Microsoft Word - 382

النسخ

1 الصدمة الحرارية تحفز محتوى األحماض النووية والبروتينات والفعالية النوعية ألنزيمات بناء نيوكليوتيد الثايمين في كالس سيقان السمسم.L Sesamum indicum Heat shock enhanced nucleic acids, proteins content and specific activity of thymine nucleotide biosynthetic enzymes in stem callus of Sesamum indicum L. نھال عزت الطائي ساجدة عزيز عبود قسم علوم الحياة /كلية العلوم / جامعة الموصل *قسم علوم الحياة/ كلية التربية / جامعة الموصل مزاحم قاسم المالح* Nihal E. Al- Taee Sajida A. Abood Mozahim K. Al-Mallah* Dept. of Biology/ College of Science/ University of Mosul *Dept. of Biology/ College of Education/ University of Mosul المستخلص أظھرت نتائج الدراسة الحالية أن تعريض الكالس المستحدث من سيقان السمسم النامي في الوسط المغذي MS الحاوي على توليفة منظمات النمو ) BA (1.mgL -1 NAA +. mgl -1 للدرجات الحرارية م بنمط الصدمة قصيرة المدى لمدة 5 أو 1 دقيقة والطويلة المدى لمدة 15 أو دقيقة حصول تغييرات مرغوبة في نموه وانعكاسھا في زيادة كمية األحماض النووية DNA و RNA والمحتوى البروتيني وتحفيز الفعالية النوعية إلنزيمات الثاميدليت سنثيز TS والداي ھيدروفوليت ريدكتيز DHFR والسيرين ھيدروكسي مثيل ترانسفيريزSHMT. وتفوقت المعاملة 4 م/ 15 دقيقة في تأثيرھا اذ سجلت كمية الحامض النووي 95 DNA مايكروغرام/غرام وزن طري والحامض النووي 949 RNA مايكروغرام/غرام وزن طري زيادة واضحة قياسا بنظيراتھا من RNA DNA في المقارنة الحاوية 58 مايكروغرام DNA /غرام وزن طري و 55 مايكروغرام RNA /غرام وزن طري. وسجل المحتوى البروتيني.85 ملغم/غرام من وزن الكالس قياسا ب 1.47 ملغم /غرام من عينة المقارنة. وأظھرت قياسات الفعالية النوعية إلنزيمات SHMT DHFR TS مايكرومول/ دقيقة/ملغم بروتين على التوالي قياسا بعينات المقارنة 1.7 و.43 و.13 مايكرومول/ دقيقة/ملغم. بينما أدت الدرجات الحرارية 5 4 م في كلتا الصدمتين انخفاضا في وزن الكالس وفي محتواه من األحماض النووية وانحرافا سلبيا في الفعالية النوعية لإلنزيمات المشار اليھا. Abstract The present study revealed that exposure of stem derived callus of Sesamum indicum L. that grown on initiation medium Murashige and Skoog (MS) supplemented with naphthalene acetic acid (NAA 1. mg L -1 ) + benzyl adenine BA. mg L -1 to 5, 3, 35, 4, 45 or 5 C as short term heat shock sths 5,1 min. and long term heat shock lths 15, min. enhanced a desirable changes of callus growth. Moreover, the amounts of nucleic acids DNA, RNA, proteins and the specific activity of thymidylate synthase (TS), dihydrofolate reductase (DHFR) and serine hydroxy methyl transeferase (SHMT) enzymes were also increased. The heat shock treatment 4 C/15 min. gave the best effect in amount of both DNA and RNA that increased to 95 and 949 µg/g compared to control 58 and 55µg/g callus fresh weight respectively. Total protein was also increased to.85 mg/g compared to control 1.47 mg/g. Maximum specific activities of TS, DHFR and SHMT enzymes were recorded 3.41,.97,.31µmol/min/mg protein respectively compared with control 1.7,.43,.13µmol/min/mg protein. Whereas, heat shock treatments 45 and 5 C of both tearms reduced each of callus fresh weight, DNA, RNA amount, and decreased the specific activities of the above enzymes. Key words: Heat shock, Sesamum indicum L., 48

