Aspergillusspp الخلاصة نيران عبيد جاسم كلية الصيدلة/جامعة القادسية زهراء فلاح عزيز كلية العلوم /جامعة القادسية هدفت الدراسة ال

النسخ

1 Aspergillusspp الخلاصة نيران عبيد جاسم كلية الصيدلة/جامعة القادسية زهراء فلاح عزيز كلية العلوم /جامعة القادسية هدفت الدراسة الحالية ا لى عزل ا نواع الجنس Aspergillusspp. من الا صابات الري وية المزمنة في محافظة الديوانية, حيث جمعت عينات القشع من مرضى العيادة الاستشارية للا مراض الصدرية والتنفسية, وا خضعت العينات الى الفحص المجهري المباشروالتشخيص الزرعي والجزيي ي بتقنية PCR,ا ظهرت النتاي ج ا ن( 107 )عزلة عاي دة ا لى جنس Aspergillus spp وبنسبة (28.08%) من المجموع الكلي للعزلات والبالغ (381) عزلة, وعلى مستوى الا نواع التابعة لجنس Aspergillus spp سجل.A ١٨٤ fumigatus و A.terreus ا على نسبة مي وية للتردد( 29.9% ) تلاه الفطرniger. Aبنسبة, 12.14%, A. nidulans بنسبة 18.7%) (28.9%) وعزلت كذلك % 2.8 )على التوالي, كما الا نواعflavus. Aو تم عزل الانواع A.parasiticusوA.ochraceus و A.penicillioidesوA.ustusوالتي تعتبر حسب الدراسات المتوفرة قد عزلت لا ول مرة في مدينة الديوانية كذلك دلت النتاي ج على ا ن التشخيص الجزيي ي ذو كفاءة عالية في التشخيص. الكلمات الدالة:. spp, Aspergillus التشخيص الجزيي ي بتقنيةPCR Abstract Study aims to isolate isolates fungus Aspergillus spp. Isolated from injuries chronic lung in the province of Diwaniyah, where the samples were collected sputum from patients clinic Advisory diseases thoracic and respiratory, and subjected the samples to a microscopic examination of direct and diagnosis pea and molecular technology, PCR, and the results showed (107) isolation of its ownership to the genus Aspergillus spp. and by (28.08%) of the total isolates and adult (381) isolation, while the level of species belonging to the genus Aspergillus spp. record A. fumigatus highest percentage of frequency (29.9%), followed by the fungus A. niger (28.9%), as well as the isolated species A. flavusand A. terreus and A. nidulans(18.7%, 12.14%, 2.8%), respectively, have also been isolated species A. ochraceus, A.parasiticus, A.penicillioides and A.ustus which are considered according to available studies has been isolated for the first time in the city of Diwaniya. The results also showed the level of diagnosis of type that molecular diagnostics has proved highly efficient in the diagnosis. Keywords:Aspergillus spp.,molecular diagnosticpcrtechnology المقدمة تعد الا صابة بالا نواع المختلفة من الفطر. spp Aspergillusمن ا كثر ا نواع الا صابات الفطرية شيوعا والا كثر تكرارا من بين الا خماج المختلطة infection) (Prescott et al., 2005) (Mixed. كما تعتبر الا نواع التابعة لهذا الجنس ممرضة انتهازية pathogenic) Opportunistic )تنتشر بكثرة في التربة والهواء, وتتمكن من النمو