ISSN: 0067-2904 GIF: 0.85 )Grapefruit( الفعل التثبيطي لمستخلصات الجريب فروت نبات على نمو وقابلية إلتصاق بكتريا Staphylococcus aureus ندى صباح 2 * رزوقي, وسن حاتم الجميلي, ورقاء يحيى المشهداني قسم علوم الحياة, كلية العلوم للبنات, جامعة بغداد, بغداد, الع ارق 2 معهد الهندسة الو ارثية والتقنيات األحيائية للد ارسات العليا, جامعة بغداد, بغداد, الع ارق الخالصة تم الحصول على عزالت تعود لبكتريا Staphylococcus من مسحات سريرية مختلفة أخذت من المرضى الم ارجعين الفحوصات المظهرية والكيموحيوية لتمييز لمستشفى ابن النفيس التعليمي ومختبر الصحة العامة المركزي من عدد,أعتمدت بكتريا. Sعن aureus األنواع البكتيرية األخرى وأظهرت النتائج أنها 8 عزالت وعند التحري عن قابليتها إلنتاج الطبقة اللزجة باستخدام طريقة اكار احمر الكونغو كانت العزلة SA5 ا فضلها في تكوين هذه الطبقة مقارنة ببقية العزالت من خالل ظهور مستعم ارتها بلون وردي ووسط اكار احمر الكونغو بلون اسود. وعند د ارسة الفعل التثبيطي لمستخلصات نبات الكريب فروت في نمو عزلة البكترياSA5S.aureus بينت النتائج ان المستخلص المائي لبذور نبات الجريب فروت وبت اركيزه المختلفة لم يظهر تأثير تثبيطي للنمو بينما وجد أن مستخلص العصير لهذا النبات كان ذو تأثير تثبيطي عند الت اركير) %7,%57,% ( وبمعدالت أقطار تثبيطية) 2 ملم, ملم, 8 ملم(على التوالي,في حين أظهر مستخلص البذور) GSE ) تأثير تثبيطي أقوى عند الت اركيز )%,,%57,%7 )%27 وبمعدالت أقطار بلغت ) 7 ملم, 2 ملم, 9 ملم, 5 ملم( على التوالي, كما تم اختبار قابلية التصاق العزلة البكتيرية SA5 على مادة الفوالذ المقاوم للصدأ حيث أظهرت النتائج أن عدد كبير من الخاليا البكتيرية المحضونة بوجود قطعة من مادة الفوالذ المقاوم للصدأ قد التصقت بسطح هذه المادة والذي كان بحدود 78 7 خلية / مل وهذه خلية / مل عند مثلت معاملة السيطرة في حين انخفض عدد الخاليا الملتصقة بسطح هذه المادة إلى 22 2 معاملتها بمستخلص البذور (GSE(. Grapefruit Seed Extract كلمات مفتاحية : مستخلصات نبات الكريب فروت, الفعل التثبيطي, بكتريا S. aureus Inhibitory Effect of Grapefruit Extracts on the Growth and Adhesion Ability of Staphylococcus aureus Nada S. Rzoqi *, Wasan H. Jumaili, Warka Y. Al-Mashhadani 2 Department of Biology, College of Science for women,university of Baghdad, Baghdad,Iraq 2 Institute of Genetic Engineering and Biotechnology Techniques for Graduate Studies,University of Baghdad, Baghdad,Iraq Abstract Ten isolates belong to the Staphylococcus bacteria from different clinical swabs were taken from patients in Ibn al-nafis Hospital and Central Public Health laboratory, according to many morphological and biochemical tests that used to identify bacterial species S. aureus, the results showed that 8 isolates when *Email: doctor_nada2003@yahoo.com 2499