2 المقدمة : تعرف الصدمة الحرارية بأنھا ارتفاع في درجة حرارة النسيج النباتي عن الحد األمثل لنمو النبات لمدة زمنية مسببة صدمة غير عكسية في نمو النبات وتطوره ويتراوح االرتفاع في درجات الحرارة من 15-1 م. وتعبر الصدمة عن وظيفة معقدة تعتمد على درجة الحرارة ومدة بقائھا والزيادة في درجة الحرارة التي تتعرض لھا الخاليا واألنسجة النباتية [1] وذكرت المصادر التأثيرات االيجابية للصدمة الحرارية في عدد من األنظمة النباتية وتحفيزھا للمسارات األيضية في الخاليا متمثلة في بناء بروتينات جديدة وتراكمھا في أوراق الشعير يطلق عليھا بروتينات الصدمة الحرارية (HSPs) [] Heat Shock Proteins ويحفز بناءھا في جميع الكائنات ابتداء من البكتريا إلى اإلنسان وأطلق عليھا بالبروتينات المحافظة وصنفت اعتمادا على أوزانھا الجزيئية إلى ست عوائل HSP1) small heat shock proteins17-3 KDa. 8-5) و HSP6 HSP7 HSP9 Chaperonins (shsps [3]. وتكمن وظيفتھا في حماية الخاليا من الصدمة الحرارية من خالل منع مسخ البروتينات أو عدم تغيير شكلھا الثانوي أو الثالثي [4] وعموما تستجيب النباتات لتأثيرات الصدمة الحرارية بإحداث تغييرات بايوكيميائية وجزيئية تتضمن انجاز مختلف العمليات الميكانيكية للحفاظ على استقرارية األغشية وإنتاج إنزيمات مضادات األكسدة ومنھا المواد المثبطة (الكاسحة) ل( ROS ) Reactive oxygen species او الجذور الحرة الناتجة في ظروف اإلجھاد أو الصدمة وتحفيز إنزيمات (MAPK) Mitogen activated protein kinase و( kinase(cdpk Calcium-dependent protein وتحفيز اإلشارات المرافقة لعمليات االستنساخ التي تنظم عند المستوى الجزيئى وتجعل النبات قادرا على النمو بقوة تحت ظروف الصدمة [5 6]. ي بنى نيوكليوتيد الثايمين (dtmp) بمسار الدي نوفو بتحويل dump إلى dtmp بوجود إنزيمات متضمنة (TS) و (DHFR) و (SHMT) و المركبات المشتقة من حامض الفولك متضمنة التتراھيدروفوليت (THF) والداي ھيدروفوليت (DHF) و N 5 N, 1,methyleneTHF في دورة إضافة المثيل. وقد درست إنزيماتھا في الخاليا الحيوانية واألحياء المجھرية لكونھا أحد أھداف المعالجة الكيميائية لألورام السرطانية [4] وسجلت دراسات محدودة لتلك اإلنزيمات في نباتات الخس[ 7 ]. وان تعريض نباتات فول الصويا الى الدرجات الحرارية من 8-4 م شجع بناء عدد كبير من بروتينات الصدمة الحرارية [8] shsps كما إن تعريض البروتينات المتواجدة في أوراق وأزھار الشليك للدرجات الحرارية 4 م 3 مدة 4 ساعات كشفت عن تواجد بروتينات جديدة صنفت ضمن مجموعة shsps وغيابھا عند تعريضھا لدرجة 4 م [9]. وأكدت احدى الدراسات [1] تباين القابلية الوراثية للخاليا في بناء بروتينات الصدمة الحرارية في نباتات الحنطة والشعير والذرة والبطاطا. فضال عن أن تأثير الصدمة الحرارية يكم ن في زيادة نفاذية الجدر الخلوية أو تحفيز بناء بروتينات خاصة في أنسجة نبات زھرة الشمس [11] أو تحفيز بناء بروتينات جديدة في أوراق نباتات الشعير والذرة البيضاء []. ھدفت الدراسة الحالية إلى التحري في أنسجة كالس السمسم عن وجود مسار denovo لبناء نيوكليوتيد الثايمين احد نيوكليوتيدات بناء DNA بداللة قياس فعالية إنزيمات دورة إضافة المثيل المھمة لبناء ال dtmp وتحديد تأثيرات الصدمة الحرارية في نشاط ھذه اإلنزيمات وكميات االحماض النووية والبروتينات. المواد وطرائق العمل : أستحثاث مزارع كالس السيقان ع قمت بذور السمسم صنف محلي/ أبيض اللون بغمرھا في الكحول األثيلي %96 لمدة دقيقتين متبوعا بغمرھا في محلول 3 %ھايبوكلورات الصوديوم( NaOCl ) لمدة 5 دقائق بعدئذ غسلت البذور أربع مرات بالماء المعقم نقلت البذور المعقمة سطحيا إلى دوارق زجاجية سعة 1 مل حاوية على 5 مل من وسط Arnon وHoagland الصلب [1] ح ضنت العينات في الظالم في