في ا ي وسط حي, وتحدث الا صابة بها نتيجة لاستنشاق الابواغ Airboneا ذ تتمكن من الوصول ا لى الا سناخ الري وية با ضعف تيار هواي ي نتيجة لحجمها الصغير, الرشاشيات الري وي( aspergillosis Pulmonary )(اسماعيل, والتي 2008), بوجود عوامل تو دي ا لى حدوث داء من شدة تزيد الا صابة للمضيف, والتي تجعل الفطر قادر على تجاوز الخطوط الدفاعية الا ساسية للمضيف, كما تسهم في تخريب النسيج الذي تستوطنه مثل العمر, الجنس, الضعف ا و الوهن المناعي, السمنة, الا مراض الخبيثة, مرض السكري وتناول الا دوية المثبطة للمناعة كالمركبات الستيرويدية( steroid )ومرافقة مع بعص الامراض الري وية المزمنة التي تعتبر مهيي لحدوث الا صابة مثل السل الري وي وخراجات الري ة والربو والتهابالقصبات

2 المزمن ا و الحاد (الجناحي, 2012). تتخذ الفطريات ومنها جنس Aspergillus ا ساليب وراثية وفسلجيةمتعددة لتجنب دفاعات المضيف مسببة بذلك المرض والا صابة بواسطة افرازها الا نزيمات الخارج خلوية والذي يعد واحد من اهم عوامل الضراوة الكامنة في هذا الفطر( 2010, (Alpsoy. وعموما يعني مصطلح Aspergillosis الالتهاب الذي تسببه فطريات. Aفي fumigatus الجهاز الري وي القصبي ويمكن للا نواع الا خرى من الجنس مثل( terreus, A.flavus )ان.A niger,.a تصيب الري ة لتسبب طيف واسع من الا مراض الري وية التي يتراوح مداها من تفاعلات فرط الحساسية الى الاصابة الجهازية المباشرة وغالبا ما تكون الا عراض والعلاماتالسريرية غير واضحة ولا تدل على نوع المسبب.وبشكل عام فان شدة الاصابة تعتمد على مناعة المضيف وضراوة الفطر.(2011 al., (Ines et.ونظرنا لزيادة ا صابات الحساسية والربوفي السنوات الا خيرة وانتشار الحالات المشجعة للا صابة بفطر Aspergillus استهدفت دراستنا الحالية عزل والتشخيص المولرفولوجي والمجهري والجزيي ي للا نواع التابعة لجنس, Aspergillus ولكون الفطريات الممرضة وفي ا غلب الا حيانتظهر تبايننا واضحا حتى بين العزلات العاي دة للنوع نفسه ) شريف,2012) لذلك تم اللجوء ا لى استخدام التقنيات الجزيي ية المعتمدة على دراسة تتابع قواعد ال DNA يف. الكشف عن وجود الا نواع في هيي تها الجسمية ا و التكاثرية كما ا نها تكشف وجود الا نواع التي لا يمكن زراعتها والتي لا تعرف با تباع طرق الفحص ا و العزل التقليدي وحتى متبقيات الفطريات الميتة ا و المنقوصة. المواد وطرق العمل العزل :تم عزل الفطريات المختبرة من حالات التهاب المجاري التنفسية السفلى (LRTIs). حيث جمعت عينات القشع من مرضى العيادة الاستشارية للا مراض الصدرية والتنفسية والذين يعانون من سعال مصحوب بقشع مستمر لمدة طويلة وغير مستجيب للعلاج, بدء ا ولا بتعقيم الفم والغرغرة بمحلول ملحي في الصباح الباكر وا خذت العينة من كل مريض ووضعت في قناني زجاجية معقمة, وا جري التحري الاولي عن وجود الفطريات با تباع الفحص المجهري المباشر وباستخدام كمية من هيدروكسيد البوتاسيوم (%KOH10). وفي نفس الوقت زرعت العينات باستخدام العيدان الخشبية المعقمة ( Swabs )با مرارها على سطح ا طباق بلاستيكية ا و زجاجية معقمة حاوية على الوسط الغذاي ي Agar(SDA) SabouraudDextrose والمحضر حسب