Agarose Gel Electrophoresis هالم الرحالن )الفصل( الكهربائي
Gel electrophoresis is a widely used technique for the analysis of nucleic acids and proteins. Agarose gel electrophoresis is routinely used for the preparation and analysis of DNA هالم الرحالن الكهربائي هو أحد التقنيات واسعة اإلستخدام لتحليل األحماض النووية والبروتين تستخدم هذه التقنية بشكل روتيني لتحضير وتحليل الدنا Gel electrophoresis is a procedure that separates molecules on the basis of their rate of movement through a gel under the influence of an electrical field هذه التقنية هي عملية لفصل الجزيئات على قاعدة معدل تحركها عبر الجل تحت تأثير الحقل الكهربائي
We will be using agarose gel electrophoresis to determine the presence and size of PCR products. PCR products indicate the presence of DNA يستخدم هالم الرحالن الكهربائي لتحديد وجود وحجم منتج اإلسترداد أو البلمرة )PCR( حيث أن وجود منتج البلمرة أواإلسترداد يعني وجود الدنا
DNA is negatively charged يحمل الدنا شحنات كهربائية سالبة When placed in an electrical field, DNA will migrate toward the positive pole (anode) عندما يوضع في حقل كهربائي فإن الدنا يهاجر نحو القطب الموجب )األنود ) H O 2 Power الطاقة - DNA + Polymerized agarose is porous, allowing for the movement of DNA يسمح مبلمر األقروز غير المسامي بحركة الدنا Scanning Electron Micrograph of Agarose Gel (1 1 µm)
How fast will the DNA migrate? بأي سرعة يهاجر الدنا Size of the DNA! حجم الدنا *Small DNA move faster than large DNA النا الصغير يتحرك أسرع من الدنا الكبير gel electrophoresis separates DNA according to size هالم الرحالن يفصل الدنا بحسب حجمها DNA - large small + Power Within an agarose gel, linear DNA migrate inversely proportional to the log10 of their molecular weight في الهالم يتحرك الدنا الخطي بمعدل عكسي الى لوغريثم وزنها الجزيئ
Agarose D-galactose 3,6-anhydro L-galactose Agarose was first used in biology when Robert Koch* used it as a culture medium for Tuberculosis bacteria in 1882 أ ستخدم األقاروز في األحياء الول مرة بواسطة روبرت كوخ كوسط مزرعي لبلكتريا الدرن سنة 1882 Agarose is a linear polymer extracted from seaweed األقاروز عبارة عن مبلمر خطي مستخرج من األعشاب البحرية
Making an Agarose Gel كيفية عمل هالم األقاروز
An agarose gel is prepared by combining agarose powder and a buffer solution ي حضر األقروز بخلط مسحوق القروز بمحلول البفر Buffer البفر Flask for boiling قارورة للغلي Agarose األقروز
Electrophoresis Equipment معدات الرحالن الكهربائي Power supply مصدر للطاقة Cover غطاء Gel tank وعاء الهالم Electrical leads وصالت كهربائية Casting tray صينية صب Gel combs أمشاط combs الهالم Gel
Gel casting tray & combs صينية الصب واألمشاط
Preparing the Casting Tray تحضير صينية الصب Seal the edges of the casting tray and put in the combs. Place the casting tray on a level surface. None of the gel combs should be touching the surface of the casting tray إلزق حواف صينية الصب ثم ضع األمشاط ضع صينية الصب على سطح مستوي. يجب اال يلتصق أي من أمشاط الهالم سطح صينية الصب
Agarose األقروز Buffer Solution محلول البفر Combine the agarose powder and buffer solution. Use a flask that is several times larger than the volume of buffer إمزج مسحوق األقروز بمحلول البفر إستخدم قارورة يكون حجمها أكبر من حجم البفر
Melting the Agarose تذويب األقروز Agarose is insoluble at room temperature (left) األقروز غير قابل للذوبان في درجة حرارة الغرفة )لليسار ) The agarose solution is boiled until clear (right) عند غلي محلول األقروز يصبح نقيا )لليمين( Gently swirl the solution periodically when heating to allow all the grains of agarose to dissolve لضمان تذويب كل حبوب األقروز يجب تحريك المحلول على فترات عند التسخين ***Be careful when boiling - the agarose solution may become superheated and may boil violently if it has been heated too long in a microwave oven يجب الحذر عند غلي القروز حيث أن التسخين الزائد قد يؤدي لغليان األقروز بعنف
Pouring the gel صب الهالم )الجل ) Allow the agarose solution to cool slightly (~60ºC) and then carefully pour the melted agarose solution into the casting tray. Avoid air bubbles أ ترك األقروز ليبرد قليال )60 درجة مئوية( ومن ثم صب األقروز الذائب في الصينية تفادي فقاعات الهواء
Each of the gel combs should be submerged in the melted agarose solution يجب أن تكون أمشاط الهالم مغمورة في محلول األقروز الذائب
When cooled, the agarose polymerizes, forming a flexible gel. It should appear lighter in color when completely cooled (30-45 minutes). Carefully remove the combs and tape عندما تبرد مبلمرات األقروز فإنها تكون هالم مرن ويجب أن يظهر بلون فاتح عندما تبرد تماما )45-30 درجة مئوية( أزل األمشاط والشريط بحذر
Place the gel in the electrophoresis chamber ضع الهالم في غرفة الرحالن