حاضنة النمو عند ±3 م وحين مباشرتھا باإلنبات حفظت النبيتات في ظروف إضاءة شدتھا لوكس وبتعاقب 8/16 ضوء/ظالم ساعة للحصول على بادرات معقمة. قطعت إلى قطع بطول 1.5 سم من سيقان بادرات السمسم المعقمة بعمر 15-1 يوما وزرعت على وسط موراشيج وسكوك [13] MS الحاوي 3 %سكروز والمدعم بإضافة مستويات منتخبة من NAA1.mgL وBA.mgL وحفظت المزارع في الحاضنة لمدة 3 يوم تحت الظروف المشار أليھا في أعاله. تعريض كالس السيقان للمعاملة الحرارية أخذت مجموعة من عينات الكالس بعمر 3 يوم وبوزن غرام واحد لكل منھا ووضعت في قنان زجاجية معقمة سعة 1 مل وعرضت في المعاملة األولى إلى الدرجات الحرارية 5 م وعند مدة التعريض (5 1) دقائق وسميت الصدمة الحرارية قصيرة المدى وفي المعاملة األخرى عرضت إلى الدرجات الحرارية ذاتھا 49

3 لمدة 15 دقيقة وسميت الصدمة الحرارية طويلة المدى [14]. أستخدم حمام مائي مثبتة حرارته مسبقا عند الدرجة المطلوبة لكل من المعاملتين وبعد انتھاء مدة التعريض رفعت العينات ووضعت مباشرة في بيكر حاو ماء بدرجة حرارة الغرفة لخفض حرارتھا وبعد االنتھاء من تعريض جميع العينات حسب طريقة العمل زرعت عينات الكالس وعينات المقارنة في وسطMS المذكور في أعاله. قياس الفعالية النوعية لإلنزيمات الداخلة في بناء dtmp في المستخلص المائي للكالس أخذت عينات كالس بوزن ثالثة غرام /عينة من المزرعة الفتية للكالس المعرض للصدمة الحرارية النامي على وسط االستحثاث بعمر 6 يوما وسحقت كل عينة بصورة مستقلة في ھاون خزفي مبرد في درجة - 4 م وأضيف إليھا 3 مللتر من محلول 5mM Potassium phosphate buffer وبدالة حامضية 7 مضافا إليھا %.56 من.N-acetyl cysteineأكمل سحق وتحطيم الخاليا بتسليط ذبذبة/ ثانية ولمدة نصف دقيقة بوساطة جھاز الترددات فوق الصوتية PG-1545) (Romany وفصل الرائق عن الراسب عند طردھا مركزيا REF146, (Hettich, deep في ظروف تبريد بسرعة 9 دورة/ دقيقة ولمدة ساعة وحفظ الرائق في درجة حرارة - 6 م في Germany) freez الستخدامه في التجارب الالحقة. قياس فعالية أنزيمات دورة اضافة المثيل إنزيم الثايميدليت سنثيز (EC ( TS قيست فعالية ھذا اإلنزيم من الزيادة في قيم االمتصاص الضوئي للمحلول عند الطول الموجي 34 نانوميتر بوجود الديوكسي يوربدين أحادي الفوسفيت (dump) كمادة أساس والتتراھيدروفوليت (THF) كعامل مساعد وبوساطة المطياف الضوئي 33UV.) (APEL PD- عند 1 / 3 دقائق [15]. وحددت وحدة فعاليته على أنھا كمية اإلنزيم الالزمة إلنتاج مايكرومول واحد من مادة DHF خالل دقيقة واحدة من التفاعل باستخدام معامل االمتصاص الضوئي ل.[16] M -1 Cm والمساوي إلى -1 DHF إنزيم الداي ھيدروفوليت ريدكتيزDHFR (EC ( قيست فعالية اإلنزيم بالطريقة القياسية [17] من معرفة االنخفاض الحاصل في االمتصاص الضوئي لمحلول التفاعل عند الطول الموجي 34 نانوميتر بوجود مركب (DHF) كمادة أساس ومركب (NADPH) كمانح للھيدروجين. حددت الفعالية بالمطياف الضوئي عند 1 / 3 دقائق وتمثل وحدة الفعالية النوعية لإلنزيم كميته الالزمة ألكسدة مايكرومول واحد من NADPH خالل دقيقة واحدة من التفاعل باستخدام معامل االمتصاص الضوئي لمادة.[16] M -1 Cm والمساوي إلى -1 NADPH إنزيم السيرين ھيدروكسي ميثايل ترانسفريزSHMT (EC (.1..1 قيست فعالية ھذا اإلنزيم من تحديد انخفاض االمتصاص الضوئي للمحلول عند الطول الموجي 98 نانوميتر بوجود السيرين مادة أساس ومادة THF عامال مساعدا [ 18 ]. قيست فعالية اإلنزيم بالمطياف الضوئي عند 3 1 دقائق / على أساس ان فعالية اإلنزيم تمثل كمية اإلنزيم الالزمة لتحويل مايكرومول واحد من THF إلى -1,5 methylene THF خالل دقيقة واحدة من التفاعل. باستخدام معامل االمتصاص الضوئي لمادة THF والمساوي إلى -1 Cm 1 3 M -1 8.