة من شروط الحفظ السيئة في المحال التجارية في فصل الصيف وتم االعتيان شهريا لمدة أربعة أشهر. والقسم األخر من العينات الخاصة بدراسة الثبات المسرعة وزع إلى مجموعتين متساويتين حفظت على الشكل التالي: 1 حديد محتوى العينات المدروسة من فيتامين C: 1 -عينات 1. األغذية الرطبة: يبين الجدول )1( والشكل )1( نتائج مقايسة فيتامين C في عينات األغذية الرطبة ومقارنتها مع التراكيز المصرح عنها في بطاقة البيان: 1- قسم من العينات حفظ في درجة حرارة الغرفة 25 بعيدا عن ضوء الشمس المباشر وتعد من شروط الحفظ الجيدة في المحال التجارية. 2- والقسم األخر حفظ في درجة حرارة الغرفة 25 م مع تعريضها لضوء الشمس المباشر والتي تعد من شروط الحفظ السيئة عندما تعرض هذه المنتجات في المحال التجارية على الواجهة األمامية معرضة لضوء الشمس المباشر. وكانت فواصل االعتيان لكال المجموعتين شهريا لمدة أربعة أشهر. ولدراسة تأثير األكسجين على ثباتية فيتامين C: اختيرت 6 عينات من أربعة أنواع من المنتجات )منها األغذية الرطبة ومنها العصائر: الجاهزة والمحضرة منزليا ( وتم فتح العبوات بحيث تتعرض ألكسجين الهواء و تخزينها في درجة حرارة 4 م وتمت الدراسة خالل أسبوع وبفاصل زمني يوم واحد فقط. 2 -الطرائق التحليلية واألجهزة المستخدمة : 1( االستخالص: تم بأخذ العينة وإضافة خميرة الديستاز والماء إليها ثم التحريك بمحرك مغناطيسي وأضيف بعد ذلك محلول حمض ميتا فوسفوريك )2 %( )3( ثم رشحت العينة بمراشح خاصة بال HPLC من نوع.( µm 0.45 )أبعادها ALBET المجلد الرابع العدد التاسع جمادى األول 1434 آذار )مارس(

108 التركيز PPM الجدول )1(: مقارنة التراكيز الفعلية لفيتامين C مع التراكيز المصرح عنها في عينات األغذية الرطبة المختلفة. نوع العينة الشركة المنتجة التركيز الفعلي PPM التركيز المصرح عنه PPM PL CF PL AP PL AB PL AK PL PE PL BA PL PO التركيز المصرح عنه PPM التركيز الفعلي PPM CF AP AB AK PE BA PO عينات األغذية الرطبة الشكل رقم )1 (: نتائج مقايسة محتوى عينات األغذية الرطبة من فيتامين C. 3- أبدت العينة المأخوذة من المنتج AP تناقص في تركيز فيتامين C بنسبة %32 عن التركيز المصرح عنه في العبوة. 2 -عينات 1. األغذية الجافة: يبين الجدول )2( والشكل )2( نتائج مقايسة فيتامين C في عينات األغذية الجافة ومقارنتها مع التراكيز المصرح عنها في بطاقة البيان: من الشكل السابق نخلص إلى ما يلي: 1- كانت تراكيز فيتامين C في أغلب العينات متقاربة مع التراكيز المصرح عنها في العبوات التجارية. 2- أبدت العينة المأخوذة من المنتج CF زيادة واضحة في تركيز فيتامين C بنسبة %28.5 عن التركيز المصرح عنه في العبوة. المجلد الرابع العدد التاسع جمادى األول 1434 آذار )مارس(

109 PPM المجلة العربية للعلوم الصيدلية- مجلة اتحاد الجامعات العربية الجدول )2(: مقارنة التراكيز الفعلية لفيتامين C مع التراكيز المصرح عنها في عينات األغذية الجافة نوع العينة الشركة المنتجة التركيز الفعلي PPM التركيز المصرح عنه PPM NE WM NE WMH NE WMF NE WMB التركيز المصرح عنه PPM التركيز الفعلي PPM WM WMH WMF WMB عينات األغذية الجافة الشكل رقم )2(: نتائج مقايسة محتوى عينات األغذية الجافة من فيتامين C. توضح النتائج السابقة: 1- وجود تقارب ما بين تراكيز فيتامين C في العينات المدروسة والتراكيز المصرح عنها في العبوات المختلفة. 2- أبدت العينة المأخوذة من المنتج WM زيادة في تركيز فيتامين C بنسبة % أبدت العينة المأخوذة من المنتج WMH زيادة في تركيز فيتامين C بنسبة 8.75%. 3 -عينات 1. العصائر: تظهر النتائج المبينة في الجدول )3( والشكل )3( التراكيز الناتجة عن مقايسة فيتامين C في عينات العصائر مقارنة مع التراكيز المصرح عنها في بطاقة البيان: المجلد الرابع العدد التاسع جمادى األول 1434 آذار )مارس(