تعليمات الشركة المجهزة Biomerieuxوالمثبتة على العبوة, وعقمت بالمو صدة بدرجة ( 121 م ) لمدة (15) دقيقة, باستخدام الطريقة المباشرة للعزل method) (Warcup, 1950) (Direct plate. وحضنت الا طباق عند درجة حرارة 28 2± م ولمدة سبعة ا يام مع المتابعة اليومية. التشخيص العزلات على مستوى النوع : ا تبعت مفاتيح التصنيف المذكورة من قبل( 2002 ) al., Quinn et و(, Hocking Pitt and 1997 )في تشخيص عزلات جنس Aspergillusوذلك بدراسة الخصاي ص الشكلية المورفولوجية والمجهرية من حيث شكل المستعمرة ولونها وقوامها ونوع الغزل الفطري والرو وس الكونيدية وشكل ولون الكونيدات وا بعادها ومن ثم ا خذت عينة من كل مستعمرة ولقحت باستخدام تقنية تلقيح الا وساط الزرعية على وسطين زرعين اساسين للتشخيص (MEA) Czapek Yeast Extract Agar (CZA) & Malt Extract Agar وحضنت هذه عند درجة حرارة 25 م و 37 م, وكذلك شخصت باستخدام تقنية الزرع على الشريحة الزجاجية (1978 al.,.(konemanet وبعد ذلك تم تشخيصالعزلات بتقنية سلسة تفاعلات البلمرة PCR تبعا لطريقة ١٨٥

3 وبعد (2009 al., (Logothetiet وكذلك استخدمتالبوادي Primersالمقترحة فيها كتشخيص توكيدي للا نواع جنس.Aspergillusspp. ا ستخلاصDNA :ا ستخلص الحامض النووي DNA من العزلات المنتخبةعلى الوسط الزرعي الصلب.DNA لاستخلاص (Bioneer) ثم ا تبعت الخطوات المثبتة والمرفقة مع العدة المجهزة منالشركة, (SDA) ذلك مزج جزء منه مع صبغة بروميد الاثيديومbromide Ethidium على هلام الا كاروزالمحضر بتركيز % 1.5 في (100) مل محلول داري TEB Buffer بتركيز ( 1X )ملى مولار المجهز من شركة Basic) (Bio لغرض التا كد من نقاوته بطريقة الترحيل الكهرباي ي. تحضير محلول التفاعل لسلسلة تفاعلات البلمرة :PCR ح ضر مزيج التفاعل (بحجم 50 مايكرو ليتر) لسلسلة تفاعلات البلمرة با تباع الخطوات المثبتة والمرفقة مع العدة الشركة ( Bioneer )وكالاتي: ح ضر AccuPowerالمجهزة PCR PerMix مزيج التفاعلفي ا نابيب AccuPower PCR PerMix tube البلمرة مع ا ضافة المكونات الاخرى لمزيج من الحاوية على مكونات تفاعل ا نزيم التفاعل. للجينات الاربعة الخاصة بالا نواع جنس spp. Aspegillus قد تم تجهيزها من شركة.(Bioneer) بعد ا كمال تحضير مزيج تفاعل ا نزيم البلمرة تم غلق الا نابيب مع المزج بعناية بجهاز Thermocyclerمن نوع لمدة Vortex Gencyclerلتفاعل 5 ثوان, ونقلت ا نزيم الا نابيب الى جهاز المضخم الحراري البلمرة لا جراء عملية التضخيم DNA Thermo cycling ا ن تم برمجته على وفق الظروف المثلى للدورات الحرارية Amplifation)DNA )بعد,(Logotheticet al., (2009 لما ورد في conditionsطبقا البادي ات الDNA (DNAPrimers) نوع البادئ تسلسل القواعد النیتروجینیة ('5 3') حجم ناتج التضخیم 150 bp F R CCA GTA CGT TGG TCT TCA ACT C CAT CAC CAT GAC CAT CGT TTG CT PEPI 200 bp F R CGA CGT CTA CAA GCC TTC TGG AAA CAG ACC GTC ATT GTT CTT GTC PEPO 250 bp F R TAT GTC TTC CCC TGC TCC CTA TGC CTG AGG GGC GAA PEX 450bp F R CTA TTG TAC CTT GTT GCT TCG GCG AGT TGC AAA TAA ATG CGT CGG CGG ATA الترحيل الكهرباي ي لناتج تفاعلات البلمرة: مزج (10) مايكرو ليترمن نواتج تضخيم الجينات مع (3) مايكرو ليتر من داري التحميل bufferعلى loading سطح صفيحة زجاجية نظيفة. رفع المزيج بواسطة ماصة دقيقة الى الحفرة المخصصة في هلامالا كاروز بتركيز 1.5 %,حيث رحلت النماذج كهرباي يا بفولتية مقدارها 80 فولت وب 100 ملي ا مبير ولمدة 55 دقيقة لتحديد الحجوم الجزيي ةللDNA المستخلص والمضخم والذي يمثل نواتج ( PCR ).