investigated their ability to produce a slime layer using Congo red agar method the results showed that SA5 isolate was the best compared to other isolates through change the color of colonies to the pink and Congo red agar -colored Black. When examining the inhibitory effect of grapefruit extracts in the growth of isolated bacteria SA5 S.aureus, results showed that the aqueous extract of the seeds at different concentrations did not show any inhibitory effect on the bacterial growth while the juice extract of this plant had an effective antibacterial activity against SA5of S.aureus in different concentrations(50%,75%,00%) were the zones of inhibition reached (8 mm,0mm,2mm) respectively, while plant seeds extract had more effective antibacterial activity against SA5 S.aureus in different concentrations(25%,50%,75%,00%) were the zones of inhibition reached (7 mm,9mm,2mm,5mm) respectively; Also this study tested the adhesion ability of SA5 bacterial isolate on the stainless steel material where the results showed that a large number of bacterial cells up to 58 0 5 cells / ml adhered to the surface of stainless steel piece as the control, while the number of bacterial cells that adherent to the surface of this material decreased to24 0 4 cells/ ml when treated with GSE. Keywords: grapefruit extracts, inhibitory effect, bacteria S.aureus المقدمة وفي ت ازيد االهتمام في الوقت الحاضر بالنباتات الطبية في معظم بلدان العالم لسهولة تداولها وبساطة استعمالها بشكل مرك ازت أو مستخلصات أو أق ارص وحبوب جافة وكذلك احتوائها على مواد فعالة ذات تأثير فسلجي, مع سرعة الشفاء الناتج عن هذا االستخدام وعدم حدوث آثار جانبية.وأحد النباتات الطبية المهمة والمستخدمة في عالج كثير من األم ارض النبات المسمى الليمون الهندي (Grapefruit) والعائد لعائلة الحمضيات,فقد استخدمت بذوره لعالج العديد من األم ارض ومنها قرح الفم, التهاب البلعوم, نزالت البرد والتهاب األنف, التهاب اإلذن الوسطى وفي عالج الحروق كما استعمل في عالج االلتهابات المهبلية واألنفلون از والتسمم الغذائي تطهير الجروح الطفيفة, وقد لوحظ فعل زيت بذور هذا النبات في الشفاء من مرض الصدفية واالكزيما الجافة والثآليل وفطريات أصابع القدم [, 2]. تعد بكتريا المكو ارت العنقودية الذهبية Staphylococcus aureus من الممرضات الخطيرة لإلنسان المتالكها العديد من عوامل الض اروة ومن,3] أهمها البروتينات الخارج خلوية proteins) )Extracellular حيث تلعب هذه العوامل دو ار رئيسا في عملية التصاق واستيطان البكتريا ألنسجة المضيف وحصول اإلصابات المرضية المختلفة [3]. وتعد هذه البكتريا مسببا للعديد من اإلصابات كتجرثم الدم (Bacteremia(, التهاب شغاف القلب )Endocarditis), التهاب العظام )Osteomyelitis(, ذات الرئة )Pneumonia( والتهاب المفاصل arthritis) (septic, وكذلك تسبب هذه البكتريا التسمم الغذائي poisoning) (food (Toxic shock syndrome) 2 ].فضال عن كونها المسبب الرئيس لعدوى المستشفيات ومتالزمة الصدمة السمية (Nosocomial infections) والناتجة من التداخل الج ارحي للمرضى ال ارقدين في المستشفيات و اإلصابات المرتبطة بتلوث األجهزة الطبية [ 2 ].والتي لوحظ ارتفاع في معدالت اإلصابة بها في المستشفيات مما سبب انتشارها بشكل واسع خصوصا في وحدات العناية المركزة (intensive care units (ICUs)) والسيما المستخدمين للقثاطر, وان تلوث وأجهزة أدوات المستشفيات واستعمار البكتريا الكادر الطبي في أليدي المستشفيات, يساهمان في حدوث أوبئة بهذه البكتريا [ 7 ].