[19] - تقدير كمية األحماض النووية الكلية حددت الكمية الكلية لألحماض النووية [] المستخلصة من كالس السمسم المعتمدة إليقاف فعالية إنزيم Nuclease وترسيب األحماض النووية بنوعيھا DNA وRNA وحدد التركيز الكلي لألحماض النووية بالمقارنة مع المنحني القياسي لألحماض النووية لخاليا الخميرة النقية. وحددت كمية [1] DNA من تقدير كمية السكر فيه وحدد تركيز ھذا الحامض باالعتماد على المنحنى القياسي المحضر من Calf thymus DNA وحددت كميةRNA من الفرق بين الكمية الكلية لألحماض النووية وكمية الحامض.DNA 3- تقدير البروتين الكلي في نسيج الكالس: استخدمت الطريقة المتبعة من قبل Pollack وSkacterle [] في تقدير البروتين في مستخلص نسيج الكالس واستعمل البومين مصل البقر( BSA ) بوصفه محلوال قياسيا. 4- تقدير الوزن الطري للكالس: أحتسب الوزن الطري للكالس النامي على وسط MS من فرق وزن القناني الزجاجية حاوية على الوسط الغذائي فقط ووزنھا بعد زرع الكالس المعرض للصدمة الحرارية بعد 3 يوما من تعريضھا. النتائج: تأثيرات الصدمة الحرارية في المحتوى الكلي من األحماض النووية DNA و RNA والفعالية النوعية إلنزيمات SHMT, DHFR, TS 5

4 م) أشارت النتائج عموما ان الصدمة الحرارية بنمطيھا القصيرة والطويلة حفز ت كمية األحماض النووية DNA وRNA في خاليا الكالس بعد 3 يوما من تعريضھا. وأشارت البيانات الى زيادة كميتھا مع زيادة أمد التعريض لدرجات الصدمة الحرارية جدول (1). دقائق 5 جدول (1): تأثيرات تعريض كالس سيقان السمسم.L Sesamum indicum للصدمة الحرارية قصيرة المدى (sths) لمدة في فعالية إنزيمات بناء نيوكليوتيد الثايمين وكمية األحماض النووية كمية األحماض النووية * الفعالية النوعية إلنزيمات الخطأ القياسي المعاملة ) / 5 قائق) DNA مايكروغرام غم RNA مايكروغرام غم SHMT DHFR 53 a 544 b المقارنة a 546 b a 575 a a 577 a a 58 a b 465 c g b 36 d * :TS كمية اإلنزيم الالزمة إلنتاج مايكرومول واحد منDHF \ دقيقة \ ملغم بروتين.* :DHFR كمية اإلنزيم الالزمة ألكسدة مايكرومول واحد من \ NADPHدقيقة \ ملغم بروتين. :SHMT* كمية اإلنزيم الالزمة لتحويل مايكرومول واحد من THF الى \ MethyleneTHF دقيقة \ ملغم بروتين. كل قيمة تمثل معدل ثالثة مكررات. TS كما ح ف زت الفعالية النوعية إلنزيمات SHMT DHFR TS عند الدرجات الحرارية التي تراوحت من( 5-4 فقط بينما أدت الدرجتين( 45 5 )م في كلتا الصدمتين انخفاضا واضحا في كمية األحماض النووية والفعالية النوعية لإلنزيمات أعاله. وإن مدة التعريض خمسة دقائق حققت أعلى كمية للحامض النووي DNA عند الدرجة 4 م قياسا بالمقارنة مترافقة مع زيادة كمية RNA والى حصول قفزة في الفعالية النوعية إلنزيم TS قياسا بعينة المقارنة وكذلك الحال بالنسبة إلنزيمي DHFR وSHMT وتشير األحرف المتشابھة عموديا إلى عدم وجود فروقات معنوية عند مستوى.1 >احتمالية بين المتوسطات باختبارDMRT. ويستعرض جدول () البيانات المتعلقة بالتأثيرات االيجابية للمعاملة / 1 دقيقة. 4 جدول (): تأثيرات تعريض كالس سيقان السمسم.L Sesamum indicum للصدمة الحرارية قصيرة المدى (sths) لمدة 1 دقائق في فعالية إنزيمات بناء نيوكليوتيد الثايمين وكمية األحماض النووية المعاملة ) / 1 دقائق) * الفعالية النوعية إلنزيمات الخطأ القياسي RNA مايكروغرام غم SHMT DHFR TS كمية األحماض النووية DNA مايكروغرام غم 57 b 546 c المقارنة ab 55 c ab 585 b b 59 b a 61 a c 436 d d 41 e * :TS كمية اإلنزيم الالزمة إلنتاج مايكرومول واحد منDHF \ دقيقة \ ملغم بروتين.* :DHFR كمية اإلنزيم الالزمة ألكسدة مايكرومول واحد من \ NADPHدقيقة \ ملغم بروتين. :SHMT* كمية اإلنزيم الالزمة لتحويل مايكرومول واحد من THF الى \ MethyleneTHF دقيقة \ ملغم بروتين. كل قيمة تمثل معدل ثالثة مكررات. إذ حققت زيادة في كمية DNA من 57 إلى 64 مايكروغرام غم مقترنة بزيادة ملحوظة لكمية RNA من 546 الى 61 مايكروغرام غم وزن طري كالس. وسجلت إنزيماتSHMT, TS,DHFR نشاطا قيمته مايكرومول/دقيقة/ملغم بروتين على التوالي قياسا ب مايكرومول/دقيقة/ملغم بروتين لعينة المقارنة 51