بالمقارنة مع القياسي ), bp)dna Ladder وبعد ذلكورفعت صفيحة الهلام ١٨٦

4 صندوق الا شعة فوق نانوميتر بواسطة (320) فوق البنفسجية بطول موجي من الجهازوعرضتللا شعة البنفسجية, والتقطت صورة الهلام باستخدام كاميرا. Sensitivity الاختبارات حساسية تقدير :تم التشخيص الاختبارات وخصوصية حساسية ٣.حساب وخصوصيتهSpecificityبالاعتماد على (1986, (Thrusfield وبالشكل التالي : المجموع نتاي ج الزرع الفطري Negative Positive الفحص المجھري (KOH) a + b B A Positive c + d D C Negative a+c+b+d b + d a + c المجموع الحساسية = وهي قابلية الاختبار على الكشف عن حالات الموجبة للنمو الفطري وتحسب بالمعادلة التالية : الكشف عن الحالات السالبة للنمو الفطري وتحسب (c+a)/a الخصوصية = وهي قابلية الاختبار على بالمعادلة التالية : (d+b)/d. النتاي ج والمناقشة اولا : ا ظهرت نتاي ج الفحص المجهري المباشر( KOH(10% نتيجة موجبة لتحري الا ولي عن جنس قشعمقابل ( 370 )عينة سالبة من المجموع الكلي للعينات والبالغ (406) عينة Aspergillusفي (36) عينة قشع, وتم اختبار حساسية الفحص بالمقارنة بنتاي ج الزرع المختبري. فبلغت نسبة حساسية الفحص المجهري المباشر (% 7.29), في حين بلغت خصوصية الفحص (% )وكما مبين في الجدول (4). جاءت النتاي ج مطابقة معما توصلت اليه( 2005 ), Al-Ameri في كون الفحص المجهري المباشر لا يمكن الاعتماد عليه في اختبار كشف عن وجود ا و عدم وجود الفطريات (2000, Niazi )وا ن ظهور بعض نتاي ج السالبة ا و الموجبة كاذبة بالفحص المجهري المباشر يعود ا لى عدة ا سباب منها ظهور فطريات ا خرى مثل التي قد تربك الفحص ا و تعطي تشخيصا خاطي ا, وقد sp. Pseudallescheria و sp. Scopulariopsis تكون ناتجة عن البكتيريا اللاهواي ية وليست ا صابه فطرية, ا و وجود المايكوبلازم وغيرها من المسببات, ا ضافة ا لى احتمالية حدوث الخطا التجريبي, لذا فا ن عزل الفطر على الوسط الزرعي يوفر وسيلة مفيدة جدا من ا جل التشخيص ) al.,2006.(batra et جدول (4): نتاي ج الفحص المجهري والزرع الفطري لعينات القشع. المجموع نتاي ج الزرع الفطري الفحص المجھري المباشر Negative Positive (KOH) Positive Negative المجموع ثانيا :نسبة الا صابة بفطر Aspergillus وا نواعه المعزولة اعتمادا على نتاي ج الفحوصات المظهرية, المزرعية منهاوالمجهريةفي تشخيص العزلات اثبتت (107) عزلة عاي ديتهاا لى حنسAspergillusتعود ا لى (96) عينة قشع,وذلك بعد تنميتهاعلى وسط (CZA) وبالاعتماد على المفاتيح التصنيفية المعتمدة في عدد من المراجع ومنها (2002) al., Quinn et و( Pitt and 1997), Hocking,وبذلك يكون جنس. spp Aspergillusقد شكل نسبة ظهور (26.35 %) من المجموع ١٨٧