110 PPM الجدول )3(: مقارنة التراكيز الفعلية لفيتامين C مع التراكيز المصرح عنها في عينات العصائر المختلفة نوع العينة الشركة المنتجة PPMالتركيز االفعلي PPMالتركيز المصرح عنه A O A O1C A M B O B O2C B M B C2F C L C M C O C O3C D O D O4C E O E O5C التركيز المصرح عنه PPM التركيز الفعلي PPM O1 O1C1 M1 O2 O2C2 M2 C2F2 L3 M3 O3 O3C3 O4 O4C4 O5 O5C5 عينات العصائر الشكل رقم )3(: نتائج مقايسة محتوى عينات العصائر من فيتامين C المجلد الرابع العدد التاسع جمادى األول 1434 آذار )مارس(

111 المجلة العربية للعلوم الصيدلية- مجلة اتحاد الجامعات العربية توضح النتائج السابقة وجود تقارب ما بين تراكيز فيتامين C في العينات المدروسة والتراكيز المصرح عنها في العبوات يستثنى من ذلك العينات المأخوذة من الشركة D لكال المنتجين,O4 O4C4 حيث أبدت هذه العينات تناقص في تراكيز فيتامين C: O4 أبدت تناقص بنسبة %25 O4C4 أبدت تناقص بنسبة %24,67 وأبدت العينة O5 من إنتاج الشركة E تناقص بنسبة.% لدى دراسة محتوى العينات المختلفة )األغذية الرطبة والجافة والعصائر( من فيتامين C ومقارنتها بالتراكيز المصرح عنها تبين تقارب النتائج التي حصلنا عليها مع نتائج الدراسة التي نشرت من قبل Dr.Barbara Thomson في أيلول عام )12( وتناولت تقييم تراكيز فيتامين C في عدد من األغذية المختلفة لمقارنة التراكيز الفعلية مع التراكيز المصرح عنها في بطاقة البيان وقد شملت الدراسة مختلفة: أغذية األطفال االفطار(- الدراسة العصائر 225 الشرابات عينة من أنواع أغذية األغذية الجافة )حبوب و أوضحت وجود تقارب ما بين تراكيز فيتامين C نتائج في العينات المدروسة والتراكيز المصرح عنها في العبوات باستثناء بعض العينات التي أبدت إما تناقص أو تزايد في تراكيز فيتامين C عن التراكيز المصرح عنها في بطاقة البيان. -2 المسرعة: 1.2 دراسة الثبات طويلة األمد ودراسة الثبات - مقارنة نتائج محتوى عينات العصائر من فيتامين C ضمن دراسات الثبات المسرعة وطويلة األمد: يظهر الجدول رقم )5( النسبة المئوية لمحتوى عينات العصائر من فيتامين C مختلفة مقارنة مع الزمن 0. بعد تعرضها لشروط تخزين الجدول رقم )5(: النسبة المئوية لمحتوى عينات العصائر من فيتامين C بعد تعرضها لشروط تخزين مختلفة مقارنة مع الزمن 0 الزمن دراسة الثبات طويلة األمد المنتجO1 دراسة الثبات المسرعة )حرارة 2 ±25 م بدون ضوء( دراسة الثبات المسرعة )حرارة 2 ±25 م مع تعريضها للضوء( دراسة الثبات المسرعة )حرارة 2 ±40 م( المنتج O1C1 المنتجO1 المنتجO1 المنتج O1C1 المنتجO1 المنتج O1C1 المنتج O1C1 %100 %100 %100 %100 %100 %100 %100 %100 0 %62.22 %59.37 %85.18 %83.75 %92.59 %96.87 %98.50 الشهر األول %99.68 %48.14 %52.50 %73.33 %73.12 %88.88 %93.75 %96.50 الشهر الثاني %99.37 %38.51 %45 %65.92 %64.37 %85.92 %90 %94.81 الشهر الثالث %98.75 %31.85 %37.50 %57 %56.25 %81.48 %86.25 %93.33 الشهر الرابع %97.50 حفظ العينات بدرجة حرارة 2±40 م وكانت النسبة يالحظ من الجدول السابق: المئوية المتبقية من فيتامين C تكاد تكون متقاربة بين 1- تأثير درجة الحرارة: إن تناقص فيتامين C في عينات العينات ولكنها تختلف باختالف نوع العصير بعد أربعة العصائر خالل دراسات الثبات المسرعة يزداد بارتفاع أشهر من الدراسة: درجات الحرارة وأن التناقص األكبر لفيتامين C كان عند 111 المجلد الرابع العدد التاسع جمادى األول 1434 آذار )مارس( 2013