5 عند المعاملة ذاتھا. وتعكس البيانات الواردة في جدول (3) تأثير الصدمة الحرارية عند خمسة عشر دقيقة إذ سجلت كمية 95 DNA مايكروغرام غم عند 4 م متفوقة على كميته في معامالت الصدمة الحرارية قصيرة المدى وكذلك الحال بالنسبة لكمية.RNA كما سجلت زيادة واضحة في الفعالية النوعية إلنزيمات TS, DHFR, SHMT وبالذات إنزيم TS متجاوزة فعاليته في معامالت الصدمة قصيرة المدى. جدول (3): تأثيرات تعريض كالس سيقان السمسم.L Sesamum indicum للصدمة الحرارية طويلة المدى( lths ) لمدة 15 دقيقة في فعالية إنزيمات بناء نيوكليوتيد الثايمين وكمية األحماض النووية. * كمية األحماض النووية المعاملة الفعالية النوعية إلنزيمات الخطا القياسي ) / 15 دقيقة) DNA مايكروغرام غم RNA مايكروغرام غم SHMT DHFR 58 c 55 e المقارنة c 573 d bc 59 c b 65 b a 949 a d 445 f e 38 g * :TS كمية اإلنزيم الالزمة إلنتاج مايكرومول واحد منDHF \ دقيقة \ ملغم بروتين.* :DHFR كمية اإلنزيم الالزمة ألكسدة مايكرومول واحد من \ NADPHدقيقة \ ملغم بروتين. :SHMT* كمية اإلنزيم الالزمة لتحويل مايكرومول واحد من THF الى \ MethyleneTHF دقيقة \ ملغم بروتين. كل قيمة تمثل معدل ثالثة مكررات. TS بينما تشير البيانات الواردة في جدول (4) إلى ارتفاع مؤشرات الفعالية االنزيمية تحت الدراسة وكمية األحماض النووية عند درجة حرارة 4 م وفي زمن مدته دقيقة مع مالحظة حصول انخفاض معنوي في كمية DNA عند 5 م حيث بلغت ادناھا 7 مايكروغرام غم بينما كمية RNA بلغت 75 مايكروغرام غم عند درجة 5 م ولجميع اوقات التعريض قياسا ب 56 و 54 مايكروغرام غم على التوالي لعينة المقارنة. جدول (4): تأثيرات تعريض كالس سيقان السمسم.L Sesamum indicum للصدمة الحرارية طويلة المدى( lths ) لمدة دقيقة في فعالية إنزيمات بناء نيوكليوتيد الثايمين وكمية األحماض النووية * المعاملة الفعالية النوعية إلنزيمات الخطأ القياسي كمية األحماض النووية DNA مايكروغرام غم RNA مايكروغرام غم SHMT DHER TS / دقيقة) ) 56 c 54 d المقارنة bc 545 d bc 56 c ab 595 b a 6 a d 33 e d 75 f * :TS كمية اإلنزيم الالزمة إلنتاج مايكرومول واحد منDHF \ دقيقة \ ملغم بروتين.* :DHFR كمية اإلنزيم الالزمة ألكسدة مايكرومول واحد من \ NADPHدقيقة \ ملغم بروتين. :SHMT* كمية اإلنزيم الالزمة لتحويل مايكرومول واحد من THF الى \ MethyleneTHF دقيقة \ ملغم بروتين. كل قيمة تمثل معدل ثالثة مكررات. تأثير الصدمة الحرارية في الوزن الطري للكالس ومحتواه من البروتين الكلي : أظھرت النتائج استمرار نمو الكالس مع وجود فروق مظھرية بين عينات الكالس غير المعرضة للصدمة الحرارية شكل (A) وبقية العينات النامية في نفس وسط االستحداث بعد ثالثون يوما من معاملتھا وحصول زيادة واضحة 5

6 في كتلة الكالس التي سبق تعريضھا لمعاملة الصدمة الحرارية قصيرة المدى /5 4 دقائق شكل (B) وللدرجة ذاتھا لمدة 1 دقائق شكل (C). وترتب عن ھذه الزيادة امتالء وعاء الزراعة بكتلة نسيج الكالس الذي بقي محتفظا بلونه األخضر المصفر وبنيته الھشة. ولوحظ ان تعريض الكالس لصدمة حرارية طويلة المدى /15 4 دقيقة أدت إلى زيادة حجم كتلته شكل (D) وبدأ حصول اختزال في حجم كتلة الكالس عند تعريضه للدرجة ذاتھا مع زيادة فترة التعريض الى دقيقة شكل (E). ويبدو واضحا االنحراف السلبي في حجم كتلة