محمد فخري القاضي محمد معروف مجلة جامعة البعث المجلد 39 العدد دراسةىتواجدىجونىP27 ىفيىاللوشمانوةى المداروةL.tropicaى ودراسةىتعبورهاىالجونيىفي

النسخ

1 دراسةىتواجدىجونى ىفيىاللوشمانوةى المداروةL.tropicaى ودراسةىتعبورهاىالجونيىفيى مشوقاتىPromastigoteىاللوشمانوةىالمداروةى ى طالب الد ارسات العميا: كمية: الصيدلة - جامعة: دمشق اش ارف الدكتور: الممخص يتواجد بروتين 11 )Protein )البروتين الغشائي الم تقدري Mitochondrial Membrane في الغشاء الداخمي لمم تقدرة ولو دور رئيسي في تعزيز الفسفرة التأكسدية واصطناع ثالثي فسفات األدينوزين تتواجد جين األمر الذي يساعد الطفيمي بالبقاء ضمن المضيف و عند الميشمانية في األنواع التالية فقط )الميشمانية الكبرى.L major و الميشمانية المكسيكية.L mexicana الميشمانية الط فمي ة.L( infantum الجين في الميشمانية و الميشمانية الد نوفانية.L donvania و وال يوجد سوى د ارسة واحدة تحدثت عن تواجد ىذا المدارية إلى جانب أن تسمسل ىذا بيانات ال GenBank عند الميشمانية المدارية. في ىذه الد ارسة قمنا بد ارسة التعبير الجيني عن الجين غير منشور في قاعدة في الشكل المشيقي لميشمانية المدارية بواسطة تقانة Reverse Transcriptase Polymerase Chain )RT-PCR( Reaction مستخدمين زوجا من المشارع النوعية التي تم تصميميا يدويا باالعتماد عمى تسمسل ىذه الجين في األنواع األخرى من الميشمانية بعد تحديد ومعرفة المناطق المصانة من التسمسل وأظيرت النتائج إثبات تواجد جين الميشمانية المدارية إلى جانب وجود تعبير جيني ليا في الشكل المشيقي. الكممات المفتاحية: الميشمانية المدارية التعبير الجيني المشيقات. في جينوم

2 ودراسة تعبيرها الجيني في مشيقات L.tropica في الليشمانية المدارية دراسة تواجد جين الليشمانية المداريةPromastigote Studying the Presence and Expression of Gene in Promastigotes of Leishmania tropica Abstract protein (Mitochondrial Membrane Protein) is an innermitochondrial membrane protein, which is part of the active COX complex involved in oxidative phosphorylation that is required for the survival of the intracellular parasite in the host cell. gene exist in four species of Leishmania which are L.major, L.mexicana, L.donovani and L.infantum, and there is only one paper revealed that protein is expressed in L.tropica, but the sequence of this gene in L.tropica not published until this date. In our study, the presence and expression of gene in L.tropica evaluated in promastigotes by PCR and RT-PCR using specific primer pairs that manually designed after determine the consensus sequence of forward and reverse region of primers between species of Leishmania by using MUSCLE (Multiple Sequence Comparison by Log- Expectation) tool for alignment. The results proved the presence of gene in Leishmania tropica, beside presence the mrna of gene that confirm that expressed in promastigote form of L.tropica. Kewwords: Leishmania tropica,, Expression, Promastigote 12