5 و) الكلي للعينات والبالغة (406) عينة, وبنسبة تكرار (%28.08) من المجموع الكلي للعزلات الفطرية والبالغة (381) عزلةفطرية.وهذا بدوره يعتبر مو شر عامل خطورة صحية قد يكون له دور في تفاقم الحالات المرضية الري يسة وظهور ا عراض التحسس لدى مراجعي العيادة الاستشارية للا مراض التنفسية والصدرية, حيث كان ثاني ا كثر الا جناستكرارا بعد الخماي ر مما يشير كذلك ا لى دورها في ا حداث التهاب الجهاز التنفسي الفطري والذي قد يكون محدد ا و ا دنى مما للفطريات الخيطية خاصة وا ن خميرة Candida من المستوطنات الطبيعية لتجويف المجاري التنفسية مما يفسر ظهور الخماي ر با عداد عالية (الشبلي, 2006 ). كما موضح بالشكل (1). وا ن نسبة العزل لجنسAspergillusالمسجلة بالدراسة الحالية سبق وا ن سجلت في دراسة Al-) Ameri( 2005 والتي ا جرت دراسة عن مسببات الالتهابات الري وية في محافظة الديوانية, كذلك تتفق النتاي ج مع دراسة (الغالي, 2006) و(الجناحي, 2012), وقد بينت العديد من الدراسات حول العالم ا ن الفطريات الرمية هي التي تسود في الجهاز التنفسي ومنها ما ذكره (عبود, 2006) ويعود ذلك ا لى طبيعة نمو هذه الا حياء حيث تعتبر القناة التنفسية مكان مناسب لنموها فهو مكان رطب ودرجة حرارة مناسبة مع وجود المغذيات فضلا عن العوامل المو هلة كانسداد الري وي المزمن و السكري و الاستخدام المفرط للمضادات الحياتية 2011) al., (LeonarRocioet الشكل (1) النسبة المي وية لتردد الا صابة الفطرية في عينات القشع. ا ما على المستوى الا نواع التابعة لجنس Aspergillus سجل الفطرA.fumigatus ا على نسبة مي وية كانت للا صابة وكانت( %29.9 ( وتلاه الفطر A.niger بنسبة (%28.9) في حين سجلflavus. Aو.A terreus نسبة %18.69) (%12.14) على التوالي, وا ن سيادة هذه الا نواع الاربعة جاءت مطابقة لما وجدته (2005,Al-Ameri( كما تم في هذه الدراسة عزل الفطريات.A parasiticus,.a ochraceus للمرة الا ولى على المستوى المحلي في عينات القشع وبذات النسبة التي سجلها عبود (2006) في محافظة ذي قار, وكذلك سجل ا قل نسبة عزل للنوعين. 0.93)A %)وللمرة ustus, A.penicillioides الا ولى في محافظة الديوانية من حالات التهاب الجهاز التنفسي, ومن الضروري ا حداث الا صابة التجريبية بهذه الفطريات مستقبلا للتا كد من ا مراضيته وعومل الضراوة التي تمتلكها. كما مبين بالجدول (١) والشكل (2). ١٨٨

6 جدول (١) : المجموع الكلي والنسبة المي وية للا نواع جنس Aspergillus المعزولة خلال الدراسة من المرضى القناة التنفسية النسبة المي وية للتكرار(%) عدد العزلات أنواع جنسMicheliexLinkAspergillusالمعزولة AspergillusfumigatusFersenium Aspergillusniger Van Tieghen Aspergillusflavus Link & Fries Aspergillusterreus Thon Aspergillusnidulans(Eidam) Wint AspergillusochraceusK.Wilh AspergillusparasiticusSpeare AspergilluspenicillioidesSpegazzini Aspergillusustus(Bainier)Thom & Church مجموع العزلات الكلي الشكل (2) النسبة المي وية لتردد الا نواع التابعة لجنس Aspergillus في عينات القشع. ثالثا : التشخيص ا لتوكيدي بطريقة الPCR لبعض العزلات : ا ن اعتماد الطريقة التقليدية لتشخيص الا عفان ومنها جنسAspergillus, spp. والقاي مة على تحديد المعاير المورفولوجية, لم تعد كافية بسب تداخل هذه المعاير مع غيرها من الا نواع التي تصنف ضمن الانواع الا خرى لجنس Aspergillus والتي تزيد عن 300 نوع (1994, (Samson, فضلا عن التباين الوراثي فيما بينها, فمزارع الا حياء المجهرية وا ن انتمت ا لى المجموعة نفسها تتباين وراثيا في خصاي ص ١٨٩