الكالس عند رفع درجة حرارة التعريض من 4 الى 5 م مع إبقاء مدة التعريض شكل( F-1 ). A B C D E F الشكل( 1 ): تأثيرات الصدمة الحرارية القصيرة والطويلة المدى في حجم ونمو كالس سيقان السمسم.L Sesamum indicum بعد ثالثون يوما من زراعتھا على وسط MS حاو على 1. mgl- 1 NAA و.. mgl -1 BA (A) : مزرعة الكالس بدون تعريض للصدمة الحرارية (مقارنة). (B) : مزرعة الكالس المعرض للصدمة الحرارية قصيرة المدى (4 م \5) الحظ الزيادة في حجمه. مزرعة الكالس المعرض للصدمة الحرارية قصيرة المدى (4 م \1) تطور الزيادة في حجمه بشكل اكبر مما في( A ). : (C) (D) : مزرعة الكالس المعرض للصدمة الحرارية طويلة المدى (4 م \15) الحظ كتلة الكالس الناتج. (E) : مزرعة الكالس المعرض للصدمة الحرارية طويلة المدى (4 م \) الحظ كتلة الكالس الناتج. (F) : مزرعة الكالس المعرض للصدمة الحرارية طويلة المدى (5 م \) الحظ مدى موت الكالس. وتعبر البيانات المثبتة في شكل () عن نمط التغايرات الحاصلة في الكمية الكلية للبروتينات واألوزان الطرية للكالس فقد كشفت النتائج عن اتخاذ الزيادة في االوزان الطرية لعينات الكالس التي عرضت للدرجات ( )م أنماطا مماثلة النماط الزيادة في كمية البروتينات في الصدمة القصيرة المدى/ 5 دقائق شكل ( (B,A بينما شجعت الصدمة قصيرة المدى/ 1 دقائق حصول زيادة أخرى في االوزان الطرية والبروتينات شكل.(D,C) وأرتقت المعاملة /15 4 دقيقة في الصدمة طويلة المدى في دعمھا لزيادة واضحة في الوزن الطري والبروتينات شكل (.(F,E وأدت المعاملة / 5 دقيقة الى حدوث أنحرافا سلبيا واضحا في األوزان الطرية والبروتينات شكل( ). H,G 53

7 كمية البروتين الوزن الطري A con con درجة الحرارة م البروتين ملغم/غم درجة الحرارة م الوزن الطري (غم) B con درجة الحرارة م البروتين ملغم/غم درجة الحرارة م الوزن الطري (غم) E F البروتين ملغم/غم الوزن الطري (غم) con G درجة الحرارة م H درجة الحرارة م شكل (): انعكاسات تأثير الصدمة الحرارية بنمطيھا القصيرة المدى ) A ( D والطويلة المدى ) E ( H في كمية البروتينات واألوزان الطرية لكالس سيقان السمسم.L Sesamum indicum النامي في وسط االستحداث بعد ثالثون يوما من المعاملة. ) ( : االنحراف القياسي. كل قيمة تمثل معدل خمس مكررات. المناقشة : أن الزيادة الحاصلة في كمية األحماض النووية بنوعيھا DNA وRNA والبروتين في عينات كالس سيقان السمسم التي سبق تعريضھا لمدايات من الصدمتين الحراريتين عموما من المحتمل أن تعزى إلى زيادة في بناء بروتينات الصدمة الحرارية HSPs اذ أن الخاليا النباتية تستجيب للصدمة الحرارية بزيادة تعبيراتھا الجينية التي تشفر فيما بعد بناء بروتينات الصدمة الحرارية بسبب تحفيزھا عوامل الصدمة الحرارية HSFs المتمثلة بتنشيط مجموعة جيناتHSPs [5]. فقد ذكرت احدى الدراسات [3] إن تحفيز بناء بروتينات HSPs يحصل عند تعريض خاليا المزرعة النسيجية لفول الصويا والتبغ لدرجة الحرارة بين 4-39 م. ووجدت دراسة أخرى [4] أن تعريض DNA لبذور الشليك األحمر لمعاملة الحرارة لفترة قصيرة (أقل من ساعة) أدى إلى زيادة كميتھا مقارنة مع البذور غير المعاملة وقيام عوامل الصدمة الحرارية وحامض السالسيلك بوظيفة محفزات تحمل جھد الجفاف في بعض النباتات [5]. ووجد حديثا أن الصدمة الحرارية لھا تأثير واضح في زيادة تردد التعبير الجيني في نباتات الرز [5]. وإن تعريض مزرعة الجذور الشعرية في التبغ المحولة وراثيا لصدمة حرارية تتراوح من 4-36 م لمدة ساعتين حفزت 54