3 مقدمة الميشمانية ىي طفيميات من جنس الميشمانية Leishmania Protozoa تنتقل ىذه الطفيميات إلى اإلنسان بواسطة ذبابة الرمل وتسبب من شعبة الحيوانات اآلوالي Sand Flies.)2004 طيف واسع من المظاىر السريرية يشار إلييا باسم داء الميشمانيات) Desjeux تت اروح المظاىر السريرية لداء الميشمانيات من الميشمانية الجمدية الناجمة عن الميشمانية الكبرى.L major والميشمانية لمشفاء بشكل تمقائي بعكس المكسيكية.L mexicana التي تتميز بأنيا إصابة قابمة اإلصابة بالميشمانية المدارية.L tropica التي تكون غير قابمة لمشفاء بشكل تمقائي إلى الميشمانية الحشوية الميددة لمحياة الناجمة عن الميشمانية الد نوفانية L. donovani والميشمانية الط فمية Sharma, ( L.infantum.)Gurumurthy et al يعد داء الميشمانيات واحدا من أكثر األم ارض الطفيمية الخمجية انتشا ار في العالم حيث سجل وجوده في أربع قا ارت ىي أمريكا وآسيا وأفريقيا وأوروبا العالمية فإن %90 من اإلصابات بالداء الجمدي تتركز في والمممكة العربية السعودية والجميورية العربية السورية) 1990.)WHO وبحسب منظمة الصحة أفغانستان واي ارن والب ارزيل أعداد مت ازيدة من اإلصابات بداء الميشمانية الجمدية في كافة المحافظات )2010 )WHO مما يجعل من ىذا الداء مشكمة صحية ىامة. وتسجل حاليا السورية طفيميات الميشمانية ذات تطفل داخل خموي وتتواجد بشكمين: إما الم ش ي ق ة )الشكل المتحرك( Promastigote والذي يتواجد في الوسط الزرعي وفي معي الحشرة الناقمة أو الم يش مان ة )الشكل غير المتحرك( Amastigote والذي يتواجد داخل البالعم) Bari and.)rahman

4 ودراسة تعبيرها الجيني في مشيقات L.tropica في الليشمانية المدارية دراسة تواجد جين الليشمانية المداريةPromastigote يعرف جين Protein يبمغ طول الجين بالبروتين الغشائي الم تقدري Mitochondrial Membrane 723 زوج أساس ويكون ناتج التعبير الجيني ىو بروتين بطول 240 حمض أميني ووزن جزيئي 27 كيمو دالتون) NCBI (. تأتي أىمية ىذا الجين باكتشافيا بادئ األمر عند الميشمانية Amastigote.)Meneses et al وبد ارسة التعبير الجيني لجين وغ ازرة في طفيمي الميشمانية الد نوفانية وتحديدا بشكمو الميشماني واالعتقاد بأن لو دور رئيسي في البقاء ضمن المضيف) Dey, بشكمو الميشماني تبين أنو يتم التعبير الجيني لبروتين Amastigote بوفرة والطور المعدي من الشكل المشيقي.)Sharma, Gurumurthy et al. 2010( Promastigote Metacyclic يتواجد بروتين الس يتوكر وم أوكسيداز Oxidative Phosphorylation في الغشاء الداخمي لمم تقدرة حيث يعتبر مكون رئيسي من (COX) C ويكون لو دور رئيسي في تعزيز الفسفرة التأكسدية واصطناع ثالثي فسفات األدينوزين لمطفيمي ATP وخصوصا بشكمو عديم السوط والطور المعدي من الشكل أمامي السوط األمر الذي يساعد الطفيمي بالبقاء ضمن المضيف حيث أدى حذف جين الميشمانية إلى نقص واضح بنشاط معقد COX ATP من طفيمي وبتصنيع األدينوزين ثالثي الفوسفات في الشكل الميشماني المتواجد داخل الخاليا مقارنة مع النمط الب ر ي باإلضافة إلى إنقاص فوعة الطفيمي عند كال من بالعم اإلنسان و الفئ ارن wild type BALB/c.)Dey, Meneses et al. 2010( هدف البحث يتواجد جين عند الميشمانية في األنواع التالية فقط )الميشمانية الكبرى L.major والميشمانية المكسيكية.L mexicana والميشمانية الد نوفانية.L donvania والميشمانية الط فمي ة )Uniprot( L.infantum وال يوجد سوى د ارسة واحدة تحدثت عن تواجد ىذا الجين في الميشمانية المد ارية إلى جانب أن تسمسل ىذا الجين غير منشور في قاعدة 14