7 نموها وصفاتها المورفولوجية, ولا يعني التباين بالضرورة الاختلاف في البناء الوراثي لاسيما بين المزارع والعزلات التي تنتمي ا لى الجنس والنوع ذاتها بل قد يكون نابع عن استجابة المزارع ا و العزلات للظروف البيي ية (محي الدين وجيجان, 2013). لذا فقد قمنا في هذه الدراسة بتشخيص الجزيي ي لما يربو عن (20). Aفوجد niger, A. fumigatus, A. flavus, A. terreus ا ن عزلة نقية عاي دة ا لى حجوم نواتج تضخيم للجينات المدروسة RFLP للا نواع المنتخبة قد بلغت 150, 200, 250, 450 زوج قاعدة نيتروجينية لكل نوع على التوالي, مما ا عطى فرصة التميز بينها. كما موضح فب الشكل (4) و (5). واتفقت نتاي ج هذه الدراسة مع ما وجده (2009 al., Logotheticet )الذي تمكن من دراسة (59) عزلة من جنس spp. Aspergillus تعود ا لىستة ا نواع مختلفة, من بينها (13) عزلة تعود الى A.niger و( 17 ) عزلة.A fumigatus و (16) عزلةflavus.A و (8) عزلاتterreus. Aوباستعمالبوادي لجينات معينة Primers لجينات معينة, انه يمكن التميز بين هذه الا نواع بتحليل نواتج تضخيم amplicons هذه الجينات بطريقة PCR من خلال الترحيل الكهرباي ي. الشكل( 3 ) :: الترحیل الكھرباي يللDNA على هلام الاكاروز. ١٩٠

8 الشكل (4) نواتج تضخيم الجينات ATE) ( PEP, PEX, لعزلات الفطر spp. Aspergillus با ستعمال, PEP,PEX تقنية PCR.العزلات (1,2,3,4,5) العاي دة للفطر.A niger ا ظهرت نتيجة موجبة لجين العزلات( ) العاي دة للفطرA.fumigatus ا ظهرت نتيجة موجبة لجين والعزلات( 11,12,13,14,15 ) العاي دة للفطر A.terreus ا ظهرت نتيجة موجبة لجين ATE الشكل (5): نواتج تضخيم الجين (PEPO) لعزلات الفطر. Aspبا ستعمال flavus تقنيةPCR. Single المصادر : ا سماعيل, محمد طاهر,عبير الكفري ( 2008 ).كتاب الطفيليات والفطور الطبية, منشورات جامعة دمشق كلية الطب البشري.( 458 صفحة). الجناحي, فرقد عبد الا له الجناحي (2012). تا ثير مستخلصات نبات البنبرCordiamyxaفي نمو الفطريات المعزولةمن مرضى الا خماج الري وية في مدينة الديوانية. رسالة ماجستير, كلية التربية جامعة القادسية. الشبلي, ماجد كاظم عبود( 2006 ). تا ثيرات العزلات السريرية لخميرة المبيضات Candida albicans دراسة بايلوجيةونسيجية مرضية في محافظة الديوانية. ا طروحة دكتوراه-جامعة القادسية. شريف, فياض محمد شريف (2012). الفطريات الطبية. الذاكرة للطباعة والنشر. (468 صفحة). الغالبي, حيدر حبيب حطيحط (2006). التا تيراتالخلطية لبعض المضادات الفطرية ومستخلصات نبات الثوم والا س تجاهبعض الفطريات الري وية الا نتهازية. رسالة ماجستير, كلية التربية جامعة القادسية. عبود, ميثاق ستار (2006). دراسة بعض الجوانب البايولوجية للفطريات والخماي ر الا نتهازية المعزولة من عينات سريرية مختلفة من مستشفى الناصرية العام محافظة ذي قار. رسالة ماجستير, كلية التربية جامعة ذي فار. ١٩١