112 م 2 1- في درجة الحرارة 40 م: النسبة المتبقية كانت %37.5 في عينة العصير O1 )عصير برتقال( و %85.31 في عينة العصير O1C1 )عصير برتقال وجزر(. 2- في درجة الحرارة 25 م: النسبة المتبقية كانت %86.25 في عينة العصير O1 و %81.48 في عينة العصيرO1C1. 2- تأثير الضوء: إن تناقص فيتامين C في عينات العصائر خالل دراسات الثبات المسرعة يزداد عند تعريضها بنفس درجة الحرارة 25 م± لضوء الشمس وان النسبة المئوية المتبقية من فيتامين C كانت متقاربة مع اختالف نوع العصير بعد أربعة أشهر من الدراسة )%56.25 في عينة العصير O1 و %57 في عينة العصير.)O1C1 3 -خالل دراسات الثبات طويلة األمد عند حفظها في درجة الحرارة 4 م: محتوى عينات العصائر من فيتامين C يتناقص تحت تأثير عامل الزمن وأن النسبة المئوية المتبقية تكاد تكون متقاربة أيضا ولكنها تختلف باختالف نوع العصير) %97.5 في عينة العصير O1 و %93.33 في عينة العصير.)O1C1 - لدى دراسة محتوى عينات العصائر من فيتامين C خالل دراسات الثبات المسرعة وطويلة األمد تحت تأثير كل من الزمن والحرارة والضوء تبين تقارب النتائج التي حصلنا عليها مع: نتائج الدراسة التي نشرت من قبل I.Klimezak, M.Matecka, M.Szlachta, A.Gliszczynska Swiglo.عام.)13( 2007 حول تأثير عاملي الحرارة والزمن في محتوى عصائر البرتقال التجارية من فيتامين C وأكدت الدراسة أن تناقص فيتامين C في عينات العصائر يزداد مع ارتفاع درجات الحرارة. كما جاءت النتائج متقاربة مع نتائج الدراسة التي نشرت من قبل J.A.Zee D.Poirier, M.Fournier,D.Codere,,L.Carmichael عام )14( 1991 التي درست تأثير عاملي الحرارة والضوء في محتوى بعض الفواكه والخضروات من فيتامين C وأكدت الدراسة أن محتوى العينات المختلفة من فيتامين C يتناقص مع ارتفاع درجات الحرارة وتعريض العينات للضوء مقارنة نتائج محتوى عينات األغذية الرطبة من فيتامين C خالل دراسات الثبات المسرعة وطويلة األمد: الزمن الجدول رقم )6( : النسبة المئوية لمحتوى عينات األغذية الرطبة من فيتامين C بعد تعرضها لشروط تخزين مختلفة مقارنة مع الزمن 0 دراسة الثبات طويلة األمد دراسة الثبات المسرعة )حرارة 25 م+ 2 م بدون ضوء( دراسة الثبات المسرعة )حرارة 25 م+ 2 م مع تعريضها للضوء( دراسة الثبات المسرعة )حرارة 40 م+ 2 م( المنتجAP المنتجCF المنتجAP المنتجCF المنتجAP المنتجCF المنتجAP المنتجCF % % % % % % % % % 70.58% 90.18% 88.23% 96.50% 97.00% 99.17% الشهر األول 98.00% 60.46% 50.00% 82.23% 70.58% 93.60% 90.00% 97.68% الشهر الثاني 94.11% 41.40% 34.38% 70.94% 58.82% 90.62% 85.29% 96.57% الشهر الثالث 91.17% 32.31% 28.05% 63.88% 47.00% 86.17% 79.41% 94.71% الشهر الرابع 88.23% المجلد الرابع العدد التاسع جمادى األول 1434 آذار )مارس(