DNA الدنا buffer البفر Wells فتحات Cathode القطب السالب (negative ) Anode القطب المجب (positive) Add enough electrophoresis buffer to cover the gel to a depth of at least 1 mm. Make sure each well is filled with buffer. أضف مقدار كاف من البفر ليغطي الهالم لعمق 1 مم تأكد من أن كل الفتحات مليئة بالبفر
Sample Preparation تحضير العينة Mix the samples of DNA with the 6X sample loading buffer (w/ tracking dye). This allows the samples to be seen when loading onto the gel, and increases the density of the samples, causing them to sink into the gel wells أمزج عينة الدنا مع 6 أحجام من البفر الممزوجة بصبغة تتبع تسمح برؤية العينات في الهالم إضافة الى زيادة كثافة العينات وجعلها تغرق في فتحات الهالم 6X Loading Buffer: البفر Bromophenol Blue (for color) البروموفينول األزرق )للون( Glycerol (for weight) الجليسرول )للوزن(
Loading the Gel تحميل الهالم Carefully place the pipette tip over a well and gently expel the sample. The sample should sink into the well. Be careful not to puncture the gel with the pipette tip ضع طرف الماصة فوق الفتحة وبرفق فرغ العينة. يجب إغراق العينة في الفتحة يجب الحذر لعدم ثقب الهالم بطرف الماصة
Running the Gel تشغيل الهالم Place the cover on the electrophoresis chamber, connecting the electrical leads. Connect the electrical leads to the power supply. Be sure the leads are attached correctly - DNA migrates toward the anode (red). When the power is turned on, bubbles should form on the electrodes in the electrophoresis chamber ضع الغطاء على غرفة الرحالن صل الوصالت الكهربائية صل الوصالت مع مصدر التيار. يبدأ الدنا في الهجرة تجاه األنود )األحمر(. عند إيصال التيار فتتكون فقاعات في األقطاب في غرفة الرحالن
Cathode الكاثود (-) DNA (-) Wells الفتحات Bromophenol Blue البروموفينول األزرق Anode األنود (+) After the current is applied, make sure the Gel is running in the correct direction. Bromophenol blue will run in the same direction as the DNA بعد تمرير التيار تأكد من أن الهالم يجري في اإلتجاه الصحيح يجري البروموفينول األزرق في نفس إتجاه الدنا
DNA Ladder Standard الدر الدنا القياسي Note: bromophenol blue migrates at approximately the same rate as a 300 bp DNA molecule يالحظ أن البروموفينول األزرق يجري بمعدل يساوي 300 بيزبير من حجم الدنا bromophenol blue + DNA Migration هجرة الدنا 12,000 bp 5,000 2,000 1,650 1,000 850 650 500 400 300 200 100 Inclusion of a DNA ladder (DNAs of know sizes) on the gel makes it easy to determine the sizes of unknown DNAs إضافة الدر الدنا )دنا معروف الحجم( في الهالم يجعل تحديد حجم الدنا المجهول سهال
Staining the Gel تصبيغ الهالم Ethidium bromide binds to DNA and fluoresces under UV light, allowing the visualization of DNA on a Gel يرتبط بروميد اإليثيديوم مع الدنا ويتفلور تحت األشعة فوق البنفسجية وبالتالي يسمح برؤية الدنا في الهالم Ethidium bromide can be added to the gel and/or running buffer before the gel is run or the gel can be stained after it has run يمكن إضافة بروميد اإليثديوم الى الهالم و/أو البفر قبل جريان الهالم أو يمكن تصبيغ الهالم بعد الجريان
***CAUTION! Ethidium bromide is a powerful mutagen and is moderately toxic. Gloves should be worn at all times تحذير: يعتبر بروميد اإليثيديوم مادة مسرطنة قوية ومتوسط السمية. يجب لبس القفازات على الدوام
Safer alternatives to Ethidium Bromide من البدائل اآلمنة لبروميد اإليثيديوم Methylene Blue Bio-Safe DNA Stain الميثلين األزرق صبغة الدنا اآلمنة Ward s - QUIKView DNA Stain صبغة وارد-كويك فيو Carolina BLU Stain صبغة كارولينا الزرقاء
Disadvantages العيوب Less sensitive أقل حساسية More DNA needed on gel تتطلب المزيد من الدنا في الهالم Longer staining/destaining time تحتاج لوقت أطول للتصبيغ وإزالة الصبغة Advantages المزايا Inexpensive رخيصة Less toxic أقل سمية No UV light required ال تحتاج لألشعة فوق البنفسجية No hazardous waste disposal ال توجد مخاطر منها كنفايات
Staining the Gel تصبيغ الهالم Place the gel in the staining tray containing warm diluted stain ضع الهالم في صينية الصبغة التي تحتوي على الصبغة الدافئة المخففة Allow the gel to stain for 25-30 minutes دع الهالم ليصتبغ لحوالي 30-25 دقيقة To remove excess stain, allow the gel to destain in water ألزالة الصبغة الزائدة ضع الهالم في الماء Replace water several times for efficient destain لإلزالة التامة للصبغة الزائدة إستبدل الماء عدة مرات
Ethidium Bromide requires an ultraviolet light source to visualize يحتاج بروميد اإليثيديوم الى مصدرلألشعة فوق البنفسجية للرؤية
Visualizing the DNA (ethidium bromide) تصور الدنا )بروميد اإليثيديوم( Wells الفتحات DNA ladder الدر الدنا 1 2 3 4 5 6 7 8 DNA ladder الدر الدنا PCR Product منتج اإلسترداد 5,000 bp 2,000 1,650 1,000 850 650 500 400 300 200 100 + - - + - + + - Samples # 1, 4, 6 & 7 were positive for DNA العينات الموجبة للدنا )1 4 6 7(
Visualizing the DNA (QuikVIEW stain) تصور الدنا )صبغة كويك فيو ) Wells الفتحات DNA ladder الدر الدنا PCR Product منتج اإلستردا 2,000 bp 1,000 500 Samples # 1, 6, 7, 10 & 12 were positive for DNA العينات الموجبة )1 6 7 10 12(