9 محي الدين, محمد عمر ورقيباء علي جيجان (2013). ا نتاج ا نزيم POLGALACTYRONASE من عفن Aspergillusnigerالمتحمل للحرارة والمنتجة للا نزيم وتشخيص العزلة الا كثر ا نتاجا. مجلة العلوم الزراعية العراقية العدد 1 -المجلد 44 ص Al-Ameri,N.O.(2005).Astudy of taxonomy Epidemiolory of pulumonarymycoticin fectionin Al-Qadisyia Province.Ph.D.Thesis.Collage of Education -Al- QadisyiaUniversit Alpsoy, L.(2010). Inhibitory effect of essential oil on aflatoxin activities. Afr. J. Biotechl.,9(17); p. Batra, V.,B. Asmar and J. Y. Ang. (2006). Aspergillosis. emedicine D:/Medical Mycology/eMedicine-Aspergillosis Article by VandanaBatra MD.htm. Collee, J.G. ; Fraser, A.G.; Marmion, B.P. & Simons,A.(1996). Practical medical Microbiology.4 th ed. Churchill Livingston. New York.978p. Ines, F.M.; Almedia,H.M.; Lourdesrdes, M.;Sara,M.O.;Santos,M.S.; Freitas, J.M.;Gasper, N.C.& Fernando, (2011). Mycobiot and aflatoxin B1 In feed for farmed sea Bass.Koneman, E.W.;Roberts, g.d.;& Wright, S.H.(1978). Practical Laboratory mycology. The Williams & Wilkins Company Baltmore, U.S.A. Leonar, R.E. C.& Rocio, o. (2011). Malaurtiration and Gastrointestestional and Respiratory Infection in children : Apublic healthy problem p. Logotheti,M.;A.Tseleni ; G.,Arseenis, and N., Legakis. (2009). Multiplex PCR for the discriminatioation of A. fumigatus A. flavus,a, niger and A. terreus. Journal of Micobiologgical methods. 79; p. Niazi,A.D.(2000). Statistical Analysis In Medical Research. Republic of Iraq. AL.- Nedrien university. Obrien, H. E., J. L. Parrent, J. A. Jackson, J-M. Moncalvo and R. Vilgales. (2005). Fungal Community Analysis by Large-Scale Sequencing of Environmental Samples. Appl Environ Microbiol.,71(9): Pitt, J.I. and A.D.,Hocking (1997). Fungi and food Spoilage. Blackie Academic professional, p. Prescott, C.M.;Harley, J.P.;Klein,D.A.(2005). Micobiology. 6 th edn., Mcgraw-Hill Companies., U.S.A. 924p Quinn, P.J.; Carter. M.G.; markey, B.&Carter, G.R.(2002). Clinical Veterinary Microbiology, M. Wlof, London. Samson, R.A.(1994). Current systematics of the genus Aspergillus.In the genus Aspergillus. From Taxonomy and to industrial Application. Plenum press, London ; Thrusfield, M.(1986). Veterinary epidemiolory, Butterworth &Co.Ltd, London Wilkins, R.L.:Dextex, J.R. and Gold, P.M. (2007). Respiratory Disease Case Study Approach to Patient Care. 3 rd ed.f.a.davis Company. California. Warcup, J.H.(1950). The soid plate method for Isolation of fungi from soid. Nature Iondo. 66: p. ١٩٢