لذا ظهرت الحاجة للسيطرة على تلك األوبئة من خالل غسل اليدين قبل وبعد مالمسة المرضى وحاجياتهم واستخدام طرق فاعلة في عمليات التطهير والتعقيم لمختلف األدوات والمعدات الطبية والج ارحية وبالتالي ازد المختلفة. االهتمام بالد ارسات والبحوث حول التصاق بكتريا S.aureus على مثل هذه المواد الرتباطها الوثيق بحدوث اإلصابات ولذا فقد هدفت هذه الد ارسة للتحري عن الفعل التثبيطي لمستخلص نبات الجريب فروت في الحد من قابلية هذه البكتريا الممرضة لتكوين الطبقة اللزجة وتقليل كفاءتها بااللتصاق على سطح األدوات كمطهر او معقم للحد والسيطرة على اإلصابات المتسببة بفعل هذه العزالت المرضية. الطبية والج ارحية كمستخلص طبيعي يمكن استخدامه 2500
المواد و - جمع العينات طرائق العمل تضمنت هذه الد ارسة جمع مسحات من األنف والجروح المتقيحة من المرضى في مستشفى ابن النفيس العامة المركزي فضال عن عزلة مشخصة من مختبر األحياء المجهرية في قسم علوم الحياة كلية العلوم للبنات. - تشخيص العينات تشخيص تم عزالت بكتريا.S aureus المعزولة من العينات والزرعية وعددمن الفحوصات الكيموحيوية وحسب ما جاء في[ 6 ]. -الكشف عن قابلية العزالت المشخصة قيد الد ارسة على تكوين الطبقة اللزجة التي جمعت في هذه الد ارسة.Slime layer اتبعت الطريقة الموصوفة من قبل فريمان وجماعته للتحري عن انتاج الطبقة اللزجة من قبل عزالت على األطباق الحاوية على وسط غ ارء احمر الكونغو وبعد حضنها لمدة 22 ساعة عند درجة اللون على هذا الوسط دليل على انتاج هذه العزالت للطبقة اللزجة [5]. على اعتمادا ومختبر الصحة الصفات المجهرية بكتريا.S, aureus بتنميتها - إختبار التصاق عزلة بكتريا S.aureusعلى مادة الفوالذ المقاوم للصدأ stainless steel ح اررة 35 م ظهور مستعم ارت سوداء استخدمت العزلة البكتيريةS.aureus الكفوءة في انتاج الطبقة اللزجة الختبار قابليتها على االلتصاق بمادة الفوالذ المقاوم للصدأ steel( (stainless الداخلة في صناعة العديد من المواد الطبية والج ارحية ولقد اعتمدت لذلك طريقة ك ارسيا [8] مع إج ارء بعض التحوي ارت عليها, حيث نميت العزلة في وسط مرق نقيع القلب الدماغ( broth )BHI لمدة 6 ساعات و بدرجة ح اررة 35 م ثم رسبت الخاليا بإستخدام جهاز المنبذ المركزي بسرعة 3 دورة / دقيقة لمدة دقائق و غسل ال ارسب مرتين بدارئ الفوسفات الملحي ذي األس الهيدروجيني 5 ثم علقت في المحلول نفسه ثم قيست كثافتها ضوئية على الطول الموجي ( 6 نانومتر ) لحين الوصول إلى تركيز الخاليا 8 خلية / مللتر وبنفس الوقت تم وضع قطعة واحدة من مادة الفوالذ المقاوم للصدأ يصل طولها إلى سم في العالق البكتيري وبعد الحضن لمدة 22 ساعة عند درجة ح اررة 35 م تم حساب أعداد الخاليا الملتصقة من خالل غسل القطعة 3-2- - بمحلول دارئ الفوسفات الملحي مع الرج لمدة 3 دقائق ثم حضرت عدة تخافيف من هذا المحلول ( ),, واخذ 3- مل من التخفيف و نشر على طبق االكار المغذي و حضن بدرجة 35 م لمدة 22 ساعة وثم حسبت أعداد البكتريا بطريقة عد المستعم ارت الحية - تحضير مستخلصات نبات الجريب فروت grapefruit extracts غشائية. حضر مستخلص عصير النبات بعصر الثمرة لهذا النبات واخذ مل من العصير بإ ازلة البذور واألغشية ورشح عبر مرشحات ( Millipore )بقطر,22 مايكرومتر. )distillation) بجهاز االستخالص ولتحضير تم استعمال البذور المائي مستخلص طريقة