5 Sharma, Gurumurthy et al. ( بيانات ال GenBank عند الميشمانية المدارية.)2010 لذلك ىدفنا من البحث تحري وجود ىذا الجين عند الميشمانية يعتبر ىذا النوع األكثر انتشا ار واحداثا لداء الميشمانية المدارية.L tropica حيث الجمدية في سوريا والتأكد من وجود تعبير جيني ليا األمر الذي يعكس أىمية ىذه البروتين كعامل رئيسي لبقاء الطفيمي ضمن المضيف وبالتالي إمكانية استخدام ىذا داء الميشمانية الجمدية الجين كيدف في تحضير لقاح لموقاية من حيث أدى استخدام الميشمانية الدونوفانية مضعفة Live الفوعة Attenuated بحذف جين من الطفيمي )Ldp27 / ( إلى توليد مناعة م حصنة طويمة المدى عند فئ ارن من الميشمانية مثل الميشمانية BALB/C إلى جانب توليده مناعة متصالبة مع أنواع متغايرة الكبرى.)Dey, Dagur et al. 2013( L.major مواد وط ارئق البحث مكان إج ارء البحث. تم إج ارء البحث في مركز الد ارسات الوبائية والبيولوجية لطفيميات الميشمانية في سوريا. الحصول عمى الطفيميات. تم استخدام strain ذ ارري من المشيقات لطفيميات الميشمانية المدارية L. tropica في سوريا. المأخوذة من مركز الد ارسات الوبائية الد ارسة البيولوجية الحاسوبية وتصميم المشارع. تم تصميم م شرعات جين العتبارىا المشرع المباشر والبيولوجية لطفيميات الميشمانية بناء عمى تسمسل الميشمانية الكبرى.L major األقرب لتسمسل الميشمانية المدارية.L tropica FWD.Primer عمما أن منطقة مصانة بين أنواع الميشمانية وتختمف بأساسين فقط وكذلك منطقة المشرع العكسي REV.Primer تختمف بأساس واحد فقط. 15

6 ودراسة تعبيرها الجيني في مشيقات L.tropica في الليشمانية المدارية دراسة تواجد جين الليشمانية المداريةPromastigote وتم د ارسة تسمسل ىذه الجينات بدقة ومقارنتيا مع تسمسل نفس الجينات في أنواع أخرى من الميشمانية بشكل خاص )الميشمانية الكبرى والميشمانية المكسيكية( لمتأكد من نسبة التطابق وخصوصا في مناطق ارتباط المشارع وتم التحقق في حال وجود أي تطابق بين تسمسل الجينات والجينوم البشري. الشكل 1 : مقارنة تسمسل جينة لمنطقة المشرع المباشر عند أنواع الميشمانية بواسطة أداة.MUSCLE الشكل 2 : مقارنة تسمسل جينة لمنطقة المشرع العكسي عند أنواع الميشمانية بواسطة أداة.MUSCLE استخالص الرنا من الميشمانية تم استخالص الرنا من الميشمانية بحسب برتوكول الشركة المصنعة لمعتيدة Kitالمستخدمة.(K0731, Thermo Scientific, USA) تصنيع الدنا المتمم cdna تم تصنيع الدنا المتمم الميشمانية بحسب خطوات الشركة المصنعة لمعتيدة Kit المستخدمة استخدام العتيدة USA) (K1621, Thermo Scientific, وذلك باستخدام مشرع Oligo (dt) 18 Primer الموجودة بالعتيدة. تطبيق تفاعل PCR تم إج ارء تفاعل البوليم ارز التسمسمي عمى الدنا المتمم cdna بيدف معرفة وجود ود ارسة جين عند الميشمانية المدارية وقد استخدم زوج من المشرعات 16