8 مجموعة جينات (GUS) ß-glucuronidase [6] فضال عن زيادة في فعالية إنزيمات ) oxidase Polyphenol (PPO وPenoxidase (POD) في نبات الخس الثلجي عند تعريضھا لصدمة حرارية [7]. وقد تفسر الزيادة الحاصلة في الفعالية النوعية ألنزيمات بناء dtmp الى أن معظم التفاعالت البايوكيميائية في خاليا النبات مسيطر عليھا أنزيميا وتزداد بمعدل مرتين مع كل 1 درجات زيادة لمدى من 3- م بينما الدرجات الحرارية فوق ھذا المدى تؤدي إلى كبح سرعة التفاعل خطوة خطوة حتى يتوقف اإلنزيم فإما أن يحصل له مسخ أو يكون غير فعال.[4] وأشارت العديد من الدراسات أن النبات يمتلك أنظمة مضادة لألكسدة متمثلة بإنزيمات Ascorbate peroxidase Dehydro asconbate و (GR) Glutathion وreductase (SOD) Super oxid وdismutase (APX) Reactive oxygen species تنتج عند ظروف اإلجھاد. وھذه األنظمة تسيطر على (DHAR) reductase (ROS) أي الجذور الحرة التي تتكون في الخاليا النباتية عند استجابتھا لظروف اإلجھاد (الصدمة) ولكن ھذه المواد المضادة لألكسدة تعد مواد مثبطة أو كاسحة لھذه الجذور الحرة مسببة زيادة تحمل إجھاد األكسدة الناتجة عن الحرارة و إنتاج أنزيمات مثل أنزيمات GR وPolyaminase وتكمن األھمية الفسيولوجية في تأثيرھا في التعبير عن جينات الدفاع اذ تساھم إنزيمات GR الناتجة بفعل إجھاد الحرارة في تفاعالت األكسدة واالختزال في انقسام الخلية [6]. أن االختزال الواضح في كمية DNA وRNA والفعالية النوعية لإلنزيمات عند تعريض الكالس لدرجة حرارة 4-5 م يعزى الى أن زيادة درجة الحرارة فوق الحد األمثل لفعالية اإلنزيم يعمل على زيادة درجة التصادم بين الجزيئات مؤذيا التركيب الثالثي لإلنزيم الذي تعتمد عليه التفاعالت اإلنزيمية وتختزل فعاليته وكذلك نسبة التفاعل مما يؤثر سلبا في أنزيمات بناء dtmp األساسية في عملية بناء الحامض DNA وبالتالي عدم انقسام الخاليا. وانعكس ھذا في انخفاض معدل الوزن الطري ألنسجة الكالس. فقد أشار بعض الباحثين إلى انخفاض فعالية إنزيمات PPO و POD عند تعريض خاليا الخس الثلجي إلى درجة 5 م [7]. كما أن بناء HSPs ينخفض عند [3]. 45 أن االستنتاج الذي توصلت إليه الدراسة الحالية يكمن في أن المزارع النسيجية تمثل نظاما بديال عن النبات الكامل في تقديم التفسيرات لھذه المؤثرات الفيزيائية وعالقتھا بفعالية اإلنزيمات المشاركة في بناء. dtmp وأمكانية أستخدام الصدمة الحرارية /15 4 دقيقة كعامل فيزيائي إلحداث تغييرات داخلية في أنسجة الكالس انعكست في زيادة فعالية أنزيمات TS وDHFR وSHMT مقترنة بزيادة كمية DNA وRNA والبروتينات والوزن الطري للكالس. المصادر: 1. Maestri, E., Klueva, N., Perrotta, C., Gulli, M., Nguyen, H. J. and Marmiroli, N. (). Molecular genetics of heat tolerance and heat shock proteins in cereals, Plant Mol. Biol. 48: Clarke, A. K., and Critchley, C. (199). Synthesis of early heat shock proteins in young leaves of barley and sorghum, Plant Physiol. 94: Vierling, E. (1997).The small heat shock proteins in plants are members of an ancient family of heat induced proteins, Acta Physiol. Plant. 19: Montgomery, A., Conway, L., Spector, A., and Cappell, H. (4). Biochemistry. A Case oriented approach. St. Mosby and company. 55: Chauhan, H., Khrana, N., Agarwal, P. and Khurana, P. (11). Heat Shock factors in rice (Oryza sativa L.). Genome-wide expression analysis during reproductive development and abiotic stress. India Mol.Genet Genomics. 86 : Wahid, A., Gelan, S., Ashraf, M. and Foolad, M. R. (7). Heat tolerance in plants, An overview. Environ. and Exp. Bot. 61: محمد عبد المطلب سيد الجلبي قصي عبد القادر وعبود ساجدة عزيز. (7). عزل وتنقية جزئية النزيم الثايميدليت سينثيز من كالس الخس. Lactuca sativa L مجلة التربية والعلم المجلد (19) العدد ():.11 55