التقطير التجزيئي Fractional Ordinary reflux وذلك بوضع )0( نسبة مسحوق بذور جافة إلى ماء, في حين حضر مستخلص البذور (GSE) grapefruit seed extract بعصر الثمرة كاملة بمحتوياتها )بذور,seeds لب pulp وأغشيه بيضاء white membranes (بعد إ ازلة القشور الخارجية السميكة للثمرة[ 8 ]. - وذلك الكشف عن تأثير مستخلصات نبات الجريب فروت في نمو بكتريا S.aureus استخدمت طريقة االنتشار في الحفر( method (well diffusion وفق [9] حيث زرعت البكتريا المرضية والمعزولة في الوسط المغذي السائل وحضنت في درجةح اررة 35 م لمدة 3 ساعات,ثم نقل جزء من العالق البكتيري ولقح به وسط األك را بنشر, مل بوساطة منه ناشر, ثم تركت المغذي الصلب األطباق لتجفف بالحاضنة في درجة ح اررة 35 م لمدة 7 دقيقة. ثم عملت ثقوب بقطر 7 ملم بوساطة ثاقب فليني وبواقع )2-3( حفرة للطبق الواحد وملئت كل حفرة منهم بمقدار, مل من المستخلص النباتي قيد الد ارسة والذي حضر بت اركيز مختلفة وتمثلت السيطرة بإضافة ماء مقطر معقم فقط وبعد حضن األطباق في درجة ح اررة 35 م لمدة 22 ساعة تم تسجيل النتائج بقياس قطر مناطق التثبيط. - الكشف عن تأثير مستخلص البذور في التصاق بكتريا S.aureus على مادة الفوالذ المقاوم للصدأ اعتمدت لذلك طريقة ك ارسيا وجماعته [ 9 ]المحورة والتي مر ذكرها سابقا مع مالحظة انه تم إضافة مستخلص البذور (GSE) % إلى العالق البكتيري بحجم مساوي لحجم العالق البكتيري. 250
النتائج والمناقشة الحصول تم على 8 عزالت تعود الفحوصات المظهرية والكيموحيوية لتمييز بتفاعلها الموجب مع صبغة غ ارم لبكتريا.S aureus من مجموع Catalase و انزيم.Coagulase تعود لعينات مسحات مختلفة, سريرية من عدد أعتمدت بكتريا.S aureus عن األنواع البكتيرية األخرى وحسبما جاء في [] والتي اتصفت وقابليتها على النمو على وسط المانيتول الملحي أكار وتخميرها لسكر المانيتول إلنزيم وانتاجها وعند التحري عن إنتاج الطبقة اللزجة من قبل هذه العزالت بينت النتائج أفضلية العزلة SA5 في تكوينها لهذه الطبقة مقارنة ببقية العزالت من خالل ظهور مستعم ارتها بلون وردي ووسط أكار احمر الكونغو بلون اسود شكل-. لقد بينت عدد من البحوث إمكانية استخدام وسط أكار احمر الكونغو كطريقة معتمدة للتحري عن إنتاج صبغة احمر الكونغو لها القابلية على تصبيغ السكريات المتعددة التي تتألف منها الطبقة اللزجة [5]. الطبقة اللزجة من قبل بكتيريا [,.S aureus 2] حيث أن شكل - إنتاج الطبقة اللزجة من قبل عزالت S.aureusباستعمال وسط أكار أحمر الكونغو. وعند الكشف عن تأثير المستخلصات النباتية لنبات الجريب فروت في نمو عزلة البكترياSA5S.aureus بينت النتائج وكما موضح في الشكل- 2 والجدول- ان المستخلص المائي لبذور نبات الجريب فروت وبت اركيزه المختلفة لم يظهر تأثير تثبيطي للنمو بينما وجد ان مستخلص العصير لهذا النبات كان ذو تأثير تثبيطي عند الت اركير) %7,%57,% ( وبمعدالت أقطار تثبيطية) 2 ملم, ملم, 8 ملم(على التوالي,في حين أظهرمستخلص البذور) GSE ) تأثير تثبيطي أقوى عند الت اركيز )%, %57, %7, %27( وبمعدالت اقطار بلغت ) 7 ملم, 2 ملم, 9 ملم, 5 ملم( على التوالي كما موضح في الجدول أدناه, والذي يتفق مع نتائج عدد من البحوث في امتالك هذا المستخلص النباتي الفاعلية التثبيطية ضد عدد من البكتيريا الممرضة ومنها بكتيريا [2,3, S.aureus 7] وذلك لما يحويه هذا المستخلص من مركبات فاعلة ذات تأثير مؤكسد لألحياء المجهرية ومن ضمنها البكتريا الموجبة لصبغة غ ارم ومن هذه المركبات النارنجين )Naringin( و الهسبردين )hesperidine( اللذان يعودان الى الفالفونيدات,2] Flavonoids [6. 2502