7 النوعية المتممة لميشمانية الكبرى باعتبارىا األقرب لميشمانية المدارية وصنعت ىذه المشرعات في شركة Canada( )Alpha DNA, أنجز تفاعل PCR باستخدام جياز المدور الح ارري Thermocycler PCR Master Mix بعد القيام بخطوات برتوكول عتيدة )Cleavers, UK(.)K0171, Thermo Scientific, USA( إج ارء الرحالن الكهربائي تم ترحيل نواتج PCRعمى ىالمة أغاروز تركيزىا %1 ممونة stained باإليثيديوم برومايد من شركة )Vivantis,Malaysia( باستخدام جياز رحالن كيربائي أفقي )Cleaver,UK( بعد أن تم توصيمو إلى تيار كيربائي 100 فولط وشدتو 120 ميمي أمبير واستطاعتو 15 واط ومدة الترحيل 50 دقيقة. ثم تم تظيير عصابات الدنا بوضع اليالمة في جياز األشعة فوق البنفسجية )Cleaver,UK( UV بطول موجة 320 نانو متر وتم التصوير بعد ذلك. النتائج تقييم الرنا المستخمص: تم التأكد من جودة الرنا المستخمص من المستنبتات بواسطة الرحالن الكيربائي األفقي عمى ىالمة أغاروز بتركيز %1. بتعريض اليالمة لمنبع األشعة فوق البنفسجية تبين وجود عصابة الدنا الجينومي gdna وعصابات الرنا )5S,28S( 18S, مما يدل عمى جودة االستخالص وعدم تدرك RNA أثناء التحضير. 17

8 ودراسة تعبيرها الجيني في مشيقات L.tropica في الليشمانية المدارية دراسة تواجد جين الليشمانية المداريةPromastigote الشكل 3: الرحالن الكهربائي االفقي عمى هالمة األغاروز %1 لعينة الرنا لطفيميات الميشمانية المدارية في البئر رقم 3 )يالحظ عصابة الدنا الجينومي gdna وعصابات الرنا 28S و 18S و 5S(. نجاح تصميم المشرعات: تم تصميم م شرعات جين يدويا بناء عمى تسمسل الميشمانية الكبرى.L major العتبارىا األقرب لتسمسل الميشمانية المدارية.L tropica حيث استخدمت المشرعات وفق التسمسل التالي )Fwd. Primer: ATGTCTCGCTGCACGACCAAG( )Rev. Primer: TTACACACCGTGGCCGGAC( أمثمة شروط تفاعل :PCR تم إج ارء تفاعل PCR باستخدام المشرعات النوعية السابقة وذلك بعد أن حو ل RNA المعزول من الميشمانية إلى cdna بحسب ما ذكر في الط ارئق. تم أمثمة Optimization البرتوكول بعد إعادتو عدة م ارت لموصول لمشروط المثالية وكانت درجة ح اررة االلتحام المثالية 60.2 حيث طبق التفاعل وفق البرنامج التالي: 18

9 الجدول 1 : البرنامج الحراري لتفاعل PCR بعد األمثمة Optimization Step Temperature, C Time Number of cycles Initial denaturation 94 5 min 1 Denaturation S Annealing S 40 Extension S Final Extension 72 5 min 1 نتائج ترحيل ناتج تضخيم تفاعل :PCR تم أخذ 4 عينات من الجين المضخم عينة واحدة من DNA المضخم حقنت في البئر رقم 2 وثالث عينات من cdna المضخم حقنت في اآلبار أرقام )3 و 5 و 7( وأظيرت النتائج أربع عصابات عمى الجل وبشكل يتوافق مع طول جين البالغ 723 زوج أساس ثالث عصابات ل cdna وعصابة لمدنا عمما أنو تم استخدام )Thermo Scentific,US( GeneRuler-1-kb-DNA-Ladder حيث حقنت في البئر رقم 1. 19

10 ودراسة تعبيرها الجيني في مشيقات L.tropica في الليشمانية المدارية دراسة تواجد جين الليشمانية المداريةPromastigote الشكل 4: رحالن جين ونالحظ ظهور 4 عصابات بطول 323 زوج أساس في اآلبار 2 و 3 و 5 و 3. المناقشة تم في ىذا البحث مركز ذ ارري استخدام الد ارسات الوبائية والبيولوجية لطفيميات حيث تم إثبات تواجد ىذا المشيقي وذلك بواسطة تقانة قاعدة بيانات ال الباحث من مشيقيات طفيمي الميشمانية المدارية المحفوظة في 20 الميشمانية ومن ثم درست جين الجين عند الميشمانية المدارية ووجود تعبير جيني ليا في الشكل RT-PCR رغم عدم وجود تسمسل منشور في لجين GenBank بأن جين Sharma عند الميشمانية المدارية.L tropica وىذا يتوافق مع د ارسة داء في عنو التعبير يتم بالميشمانية المدارية) 2010 al..)sharma, Gurumurthy et الميشمانية الجمدية المسببة وقد أظير البحث في قاعدة بيانات ال GenBank عدم وجود أي جين مشابو ل في كائن حي آخر وتبمغ نسبة التشابو عمى المستوى الجيني بين أنواع الميشمانية أكثر بينما تكون نسبة التشابو مع المثقبية البروسية %80 أو T.Brucei والمثقبية الكروزية