113 م م 2 م 4 المجلة العربية للعلوم الصيدلية- مجلة اتحاد الجامعات العربية يالحظ من الجدول السابق أن: 1- تأثير الحرارة: إن تناقص فيتامين C في عينات األغذية الرطبة يزداد خالل دراسات الثبات المسرعة بارتفاع درجات الحرارة وأن التناقص األكبر لفيتامين C كان عند حفظ العينات بدرجة حرارة 2±40 م أن النسبة تختلف باختالف نوع C المئوية المتبقية من فيتامين الغذاء الرطب بعد أربعة أشهر من الدراسة حيث أن النسبة المتبقية في المنتج CF كانت أعلى منها في المنتج :AP 40 م: النسبة المتبقية كانت في درجة الحرارة 1. )تفاح( AP %28.05 في عينة الغذاء الرطب )كوكتيل CF و %32.31 في عينة الغذاء الرطب فواكه(. 25 م: النسبة المتبقية كانت في درجة الحرارة 2. %79.41 في عينة الغذاء الرطب AP و %86.17 في عينة الغذاء الرطب.CF في عينات C تأثير الضوء: إن تناقص فيتامين 2- األغذية الرطبة خالل دراسات الثبات المسرعة يزداد عند تعريضها للضوء بنفس درجة الحرارة 25 م± وأن النسبة المئوية المتبقية من فيتامين C تختلف باختالف نوع الغذاء الرطب بعد أربعة أشهر من الدراسة عند تعريضها للضوء حيث أن النسبة المتبقية في المنتج CF كانت أعلى منها في المنتج :AP )%63.88 في عينة الغذاء الرطب CF و %47 في عينة الغذاء الرطب.)AP 3- خالل دراسة الثبات طويلة األمد عند حفظها في درجة الحرارة 4 م: إن محتوى عينات األغذية الرطبة من فيتامين C تناقص تحت تأثير عامل الزمن و اختلفت النسبة المتبقية أيضا باختالف نوع الغذاء الرطب وكانت أعلى أيضا في المنتج CF منها في المنتج AP )%94.71 في عينة الغذاء الرطب CF و %88.23 في عينة الغذاء الرطب.)AP ومن المالحظ أن النسبة المئوية المتبقية من فيتامين C في عينات الغذاء الرطب CF أعلى بشكل واضح من عينات الغذاء الرطب AP عند تعريضها لشروط تخزين مختلفة ويمكن أن يعزى هذا االختالف إلى غنى عينات الغذاء الرطب CF )كوكتيل فواكه( بالمركبات عديدات الفينول مقارنة بعينات ال AP )تفاح( والتي تلعب دور كمضاد تأكسد وبالتالي قد تزيد من ثباتية فيتامين C. 3- دراسة تأثير األكسجين في ثباتية فيتامين C: تمت دراسة تناقص تركيز فيتامين C في العينات بعد فتحها و تعريضها ألكسجين الهواء ثم حفظها في درجة حرارة 4 غذاء رطب عصير و تم ترميز العينات المدروسة كالتالي: ويوضح الجدول رقم )7( والشكل البياني رقم )5( نتائج دراسة محتوى وضعها العبوة. نوع المنتج عصير ليمون طبيعي محضر في المنزل عصير برتقال طبيعي محضر في المنزل العينات المختلفة في درجة حرارة رمز المنتج الشركة المنتجة من فيتامين C بعد PL A CF O1 L O محضر منزليا محضر منزليا خالل سبعة أيام من فتح المجلد الرابع العدد التاسع جمادى األول 1434 آذار )مارس(

114 الزمن 0 يوم يومين الجدول رقم )7(: النسبة المئوية لمحتوى العينات المختلفة من فيتامين C بعد وضعها في درجة حرارة 4 م خالل سبعة أيام من فتح العبوة. عينة العصير الجاهز O1 % %85.62 عينة عصير البرتقال الطبيعي O % %95.16 عينة عصير الليمون الطبيعي L % %94.20 عينة الغذاء الرطب CF % %82.70 %70.00 %57.14 %44.50 %31.80 %19.00 %9.28 %81.15 %72.10 %63.10 %49.60 %36.00 %27.00 %90.41 %80.28 %71.38 %57.00 %47.57 %33.33 %64.25 %53.50 %42.80 %32.12 %18.18 % أيام 4 أيام 5 أيام 6 أيام 7 أيام % 90.00% 80.00% 70.00% عينة العصير الجاهز O1 عينة عصير البرتقال الطبيعي O عينة عصير الليمون الطبيعي L عينة الغذاء الرطب CF 60.00% 50.00% 40.00% 30.00% 20.00% 10.00% 0.00% 7 أيام 6 أيام 5 أيام 4 أيام 3 أيام يومين يوم 0 الشكل رقم )5( النسبة المئوية لمحتوى العينات المختلفة من فيتامين C بعد وضعها في درجة حرارة 4 م خالل سبعة أيام من فتح العبوة يالحظ من الجدول السابق: تأثير األكسجين: إن تركيز فيتامين C في عينات األغذية الرطبة والعصائر يتناقص بشكل كبير بعد فتح العينات وتعريضها ألكسجين الهواء و أن النسب المتبقية في هذه العينات يختلف حسب نوع العينة حيث أظهرت النتائج: المجلد الرابع العدد التاسع جمادى األول 1434 آذار )مارس(