جدول - أقطار مناطق التثبيط )ملم(عند استخدام مستخلصات نبات الجريب فروت المختلفة بت اركيز متدرجة. قطر منطقة التثبيط )ملم( التركيز)%( المستخلص 27 مستخلص البذور المائي 7 57 27 مستخلص العصير 8 7 57 2 5 27 مستخلصGSE 9 7 2 57 7 شكل 2- تأثير مستخلصات نبات الجريب فروت في نمو عزلة البكترياSA5S.aureus. 2503
no. of adhered bacteria العزلة البكتيرية التصاق قابلية اختبار وعند SA5 على مادة الفوالذ المقاوم للصدأ أن النتائج أظهرت عدد كبير من الخاليا البكتيرية المحضونة بوجود قطعة من مادة الفوالذ المقاوم للصدأ قد التصقت بسطح هذه المادة والذي كان بحدود 78 7 خلية / مل وهذه مثلت معاملة السيطرة في حين انخفض عدد الخاليا الملتصقة بسطح هذه المادة بمستخلص.S( aureus )لكونه األقوى تأثي ار في تثبيط نمو )%(GSE بسطح مادة الفوالذ المقاوم للصدأ في معاملة السيطرة يعود إلى كونها شكل- 3 تعد من المواد إلى 2 22 السبب في التصاق إن, خلية / مل عند معاملتها الخاليا البكتيرية األكثر جذبا للبكتريا لما تمتاز به من خشونة السطح [ 5 ],إضافة إلى عدة عوامل تحفز هذا االلتصاق البكتيري ومنها عوامل بيئية كدرجة الح اررة, فترة التعرض والتركيز البكتيري عوامل تتعلق بخصائص سطح المادة كالتركيب الكيميائي للمادة, شحنة السطح, ألفته للماء وخشونة السطح [8] انخفاض عدد الخاليا البكتيرية الملتصقة بهذه المادة عند معاملتها بالمستخلص النباتي يعود إلى السبب في أما تغير قيمة األس الهيدروجيني PH حيث ان هذا المستخلص يحوي على مركبات النارنجين ذات أس هيدروجيني اقل من 2 والذي سيؤدي إلى تغي ارت في شحنات سطح المادة الصلبة الملتصقة عليها البكتريا وبالتالي سيؤثر في عملية االلتصاق [ 9,5 ].فضال عن عمل هذا المستخلص على اإلخالل بالغشاء الخلوي ومحتويات سايتوبالزم الخلية البكتيرية عند التعرض له [2]. شكل 3- تأثير مستخلص GSE في التصاق عزلة البكترياSA5S.aureusعلى مادة الفوالذ المقاوم للصدأ. المصادر ظاهر, سعدي محمد.2003. الشحات, نصر أبو زيد األعشاب الطبية/ الطب البديل. مجلة المستقبل,2-9038..89. النباتات واإلعشاب الطبية. دار البحار, بيروت...2 2504
3. Levinson, W., Jawetz, E. 2002. Medical Microbiology&Immunology: Examination & Board Review.7 th ed. TheMcGraw -Hill Co., USA. 4. Nair,S. P., Williams, R. J.and Henderson, B. 2000. Advances in our understanding of the bone and joint pathology caused by Staphylococcus aureus Infection. Oxford Journals, Rheumatology. 39: pp: 82 834. 5. Diekema, D.J., Pfaller, M.A., Schmitz, F.J., Smaye,J., Bell, J., Jones, R. N. and Beach, M. 200. Survey of infections due to Staphylococcus species.freguency of occurrence and antimicrobial susceptibility of isolates collected in the United States for the Centery antimicrobial surveillance Program.,Clin. Infect.Diss., 32, pp: 4 32. 6. Forbes, B.A., Sahm, D.F. and Weissfeld, A.S. 2002. Baily and Scotts: Diagnostic Microbiology. th ed. Mosby, Inc. Baltimore, USA. 7. Freeman,D.J.,Falkinar,F.R.and Kean,C.T.989.New method for detection slime production by coagulase negative staphylococci,j.clin.pathol.,42, pp:872-874. 8. Von Woedtke, T., Schlüter, B.,Pflegel, P., Lindequist,, U. and Jülich, W.D. 999. Aspects of antimicrobial efficacy of grapefruit seed extract and its relation to preservative substances contained. Pharm.54, pp: 452-456. 9. Gracia, E., Fernandez, A., Conhello, p.and Lacleriga, P. L. 977.Adherence of Staphylococcus aureus slime producing strain variants to biomaterials used in Orthopaedic surgery.int.orthop.,2(), pp:46-5. 0. National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS).997. Methods for dilution antimicrobial susceptibility test for Bacteria that grow aerobically.approved Standards M7-A4. National committee for clinical Laboratory Standards.wayne, PA. USA.. Krukowski, H.,Szymankiewicz, M. and Lisowski, A. 2008. Slime productionby Staphylococcus aureusstrainsisolated from cases of bovine mastitis.polish J Microbiol,. 57( 3): 253-255. 2. Hammadi, K. M. and Yousif, A. A. 204. Detection of slime material in Staphylococcus aureus bacteria from ovinemastitis by transmission electron microscope and Congo red agar method. Int.J.Curr.Microbiol.App.Sci., 3(4), pp: 304-309. 3. Al Âni, W.N.,Tawfik, N.O. and Shehab, E.Y.20. Antimicrobial activity of grapefruit seeds extracts (In vitro Study).Al Rafidain Dent J., (2), pp: 34-345. 4. Cvetnić, Z. and Vladimir Kneźević, S.2004. Anti-microbial activity of grapefruit seed and pulp ethanolic extract. Acta Pharm., 54, pp: 243 250. 5. Reagor, L.,Gusman, J., McCoy, L.,Carino,E.and Heggers, J.P.2002. The effectiveness of processed grapefruit seed extract as antibacterial agent:. An in vitro agar assay. J Altern Complement Med.,8, pp: 325 332. 6. Giuseppe, G.,Davide, B., Claudia, G.,Ugo, L. andcorrado, C.2007. Flavonoid composition of citrus juices. Molecules.,2, pp: 64-673. 7. Kouider,N., Hamadi, F., Mallouki, B., Bengoram, J., Mabrouki, M., Zekraoui, M., Latrache, H. and Ellouali,M.200. Effect of stainless steel surface roughness on Staphylococcus aureus adhesion.international Journal of Pure and Applied Sciences,4(), pp:-7. 8. Katsikogianni, M. and Missirlis, Y.F.2004. Concise review of mechanisms of bacterial adhesion to biomaterials and of techniques used in estimating bacteria material interactions.eur Cell Mater., 8, pp:37-57. 9. Fletcher,M. 980. The characteristics of interfaces and their role in microbial attachment,in"microbial adhesion to surfaces,berkely,r.c.,lynch,j.m. Melling,J.,Rutter, P.R.Vincent, B.,eds.,pp:67-78." Horwodlimited,USA. 20. Heggers, J.P.,Cottingham, J.,Gusman, J.,Reagor, L., McCoy, L.,Carino, E., Cox, R. and Zhao, J. 2002.The effectiveness of processed grapefruit seed extract as an antibacterial agent: II. Mechanism of action and in vitro toxicity. J Altern Complement Med., 8, pp: 333 340. 2505