11 T.Cruzi 65% خاصة بعائمة و الميشمانية %62 عمى الترتيب وىذا ما يتوافق مع د ارسة الباحث )Uniprot( مما يدل عمى أن جين Sharma حيث وضح في د ارستو أن ىذا البروتين يتم التعبير عنو بوفرة في جميع األشكال السريرية لداء الميشمانيات )الحشوي الجمدي والغشاء المخاطي( مما يدل عمى أن ىذه الجين مصانة بشكل كبير بين أنواع الميشمانية وليا أىمية حيوية لبقاء الطفيمي داخل خاليا المضيف) 2010 al..)sharma, Gurumurthy et تأتي أىمية جين من نتائج بعض الد ارسات التي استخدمتو كيدف لتحضير لقاح ضد الميشمانية الدونوفانية حيث أعطى نتائج واعدة في توليد مناعة م حصنة طويمة المدى عند فئ ارن BALB/c وأنقص غياب ىذا األمر الذي لم يسمح لو لمبقاء ألكثر من 20 الجين من إم ارضية الطفيمي بشكل كبير أسبوع في الفئ ارن إلى جانب توليده مناعة متصالبة مع أنواع متغايرة من الميشمانية مثل الميشمانية الكبرى L.major Dey, ( )Dagur et al لذلك فإننا نعتبر جين االست ارتيجيات المتبعة لتحضير لقاح ضد داء الميشمانية الجمدية. ىدف واعد الستخدامو في االستنتاجات والتوصيات تم التوصل في ىذه الد ارسة إلى إثبات تواجد جين في جينوم الميشمانية المدارية إلى جانب وجود تعبير جيني ليا في الشكل المشيقي وفي غياب وجود لقاح فعال لموقاية من داء الميشمانيات نأمل في أن تكون جين المتبعة لتحضير لقاح داء ضد بإعتباره المسبب الرئيسي لداء الميشمانيات في سورية. ىدف واعد الستخدامو في االست ارتيجيات الميشمانية الجمدية خصوصا الناجمة عن.L tropica 21

12 ودراسة تعبيرها الجيني في مشيقات L.tropica في الليشمانية المدارية دراسة تواجد جين الليشمانية المداريةPromastigote الم ارجع Bari, A. U. and S. B. Rahman (2008). "Cutaneous leishmaniasis: an overview of parasitology and hostparasite-vector inter relationship." JPAD 18: Desjeux, P. (2004). "Leishmaniasis: current situation and new perspectives." Comp Immunol Microbiol Infect Dis 27(5): Dey, R., et al. (2010). "Characterization of a Leishmania stage-specific mitochondrial membrane protein that enhances the activity of cytochrome c oxidase and its role in virulence." Mol Microbiol 77(2): Dey, R., et al. (2013). "Live attenuated Leishmania donovani p27 gene knockout parasites are nonpathogenic and elicit long-term protective immunity in BALB/c mice." J Immunol 190(5): NCBI Leishmania donovani strain Ld1S2D mitochondrial gene. Sharma, P., et al. (2010). "Comparative in vivo expression of amastigote up regulated Leishmania genes in three different forms of Leishmaniasis." Parasitol Int 59(2): Uniprot Cluster with 90% Identity. WHO (1990). "Technical Report series 793." 22

13 WHO (2010). Report of a meeting of the expertcommittee on the control of leishmaniases, Geneva, World Health Organization. 23