9 8. Tsung, L., J., Pi- fang, L., Ch., Yih- Ming, Ch., Joe, L.K. and Chu- Yung Lin. (1997). Tissue-Type specific heat- shock response and Immunolocalization of Class I low- molecular- weight heat- shock proteins in soybean. Plant Physiol. 114: Ledesma, N. A. and Kawabata, S. (4). Effect of high temperature on protein expression in strawberry plants. Biol. Plant. 48: Iba, K. (). Acclimative response to temperature stress in higher plants, approaches of genetic engineering for temperature tolerance. Ann. Rev. Plant Biol. 53: Coca, M.A., Almoguera, C., Thomas, T.L. and Jorano, J. (1996). Differential regulation of small heat shock gene in plant: analysis of water- stress- inducible and developmentally activated sunflower promoter, Plant Mol. Biol. 31: Arnon, D.I. and Hoagland, D.R. (1944). The investigation of plant nutrition by artificial culture methods, Biol. Rev. 19: Murashige, T. and Skoog, F. (196). A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant. 15: رشيد جميلة ھزاع و قاسم وجدان سالم. (6). دور المعاملة الحرارية في تحفيز االنقسام الخلوي وتكوين الكالس من زراعة المعلقات الخلوية لنباتات زھرة الشمس.L Helianthus annuus في قطرات االكار المتعددة. مجلة زراعة الرافدين المجلد( 34 ) العدد( 1-1:(. 15. Friedkin, M. (1963). Thymidylate Synthetase. (Ed. Mesister, A.) Adv. In Enzym. 38: Mathews, C.K., Scrimgeour, K. G. and Huennekens, F.M. (1963). Dihydrofolic Acid Reductase.( Eds.: Colowick, S. P. and Kaplau, N.O.) Meth. In Enzym. 6: Osborne, M.J. and Huennekens, FM. (1958). Enzymatic reduction of dihydrofolic acid. J. Biol. Chem. 33: Uyeda, K. and Rabinowitz, J.C. (1968). Enzymes of the clostridial purine fermentation serine hydroxymethyl transferase. Archs. Biochem. Biophys. 13: Huennekens, F.M., Ho, P.P.K. and Scrimegour, K.G. (1963). Preparation and Properties of Active Formaldehyde and Active formate. (Eds., Colowick, S.P. and Kaplau, N.O.) Meth. In Enzym. 6: Cherry, J. H. (196). Nucleic acid determination in storage tissue of higher plants. Plant Physiol. 37: Giles, K.W. and Mayer, A. (1967). Determination of DNA concentration with diphenylamine reagent. Meth. In Enzym. 1: Skacterle, G. R., and Pollack, R. L. (1973). A simplified method for the quantitative assay of small amount of protein in biological materials. Anal. Biochem. 51: Thomas B., Mitchell, A., Cari, M. and Joseph, M. (5). Heat shock induced proteins in plant cells. Devel. Genet. 1: Maura, M., and Maria L. (9). DNA integrity and germination in heat-treated strawberry achenes Electronic J. Environ. Agri. and Food Chemistry. 8: Azooz, M. M. and Youssef, M. M. ( 1 ). Evaluation of heat shock and salicylic acid treatments as inducers of drought stress tolerance in Hassawi Wheat. Amer. J. Plant Physiol., 5:

10 6. Lee, K.T, Chen, S.C, Chiang, B.L, Yamakawa and Appi T. (7). Heat inducible of beta-glucuronidase in tobacco hairy root cultures.microbio. Biotechnol.1: Ana, B. M., Daniel, R., Cathrine, B., Jemina, M., Jesus, F., and Gary, T. M. (5). Effect of heat shock on browning related enzymes in minimally processed Iceberg Lettuce and crude extracts. Biotechnol. Biochem. 69: