جمهوریة العراق وزارة التعلیم العالي والبحث العلمي جامعة بغداد كلیة التربیة للعلوم الصرفة/إبن الهیثم قسم علوم الحیاة الكشف المظهري والجزيئي ألنظمة الدف

النسخ

1 جمهوریة العراق وزارة التعلیم العالي والبحث العلمي جامعة بغداد كلیة التربیة للعلوم الصرفة/إبن الهیثم قسم علوم الحیاة الكشف المظهري والجزيئي ألنظمة الدفق Efflux Pumps في بكتريا Escherichia coli المعزولة من اصابات المسالك البولية رسالة مقدمة إلى مجلس كلية التربية للعلوم الصرفة / إبن الهيثم جامعة بغداد وهي جزء من متطلبات نيل درجة ماجستير علوم في علوم الحياة/ األحياء المجهرية من قبل زه ارء حميد علوان السعدي بكالوريوس في علوم الحياة/كلية التربية للعلوم الصرفة/ إبن الهيثم جامعة بغداد باش ارف أ.د. رنا مجاهد عبد هللاا الشويخ ربيع االول 0441 ه اذار 9102 م

2 إ ن ا ف ت ح ن ا ل ك ف ت ح ا م ب ين ا )1( ل ي غ ف ر ل ك للا م ا (( ت ق د م م ن ذ ن ب ك و م ا ت أ خ ر و ي ت م ن ع م ت ه و ي ه د ي ك ص ر اط ا م س ت ق يم ا) 2 ( (( ع ل ي ك ص د ق هللا الع ل ي الع ظ يم سورة الفتح اآلية ) 2-1 (

3 االهداء روح الى والدي الشهيد السعيد... تغمده هللا برحمته الى سندي و مصدر قوتي... امي الغالية الى رفيق دربي... زوجي الغالي الى من افتخر... بها مشرفتي الدكتورة رنا مجاهد عبد هللا الشويخ اهدي ثمرة جهدي المتواضع زه ارء

4 الشكر والتقدير والشكر الحمد هلل رب العالمين والصالة والسالم على رسول رب العالمين دمحم الصادق االمين وعلى اله وصحبه الطيبين الطاهرين. يطيب لي وقد اشرفت على اتمام رسالتي بإذن هللا ان اتقدم بجزيل شكري وامتناني الى استاذتي الفاضلة االستاذ الدكتورة رنا مجاهد عبد هللا الشويخ لتفضلها علي باقت ارح موضوع البحث واالش ارف عليه ولتوجيهاتها النيرة وارشاداتها السديدة التي قدمتها طوال مدة البحث وكتابة الرسالة فكانت خير مثال يحتذى به في البحث العلمي. كما اتوجه بجزيل الشكر الى عمادة كلية التربية ابن الهيثم والى رئاسة قسم علوم الحياة المتمثلة بالدكتور ثامر عبد الشهيد لما محسن ابدوه من مساعدة واهتمام فج ازهم هللا عنا خير الج ازء. واخي ار اتوجه بالشكر واالمتنان الى زمالئي وزميالتي من طلبة الد ارسات العليا السيما م.م. عمر سنان الزيدي ولكل من ساعدني بكلمة او فعل مقصود او غير مقصود فج ازهم هللا خير الج ازء. زه ارء حميد

5 اقرار المشرف اشهد ان رسالة الماجستير الموسومة ب ( الكشف المظهري والجزيئي عن انظمة الدفق Efflux Pumps في بكتريا Escherichia coli المعزولة من اصابات المسالك البولية ) قد اعدتها الطالبة ( زهراء حميد علوان ) وبإشرافي في قسم علوم الحياة كلية التربية للعلوم الصرفة \ابن الهيثم وهي جزء من متطلبات نيل درجة ماجستير علوم في علوم الحياة \ أحياء مجهرية. التوقيع : المشرف: د. رنا مجاهد عبد هللا الشويخ اللقب العلمي: استاذ العنوان: قسم علوم الحياة \ كلية التربية للعلوم الصرفة- ابن الهيثم \ جامعة بغداد التاريخ: / / 9102 توصية رئيس قسم علوم الحياة اشارة الى التوصية اعاله احيل هذه الرسالة الى لجنة المناقشة لدراستها وبيان الرأي فيها التوقيع: االسم: د. ثامر عبد الشهيد محسن اللقب العلمي: استاذ مساعد العنوان: قسم علوم الحياة \ كلية التربية للعلوم الصرفة-ابن الهيثم \ جامعة بغداد التاريخ: / / 9102

6 اقرار لجنة المناقشة نحن اعضاء لجنة المناقشة الموقعين ادناه نشهد اننا اطلعنا على الرسالة الموسومة ( الكشف المظهري والجزيئي عن انظمة الدفق Efflux Pumps في بكتريا Escherichia coli المعزولة من اصابات المسالك البولية ) المقدمة من قبل الطالبة ( زهراء حميد علوان ) وهي جزء من متطلبات نيل درجة الماجستير علوم في علوم الحياة \ أحياء مجهرية. وقد ناقشنا الطالبة في محتوياتها وفيما له عالقة بها ونجد انها جديرة بالقبول لنيل درجة ماجستير علوم في علوم الحياة / علم االحياء المجهرية وبتقدير) ). التوقيع: االسم: د. عذراء حميد حسون اللقب العلمي: أستاذ مساعد العنوان: كلية التربية للعلوم الصرفة/ابن الهيثم التاريخ: / / 9102 )عضوا( التوقيع: االسم: د. محسن هاشم رسن اللقب العلمي: استاذ العنوان: جامعة النهرين/كلية التقنيات االحيائية التاريخ: / / 9102 )رئيس اللجنة( التوقيع: االسم: د. رنا مجاهد عبد هللا اللقب العلمي: استاذ العنوان: كلية التربية للعلوم الصرفة/ابن الهيثم التاريخ: / / 9102 )عضوا \ مشرفا( التوقيع: االسم: د. محمود ابراهيم اسماعيل اللقب العلمي: مدرس العنوان: كلية التربية للعلوم الصرفة/ابن الهيثم التاريخ: / / 9102 )عضوا( مصادقة عمادة كلية التربية للعلوم الصرفة/ ابن الهيثم التوقيع: االسم: د. حسن احمد حسن اللقب العلمي: استاذ العنوان: كلية التربية للعلوم الصرفة-ابن الهيثم/جامعة بغداد التاريخ: / / 9102

7 الخالصة Escherichia coli تهدف هذه الد ارسة الى الكشف عن أنظمة الدفق التي تمتلكها بكتريا المعزولة 011 اصابات من المسالك البولية وعالقتها بالمقاومة للمضادات الحيوية. اذ جمعت عينة سريرية من بول المرضى الذين يعانون من اصابات المسالك البولية وتحت اش ارف الطبيب المختص من عدة مستشفيات في بغداد شملت ( مستشفى مدينة االمامين الكاظمين )ع( التعليمي مستشفى الطفل المركزي التعليمي ومستشفى بغداد التعليمي والمختب ارت التعليمية ومستشفى حماية الطفل التعليمي في مدينة الطب( من للمدة 8102/7/01 ولغاية.8102/01/0 شخصت العزالت البكتيرية بالط ارئق التقليدية وبعدها تم تأكيد تشخيصها بالكشف الجزيئي عن الجين 01 التشخيصي 16rNA بتقانة تفاعل البلمرة المتسلسل )PC( إذ تم الحصول على عزلة سريرية تعود للنوع.E. coli اظهرت نتائج اختبار الحساسية للمضادات الحيوية ان بكتريا.E coli كانت متعددة المقاومة )%011( للمضادات الحيوية (MD) multidrug resistance فكانت 01 عزلة مقاومة للمضاد مقاومة للمضاد الحيوي )%49( عزلة 97 erythromycin )%42( عزلة 94 الحيوي carbenicillin )%77( 82 ceftazidime 99 مقاومة للمضاد الحيوي rifampin )%22( عزلة مقاومة للمضاد الحيوي 88 )%79( 87 عزلة مقاومة للمضاد الحيوي novobiocin عزلة مقاومة للمضاد الحيوي cefotaxime عزلة مقاومة للمضاد الحيوي )%08( عزلة مقاومة للمضاد الحيوي 87 tetracycline )%77( I

8 عزلة مقاومة للمضاد الحيوي عزلتان و )%9( مقاومة gentamicin )%81( 00 ciprofloxacin للمضاد الحيوي.nitrofurantoin biofilm اظهرت النتائج ان 90 )%41( عزلة بكتيرية كانت مكونة للغشاء الحيوي وبدرجات )%08( 7 strong adherent مختلفة فكانت )%9( عزلتان للغشاء الحيوي مكونة بدرجة قوية عزالت )%79( 87 moderately adherent للغشاء الحيوي مكونة بكتيرية بدرجة متوسطة و للغشاء مكونة عزلة الحيوي.weakly adherent بدرجة ضعيفة 80 efflux pumps اظهرت نتائج الكشف phenotype المظهري عن مضخات الدفق ان عزلة بكتيرية تمتلك كانت مضخات الدفق. )%71( acrb acra تم اج ارء الكشف molecular الجزيئي للجينين و المشفرة عن بروتيني مضخة )%011( 01 acrb acra الدفق فقد بينت النتائج ان عدد العزالت البكتيرية التي تمتلك كل من الجينين و 017 acrb acra عزلة لكل منهما. و اظهرت نتائج الترحيل الكهربائي ان الوزن الجزيئي للجينين و زوج قاعدة و 010 زوج قاعدة على التوال. E27 بينت نتائج التحليل التتابعي للدنا التابع للعزالت البكتيرية بالنسبة وE40 للجين التشخيصي انها كانت بنسبة )%011( تعود الى بكتريا كما هو موجود في بنك الجينات E. coli 16rNA االمريكي.national center for biotechnology information II

9 المحتويات ت العنوان الصفحة I III VIII IX XI XII الخالصة قائمة المحتويات قائمة الجداول قائمة االشكال قائمة المالحق قائمة المختص ارت الفصل االول / المقدمة واستع ارض الم ارجع 1 Introduction and literature review المقدمة واستع ارض الم ارجع.1 1 Introduction 1.1 المقدمة 4 Literature review 1.1 استع ارض الم ارجع 4 Enterobacteriaceae العائلة المعوية 4 Escherichia coli بكتريا 5 Classification of E. coli تصنيف بكتريا E. coli الصفات العامة لبكتريا Characterization of E. coli E. coli 7 E. coli Types انواع بكتريا E. coli 8 Epidemiology of E. coli وبائية بكتريا.E coli Virulence factors عوامل ض اروة بكتريا.E coli 11 Biofilm production قابلية بكتريا.E coli على انتاج الغشاء الحيوي Pathogenicity of E. coli ام ارضية بكتريا.E coli 15 E. coli antimicrobial resistance مقاومة بكتريا.E coli للمضادات الحيوية Efflux pumps مضخات الدفق 19 تصنيف انظمة الدفق Classification of efflux pumps تفاعل البلمرة المتسلسل (PC) Polymeres Chain eaction III

10 المحتويات الفصل الثاني / المواد وط ارئق العمل 26 Materials and methods 1. المواد و ط ارئق العمل 26 Materials 1.1 المواد 26 Laboratory equipments االجهزة المختبرية 27 Chemical materials المواد الكيميائية االوساط الزرعية الجاهزة eady- made culture media 29 olutions, stains and reagents المحاليل الصبغات والكواشف 30 Antibiotics المضادات الحيوية 31 Kits العدد المختبرية 32 Primers تسلسالت البوادئ 32 Other materials المواد االخرى 33 Methods 1.1 ط ارئق العمل 33 terilization التعقيم تحضير االوساط الزرعية Preparation of culture media 34 eady-made cutler media preparation تحضير االوساط الزرعية الجاهزة Laboratory culture media االوساط الزرعية التركيبة 34 Urea agar وسط اكار اليوريا 35 Blood agar وسط أكار الدم 35 Hekton enteric agar وسط اكار الهكتون المعوي 36 Preparation of olution تحضير المحاليل 36 Macfarland محلول العكورة ماكفرالند محلول صبغة البنفسج البلوري %1 Crystal violate solution محلول دارئ الترحيل (TBE( Tris Borate EDTA buffe 37 محلول صبغة بروميد االيثيديوم Ethidium bromide الخاص بالكشف المظهري لمضخات الدفق Phosphate buffer saline محلول دارئ الفوسفات الملحي (PB) IV

11 المحتويات 37 Primers solutions البوادئ محاليل 38 eagents preparation تحضير الكواشف 38 Oxidase reagent كاشف االوكسديز 38 Catalase reagent كاشف الكتاليز 39 Bacterial isolates العزالت البكتيرية 39 Bacterial samples collection العينات جمع البكتيرية Cultural identification التشخيص المزرعي 40 Microscopic identification التشخيص المجهري 40 Biochemical identification التشخيص الكيموحيوي 40 Oxidase test اختبار االوكسديز 40 Catalase test اختبار الكتاليز 41 Indole test اختبار االندول 41 Methyl red test اختبار المثيل االحمر 41 Voges- Proskauer اختبار فوكس بروسكاور Citrate utilization اختبار استهالك الست ارت 42 Urease test اليوريز اختبار اختبار انتاج الهيمواليسين Hemolysin production test حفظ العزالت البكتيرية وادامتها Preservation of bacterial isolates 41 hort-term preservation الحفظ قصير المدى Long-term preservation الحفظ طويل المدى اختبار مقاومة البكتريا للمضادات الحيوية Antibiotic resistance test 44 Biofilm formation test اختبار قابلية البكتريا على تكوين الغشاء الحيوي Morphological detection of efflux pumps الكشف المظهري عن مضخات الدفق استخالص الحامض النووي المجيني Genomic DNA extraction 47 Preparation of agarose gel تحضير هالم االكاروز 47 )Extracted DNA( التحري عن الحامض النووي المجيني المستخلص V

12 المحتويات Polymerase Chain eaction (PC) DNA equencing esults and discussion Escherichia coli Morphological identification Microscopic identification Biochemical identification Genetic identification Antimicrobial resistance تفاعل البلمرة المتسلسل التحري عن وجود حزم الدنا المضخم التحليل التتابعي للجينات النتائج والمناقشة عزل بكتريا التشخيص المظهري التشخيص المجهري التشخيص الكيموحيوي التشخيص الجزيئي الفصل الثالث / النتائج والمناقشة مقاومة بكتريا E.coli للمضادات الحيوية انماط المقاومة المتعددة للمضادات الحيوية لعزالت بكتيرياcoli.E esistance profile (antibiotype) Biofilm formation تكوين الغشاء الحيوي Phenotypic detection of efflux pump الكشف المظهري عن مضخات الدفق الكشف الجزيئي عن مضخات الدفق في بكتريا Genotypic.E coli detaction of efflux pump DNA sequencing Conclusions ecommendations الكشف الجزيئي عن الجين acra باستعمال تقنية PC الكشف الجزيئي عن الجين acrb باستعمال تقنية PC التحليل التتابعي االستنتاجات التوصيات المصادر العربية المصادر االجنبية المالحق VI

13 المحتويات قائمة الجداول الجدول العنوان انظمة الدفق والمضادات الحيوية التي يتم نقلها خارج بكتريا تسلسالت البوادئ المستعملة في الد ارسة مكونات وحجوم مزيج تفاعل البلمرة المتسلسل PC الظروف المثلى ألج ارء تفاعل البلمرة المتسلسل PC نتائج االختبا ارت التشخيصية لبكتريا.E coli الصفحة E. coli انماط المقاومة المتعددة للمضادات الحيوية لعزالت بكتيريا.E coli نتائج الكشف المظهري عن مضخات الدفق E. coli efflux pumps في بكتريا باستعمال ت اركيز مختلفة من صبغة بروميد االيثيديوم ethidium Trypic oy agar في وسط اكار التربتون صويا bromid النسبة المئوية لجيني مضخات الدفق acra و acrb الموجودة في بكتريا E. coli العالقة بين الكشف المظهري والكشف الجيني عن مضخات الدفق efflux pumps والقابلية على تكوين الغشاء الحيوي biofilm E. coli في بكتريا VII

14 المحتويات قائمة االشكال الشكل العنوان م ارحل تكوين الغشاء الحيوي في البكتريا شكل نظام الدفق )AcrAB-TolC( في بكتريا.E coli الشكل المظهري لمستعم ارت بكتريا.E coli على عدة اوساط تشخيصية الترحيل الكهربائي لناتج تفاعل البلمرة المتسلسل PC Product للجين )727 16rNA زوج قاعدة ) لعزالت بكتريا.E coli في %1.5 اكاروز agaros وفرق جهد..1 فولت لمدة.1 دقيقة النسبة المئوية لمقاومة بكتريا.E coli لمضادات حيوية مختلفة باستعمال طريقة kirby-baure بعد تنميتها على وسط وسط اكار مولر- هنتون انتاج الغشاء الحيوي biofilm من قبل عزالت بكتريا.E coli بطريقة الصفيحة العيارية ذات 96 حفرة النسبة المئوية لقابلية بكتريا.E coli على انتاج الغشاء الحيوي biofilm عزالت بكتريا.E coli الغير متألقة في ت اركيز مختلفة من صبغة بروميد االيثيديوم تحت االشعة فوق البنفسجية في تجربة الكشف المظهري عن مضخات الدفق بطريقة العجلة الخشبية ethedium bromide agar cartwheel method (EtBr CW) الترحيل الكهربائي لناتج تفاعل البلمرة المتسلسل PC Product للجين )1.7 acra زوج قاعدة ) لعزالت بكتريا.E coli في %1.5 اكاروز agaros وفرق جهد..1 فولت لمدة.1 دقيقة الترحيل الكهربائي لناتج تفاعل البلمرة المتسلسل PC Product للجين )1.5 acrb زوج قاعدة ) لعزالت بكتريا.E coli في %1.5 اكاروز agaros وفرق جهد..1 فولت لمدة.1 دقيقة التحليل التتابعي للجين 16rNA لبكتريا.E coli للعزلة E27 التحليل التتابعي للجين acra لبكتريا.E coli للعزلة E27 التحليل التتابعي للجين acrb لبكتريا.E coli للعزلة E27 الصفحة VIII

15 المحتويات قائمة المالحق الملحق A-5 B-5 C-5 A-6 B-6 C-6 A-7 B-7 C-7 A-1 B-1 C-1 A-9 B-9 C-9 العنوان مقاومة عزالت بكتريا.E coli للمضادات الحيوية Antibiotics بعض عوامل الض اروة لبكتريا.E coli التي تشمل ( القابلية علة تكوين الغشاء الحيوي Biofilm انتاج انزيم الهيمواليسين Hemolysin و اناتج انزيم اليوريا )Urease العالقة بين الكشف المظهري والكشف الجيني عن مضخات الدفق Efflux.E في بكتريا Biofilm والقابلية على تكوين الغشاء الحيوي Pumps coli نتائج قياس نقاوة DNA في جهاز نانو دروب Nano Drop التحليل التتابعي للجين 16srNA لبكتريا.E coli للعزلة E27 التحليل التتابعي للجين acra لبكتريا.E coli للعزلة E27 التحليل التتابعي للجين acrb لبكتريا.E coli للعزلة E27 التحليل التتابعي للجين 16srNA لبكتريا.E coli في العزلة E27 التحليل التتابعي للجين acra لبكتريا.E coli في العزلة E27 التحليل التتابعي للجين acrb لبكتريا.E coli في العزلة E27 التحليل التتابعي للجين 16srNA لبكتريا.E coli في العزلةE40 التحليل التتابعي للجين acra لبكتريا.E coli في العزلةE43 التحليل التتابعي للجين acrb لبكتريا.E coli في العزلةE8 التحليل التتابعي للجين 16srNA لبكتريا.E coli في العزلةE40 التحليل التتابعي للجين acra لبكتريا.E coli في العزلةE43 التحليل التتابعي للجين acrb لبكتريا.E coli في العزلةE8 التحليل التتابعي للجين 16srNA لبكتريا.E coli في العزلةE40 التحليل التتابعي للجين acra لبكتريا.E coli في العزلةE43 التحليل التتابعي للجين acrb لبكتريا.E coli في العزلةE8 الصفحة IX

16 المحتويات قائمة المختص ارت Abbreviation µg / ml 16rNA ABC acra acrb BaCl 2. 2H 2 O bp CLI CNF CusCFBA Cml ddh 2 o DEC DNA dntp EDTA ELIA EMB KOH LP MATE MD Mdt MF M-VP NCBI ODc PB PC PD ND M TBE Buffer Tet Tris key Microgram / Milileter 16 vedberg ibosomal ibonucleic Acid ATP-Binding Cassete Family Acriflavine A Acriflavine B Barium Chloride Base Pair Clinical And Laboratory tandards Institute Cytotoxic Necrotizing Factor Copper Transporting Efflux ystem Chloramphenicol Transporting Efflux ystem Deionized terile Distal Water Diarrheagenic E. Coli Deoxyribose Nucleic Acid Deoxy Nucleotide Triphosphate Ethylene Diamine Tetra Acetic Acid Immunosorbent Linked Enzyme Assay Eosin Methylene Blue Potasium Hydroxide Lipopolysaccharide Multidrug And Toxic Efflux Family Multiple Drug esistance Multidrug Transport Major Facilitator uper Family Methyl ed-voges Proskauer National Center For Biotechnology Information Optical Density Control Phosphate Buffer aline Polymerase Chain eaction Pandrug esistance esistance - Nodulation - Division Family Multidrug esistance Family Tris Borate EDTA Buffer Tetracycline Transporting Efflux ystem Trihydroxymethylglycine X

17 المحتويات UPEC UTI UV Light VP1 VP2 WHO XD β -Lactamase Uropathogenic E. coli Urinary Tract Infection Ultra Violet Light Alpha Naphthol Potasium Hydroxide World Health Organization Extremely Drug esistance Beta-Lactamase XI

18 الفصل االول المقدمة واستع ارض الم ارجع

19 الفصل االول المقدمة واستع ارض الم ارجع 1. المقدمة واستع ارض الم ارجعreview Introduction and literature 1.1 المقدمة :Introduction بكتريا هي احدى اف ارد العائلة المعوية Enterobacteriaceae السالبة لصبغة Escherichia coli facultative anaerobic ك ارم عصوية الشكل متحركة او غير متحركة هوائية او ال هوائية اختيارية orbetole ramenose مخمرة لسكر الالكتوز lactose واغلبها مخمرة لسكر ال ارمنوز وسكر السوربتول Wanger et al., 2017 ; ( منتجة إلنزيم β-glucoronidase درجة الح اررة المثلى لنموها )63-63( م oxidase موجبة ألختبار الكتاليز catalase وسالبة ألختبار االوكسديز )Jawetz et al., 2016 methyl red لالندول منتجة indole وغير مستهلكة للست ارت citrate موجبة الختبار المثيل االحمر.)Hemraj et al., 2013( وسالبة الختبار الفوكس بروسكاور Vogase-Proskauer تعيش بصورة طبيعية في امعاء االنسان والحيوان وهي في الوقت نفسه بكتريا انتهازية مسببة للعديد من االم ارض مثل االسهال diarrhea التهاب السحايا opportunistic pathogens meningitis تسمم الدم sepsis تجرثم الدم bacteremia وتعد من اكثر االنواع البكتيرية المسببة المسالك البولية الصابات شيوعا اذ تسبب حوالي )%09( من اصابات urinary tract infections المسالك البولية في العالم وتكون اكثر شيوعا في مرحلة الطفولة ; وجاسم شويخ Hadi et al., 2014(.)6903 هذه ام ارضية تعود البكتريا الى امتالكها العديد من عوامل الض اروة ومن هذه العوامل هي امتالكها colisin cytotoxic necrotizing factor الحديد لمخلبات siderophores عامل التنخر السمي 1

20 الفصل االول المقدمة واستع ارض الم ارجع capsule وامتالكها للت اركيب السطحية مثل االسواط flagella والمحفظة والسكريات المتعددة الدهنية (LP) lipopolysaccharides التي تمنح البكتريا صفات مستضدة وذلك بإنتاجها المستضد )somatic antigen O( O والمستضد الجسمي )flagellar antigen H) السوطي H والمستضد تمتلك او التي تساعدها )pilli على fimbreae( ايضا االهداب.)capsular antigen K ( المحفظي K biofilm االلتصاق في انسجة المضيف فتمنحها القابلية على تكوين الغشاء الحيوي.)Terlizz et al., 2017; Zowawi et al., 2015( Multidrug تتميز بكتريا.E coli بامتالكها صفة المقاومة المتعددة للمضادات الحيوية اذ تمتاز )2016.)Laird, بمقاومتها العالية للمضادات الحيوية نتيجة امتالكها esistance (MD) انزيمات المقاومة مثل انزيمات البيتاالكتاميزβ-lactamases التي تمنح المقاومة لمضادات البيتاالكتام واالنزيمات التي تمنح المقاومة لمضادات االمينوكاليكوسايد aminoglycosides ولمضادات β-lactams الكينولينات.quinolones كما تمتلك هذه البكتريا اليات اخرى تمنحها المقاومة للمضادات الحيوية مثل تغيير نفاذية الغشاء الخلوي تغيير في الموقع الهدف تثبيط تصنيع البروتينات وامتالك البكتريا لمضخات macrolides الدفق efflux pumps اذ تمنح البكتريا المقاومة للمضادات الحيوية مثل مجاميع.)Kapoor et al., 2017( rifamicn ومضادات novobiocin و مضخات الدفق وتقسم خمس على mall Multidrug عوائل هي (MF) Major Facilitator uper Family عائلة عائلة عائلة (MATE) Multidrug and Toxic Efflux Family عائلة esistance Family (M) esistance - Nodulation - )ND) وعائلة ATP-Binding Cassete Family (ABC) بضمنها النظام )AcrAB-ToIC( الذي يكون اكثر شيوعا في بكتريا.E coli اذ Division Family 2

21 الفصل االول المقدمة واستع ارض الم ارجع acrb AcrB يتكون من ثالثة بروتينات هي الغشاء الداخلي بروتين الذي يشفر عنه الجين ولا بروتينات ToIC acra المنتشرة في AcrA الف ارغ البالزمي الجين عنها يشفر التي فضال عن القناة التي تقع في الغشاء الخارجي 2015( al.,.)anes et نظ ار ألهمية بكتريا.E coli الطبية وعالقتها باصابات المسالك البولية ومقاومتها للمضادات الحيوية E. coli جاءت هذه الد ارسة للكشف عن أنظمة الدفق التي تمتلكها بكتريا المعزولة من اصابات المسالك البولية وعالقتها بالمقاومة للمضادات الحيوية وحسب محاور االتية: الد ارسة 0- عزل وتشخيص بكتريا.E coli بول من المرضى الذين يعانون من اصابات المسالك البولية بالط ارئق الزرعية و الكيموحيوية والجزيئية باستعمال الجين التشخيصي.16rNA 6- اج ارء اختبار فحص الحساسية sensitivity test لمجاميع مختلفة من المضادات الحيوية. 6- اج ارء اختبار قابلية البكتريا على انتاج الغشاء الحيوي biofilm. 4- اج ارء الكشف المظهري phenotype عن مضخات الدفق efflux pumps.pc تقانة وacrB acra عن جيني genotype الدفق مضخة باستعمال 5- الكشف الجزيئي للدنا للجين التشخيصي 16rNA و جيني المقاومة 3- اج ارء التحليل التتابعي DNA sequencing. acrb و acra 3

22 الفصل االول المقدمة واستع ارض الم ارجع استع ارض Literature review 1.1 الم ارجع العائلة المعوية Enterobactriaceae تضم العائلة المعوية مجموعة كبيرة ومتباينة من االنواع البكتيرية التي تعيش في امعاء االنسان والحيوان بصورة طبيعية. تكون اف اردها عصوية الشكل سالبة لصبغة ك ارم هوائية او ال هوائية اختيارية facultative anaerobic يمكن ألف اردها االم ارض من العديد تسبب ان لإلنسان والحيوان اصابات منها الجروح االصابات المكتسبة في المستشفيات اصابات nosocomial infections الجهاز التنفسي اصابات البولي الجهاز اصابات و urinary tract infections الجهاز respiratory infections التناسلي )2017 al.,.)oliveira et وتمتلك عوامل ض اروة مختلفة كالسموم genital infections Lactose واالنزيمات ايضا تخمر مجموعة واسعة من الكربوهيد ارت ومعظم اف اردها مخمرة لسكر الالكتوز كما انها تكون سالبة الختبار االوكسديز موجبة الختبار الكتاليز catalase لها القابلية على oxidase اخت ازل النت ارت الى النتريت لغرض انتاج الطاقة معظمها تتحرك بوساطة االسواط nitrite nitrate 63 م 2016( al.,.)jawetz et غير مكونة لألبواغ ودرجة الح اررة المثلى لنموها flagella بكتريا Escherichia coli تعد من اهم اف ارد العائلة المعوية وتنمو كنبيت طبيعي في الجهاز كما الهضمي normal flora diarrheal opportunistic pathogen من البكتريا انها تعد االنتهازية الممرضة االسهال تسبب اذ فتسمى فضال عن العديد من االم ارض مواطنها خارج Diarrheagenic E. coli )DEC) diseases sepsis الطبيعية منها التهاب السحايا neonatal meningitis لألطفال حديثي الوالدة تسمم الدم 4

23 الفصل االول المقدمة واستع ارض الم ارجع Uropathogenic E.coli urinary tract infection واصابات المسالك البولية فتسمى بكتريا اذ تسبب حوالي %09 من اصابات المسالك البولية و يمكن ان تنتقل بسهولة من الشرج منطقة (UPEC) الى المسالك البولية والمثانة التي تكون اكثر شيوعا في االناث منها في الذكور بحوالي 04 مرة بسبب قصر في اإلناث االحليل )2016.)Levinson, Classification of E. coli بكتريا تصنيف E. coli Theodore Escherich شخصت بكتريا.E coli ألول مرة من قبل العالم االلماني في عام م خالل د ارسته على البكتريا الطبيعية في االمعاء في ب ارز االطفال الرضع كبكتريا متعايشة )0885( E. coli Bray تستوطن االمعاء مباشرة بعد الوالدة. وفي عام )0045( وجد العالم م ان ساللة من بكتريا كانت السبب الرئيس إلسهال االطفال الرضع في انكلت ار واطلق عليها Enteropathogenic.E coli.)bray, 1945) (EPEC) يكون جنس Escherichia قريب الصلة من اجناس العائلة المعوية االخرى السيما جنس E E. fergosonii E. hermanii E. blattae E. coli ( هذا الجنس ويضم انواع خمسة higella تختلف فيما بينها ببعض التفاعالت الكيموحيوية. ويعد النوع.E coli االكثر اهمية وشيوعا في )vuneris ام ارضية االنسان 2017( al.,.)olowe et برجي Bergey s manual ضمن العائلة المعوية وكاالتي: صنفت بكتريا.E coli العالم مصنف في 5

24 الفصل االول المقدمة واستع ارض الم ارجع Kingdom: Bacteria Phylum: Proteobacteria Class: Gammaproteobacteria Order: Enterobacteriales Family: Enterobacteriaceae Genus: Escherichia pecies: coli (Garrity et al., 2005). Characterization of E. coli الصفات العامة لبكتريا.E coli peritrichous هي عبارة عن عصيات سالبة لصبغة ك ارم متحركة بوساطة االسواط المحيطية التي تحيط بكامل الجسم وغير مكونة لألبواغ. مستعم ارتها ملساء ناعمة ومحدبة قليال رطبة غير flagella capsule مخاطية او مخاطية عند امتالكها لتركيب المحفظة ذات حافة حادة كاملة وردية لماعة على green metalic sheen MacConkey وسط اكار المكونكي agar خض ارء معدنية لماعة على وسط االيوسين مثيلين االزرق Eosin Methylene Blue (EMB) agar وايضا تكون مستعم ارت وردية على Cromagar Orientation اكار وسط الكروماجين اورينتيشن غير مخمرة لسكر السليلوبايوز واكثر من %89 منها مخمرة لسكر ال ارمنوز ramenose واكثر من %09 منها مخمرة cellulobios gelatin لسكر السوربتول.sorbetole كما انها غير محللة للجيالتين وغير منتجة لغاز كبريتيد الهيدروجين H 2 في وسط ثالثي السكر والحديد (TI) Triple ugar iron agar معظمها منتجة ألنزيم( GUD ) β-glucoronidase وال تنمو بوجود سيانيد البوتاسيوم )KCN( وتنمو في اس هيدروجيني 6

25 الفصل االول المقدمة واستع ارض الم ارجع Jawetz et al., 2016;( )63 يت اروح بين )4.4 0( ودرجة الح اررة المثلى لنموها هي )63 م كما انها تكون موجبة الختبار الكتاليزcatalase وسالبة الختبار.)Wanger et al., 2017 االوكسديزoxidase واليوريز وموجبة إلختبار االندول الذي يعد االختبار االفضل الذي indole urease يميزها عن اف ارد العائلة المعوية االخرى. فضال عن انها غير مستهلكة للست ارت citrate كمصدر وحيد للكاربون كما انها موجبة الختبار المثيل االحمرred methyl وسالبة الختبار الفوكس بروسكاور.)Hemraj et al., 2013( Vogase-Proskauer E. coli Types انواع بكتريا E. coli بكتريا تقسم المسببة لإلسهال على ستة انواع باالعتماد على Diarrheagenic E. coli (DEC( صفاتها وعوامل ضر اوة محددة والية عمل تلك العوامل: اشريشيا القولون النزفية لألمعاء او المنتجة للسموم الشبيهة بسموم الشيكيال higa-toxin Producing E. coli (TEC) or Enterohemorhagic E. coli (EHEC) Enteropathogenic E. coli (EPEC) اشريشيا القولون الممرضة لألمعاء Enterotoxigenic E. coli (ETEC) Enteroinvasive E. coli (EIEC) اشريشيا القولون السامة لألمعاء اشريشيا القولون الغازية لألمعاء Enteroaggregative E. coli (EAEC) اشريشيا القولون األمعائية التكتلية Diffusely Adhering E. coli (DAEC( اشريشيا القولون المنتشرة بااللتصاق.)Malema et al., 2018; ivas et al., 2015) 7

26 الفصل االول المقدمة واستع ارض الم ارجع Epidemiology of E. coli وبائية بكتريا E. coli تمثل بكتريا.E coli الجزء الرئيس من بين اف ارد العائلة المعوية التي تغزو األمعاء بعد الوالدة وتتعايش فيها بصورة طبيعية في حين ان لبعض سالالتها القابلية االنتهازية إلصابة العائل باألم ارض بعد توافر الظروف المثلى للنمو 2017( ofiani,.)gharajalar and ان االصابة باصابات البولية من المسالك االم ارض االكثر شيوعا كما ان هذه البكتريا تعد المسؤول الرئيس حوالي عن %09 من حاالت اصابات المسالك البولية للفئات العمرية ما بين )69 60( سنة وما بين فضال عن 30( سنة ان نسبة االصابة في االناث اكبر منها في الذكور للفئات العمرية ما بين 39( سنة 00( كما انها تعد من المشاكل الرئيسة في اصابات المستشفيات وذلك لتسببها بالعدوى 09( ألشخاص في دور النقاهة )2017 al.,.)hadi et تختلف نسبة االصابة ببكتريا المسالك البولية )UPEC( بين شخص واخر وتكون اكثر شيوعا في catheters التي تصل الى مرحلة الطفولة كما تزداد نسبة االصابة بها عند استعمال انابيب القسطرة البولية المثانة عبر االحليل اذ تساعد في ادخال البكتريا الى االحليل. كما تختلف نسبة انتشار االصابة باختالف الظروف الجغ ارفية والصحية اذ تزداد نسبة االصابة في الظروف الصحية الرديئة وسوء التغذية. ان االصابة باصابات المسالك البولية تحدث في حوالي نصف سكان العالم ويأتي بالمرتبة الثانية الجهاز اصابات بعد 059 التنفسي في المجتمعات الفقيرة حوالي تحدث اذ مليون اصابة في العالم كل عام. في وان وجود ما ال / يقل عن 09 5 خلية بكتيرية ملليتر من البول دليل على حدوث االصابة )2016 al.,.)jaweetz et 8

27 الفصل االول المقدمة واستع ارض الم ارجع Virulence factors عوامل ض اروة.E coli بكتريا تمتلك بكتريا.E coli العديد من عوامل الض اروة التي تزيد من قابليتها على االصابة باألم ارض اهمها اصابات المسالك البولية ومن هذه العوامل هو القدرة على تحليل الدم الحمر كريات وذلك المتالكها االنزيم الحال للدم hemolysin الذي يكون على عدة ان و اع حسب شكل التحلل هي )الفا بيتا كاما( اذ α-hemolysin ان النوع االول الفاهيمواليسين يمنح البكتريا القدرة على تحلل كريات الدم الحمراء لإلنسان β-hemolysin تحلال جزئيا والنوع الثاني بيتاهيموالسين فيمنح البكتريا القدرة على تحلل كريات الدم γ-hemolysin الحمر اء تحلال كامال اما النوع الثالث وهو كاماهيمواليسين فيمنح البكتريا القدرة على تحلل كريات الدم الحمر للحيوانات االخرى وليس االنسان. وتمتلك البكتريا ايضا عامل التنخر السمي cytotoxic.)jaweetz et al., )2016 الذي يعمل على تحليل كريات الدم الحم ارء necrotizing factor من عوامل الض اروة االخرى هي امتالك البكتريا للت اركيب السطحية مثل السموم الداخلية O التي تتكون من الذي يحتوي على (LP) lipopolysaccharide المستضد الجسمي endotoxins ) فتمنح البكتريا القدرة على التوطن على خاليا المضيف باألخص بطانة المثانة somatic antigen O( وتمكنها ايضا من التغلب على مناعة المضيف ولبعضها القابلية على انتاج المحفظة capsule المتعددة السكريات التي تحتوي على المستضد المحفظي )capsular antigen K وايضا تمتلك ت اركيب سطحية ( اخرى هي التي تستعمل كوسائل للحركة في االنواع المتحركة وايضا تحتوي هذه الت اركيب االسواط flagella المستضد السوطي على هذه المستضدات ان البكتريا القدرة على تمنح H) )flagellar antigen اذ H التغلب على الجهاز المناعي للمضيف. كما تمتلك ايضا الياف كورلي curli fibers التي تمتلك صفاة فيزيائية وكيميائية تسهل عملية انتاج الغشاء الحيوي بوساطة البكتريا. ايضا البكتريا تمتلك biofilm 9

28 الفصل االول المقدمة واستع ارض الم ارجع الح ويصالت الموجودة في الغشاء الخارجي outer-membrane vesicles التي ترتبط مع السموم البكتيرية االنزيمات وعوامل االلتصاق اذ تعمل بمثابة نظام تسهيل يسهل ارسالها الى خاليا العائل. وهنالك toxins outer-membrane proteins (OMPs) ايضا بروتينات الغشاء الخارجي المفرزة السموم واالف ارز كلها تعمل على زيادة قدرة البكتريا على االصابة )2017 al.,.)terlizzi et وتعد االهداب بأنواعها الثالث و -F( Fimbrial النوع و -fimbrial P-fimbrial) Fimbriae or Pilli الذي يعد من اهم العوامل التي تساعد البكتريا على االلتصاق على انسجة العائل مانحة )Type1 Pilli ( اياها القدرة على تكوين الغشاء الحيوي ومن ثم زيادة قابليتها على اكتساب صفة المقاومة للمضادات الحيوية.) paulding et al., 2017; Neamati et al., 2015( فضال عن هذا امتالكها البكتريوسين الذي يدعى colicin الذي يقتل االجناس bacteriocin البكتيرية االخرى وبالتالي يساهم في حماية البكتريا وسموم cyclomodulins التي تعد من السموم المثبطة للحامض النووي الجينومي DNA في الخاليا التابعة لألجناس البكتيريةاالخرى وتمتلك ايضا السموم الثابتة بالح اررة التي تفرزها بكتريا EAEC السموم Enteroaggregative heat-stable toxin1 )EAT1( ETEC المعوية الثابتة بالح اررة ETEC heat-stable enterotoxin والسموم المعوية المتكتلة بالح اررة heat-labileالتي enterotoxin تفرزها بكتريا Plasmid-encoded السموم المشفرة بالبالزميد ETEC التي تكون سامة لكريات الدم الحمر اء وللخاليا المعوية السموم الشبيهة بسموم toxin (Pet) الشيكيال (het1) higella enterotoxin1 والسموم الحوصلية vacuolating autotransporter انزيمات تمتلك كذلك الكاربينيميز carbapenemase التي.)oltani et al., 2018( toxin (VAT) تمنح البكتريا صفة المقاومة لمضادات الكاربينيم البيتاالكتاميز و β-lactamases التي carbapenems 10

29 الفصل االول المقدمة واستع ارض الم ارجع β- penicillins تشمل cephalosporines و التي تمنح البكتريا صفة المقاومة لمضادات البيتاالكتام phosphotransferase adenyltransferase و انزيمات acetyltransferase و التي تمنح lactam )Zowawi et al., 2015( البكتريا المقاومة لمضادات aminoglycosides وتمتلك ايضا مخلبات.)Terlizzi et al., 2017( الحديد siderophores البكتريا على تساعد التي النمو في بيئة قليلة الحديد Biofilm production قابلية بكتريا.E coli على انتاج الغشاء الحيوي الغشاء الحيوي عبارة عن تجمع الخاليا البكتيرية والتصاقها باألسطح الصلبة وتكون محاطة بمادة خارج خلوية بينية extracellular matrix التي تكون عبارة عن سكريات متعددة وبروتينات من الدنا االحياء المجهرية وتساعد هذه المادة الخارج خلوية في تثبيت الغشاء الحيوي ويساهم هذا الغشاء في عمليات اصابة المضيف ويزيد من قابلية البكتريا على مقاومة المضادات الحيوية كما يوفر الحماية للخاليا 2013, oto (.عملية ( من االليات الدفاعية للجسم Macrophages خاليا البلعمة منها تكوين الغشاء الحيوي تمر بعدة م ارحل وكاالتي: مرحلة وصول الخاليا والتصاقها على االسطح: العكسي reversible attachment 0- االلتصاق بوساطة االسواط flagella و عوامل الجذب الكيميائية chemotaxis باألسطح تتم هذه المرحلة ثبات الخاليا وقلة مرحلة على االسطح: العكسي irreversible attachment للبكتريا. 6- االلتصاق غير curli fbres استطالتها يتوسط هذه المرحلة النوع االول من االهداب type1pilli الياف كورلي ونوع من المستضدات يدعى.antigen 43 11

30 الفصل االول المقدمة واستع ارض الم ارجع 6- مرحلة تكوين المادة الخارج خلوية external matrix اذ تنتج البكتريا السكريات المتعددة لتسهل cellulose عملية تجمع والتصاق الخاليا على االسطح وتتكون هذه المادة من السليلوز متعدد colonic acid الكلوكوز polyglucosamine االميني و حامض الكولونك العديد من فضال عن المواد كاألحماض النووية والبروتينات وغيرها. 4- مرحلة اكتساب الغشاء الحيوي للتركيب الثالثي االسطح three-dimensional structure وهذه تشمل تكون مستعم ارت بكتيرية مطمورة في العديد من المواد كالمغذيات والماء والنواتج االيضية. مرحلة نضج الغشاء الحيوي و انفصاله ليبدأ العملية من جديد على -5 االنفصال :deattachment )0-0 اسطح اخرى (2014.(oto, كما في الشكل ( م ارحل تكوين الغشاء الحيوي في بكتريا االلتصاق attachment تكوين مستعم ارت بكتيرية :E. coli الشكل )1-1(: صغيرة تكوين المادة الخارج خلوية وتكوين غشاء حيوي اولي اكتساب الغشاء الحيوي للتركيب external matrix deattachment الثالثي االسطح three-dimensional structure وتكوين غشاء حيوي ناضج االنفصال.)ilva et al., 2017) 12

31 الفصل االول المقدمة واستع ارض الم ارجع اشارت الد ارسات الى ان الغشاء الحيوي يكون مسؤوال عن %89 من االصابات البكتيرية للمسالك البولية في االنسان ويمكن تثبيط الغشاء الحيوي باستعمال مواد عديدة قد تكون مستخلصات نباتية او مواد اذ كيميائية يظهر تأثيرها في نظام نقل االشا ارت الكيميائية بين الخاليا البكتيرية والذي يدعى بنظام (Q).quorum sensing تزداد صفة المقاومة للمضادات الحيوية في البكتريا المنتجة للغشاء الحيوي )Q( نتيجة لعدم قدرة المضادات الحيوية على اخت ارق الغشاء الحيوي تفعيل الجينات المشفرة عن نظام Tajbakhsh et al., ) وتأثير مضخات الدفق efflux pumps المتعددة المقاومة للمضادات الحيوية.)2016 ; Poursina et al., 2018 Pathogenicity of E. coli ام ارضية بكتريا.E coli لهذه البكتريا القدرة على احداث العديد من االم ارض داخل االمعاء وخارجها ومن هذه االم ارض : : 0- االم ارض المعوية او االسهال Enteric or diarrheal diseases في لحظة االلتصاق تنتج البكتريا السموم المعوية enterotoxins ويوجد ثالثة انواع من هذه اثنان السموم منها تسبب االسهال المائي watery diarrhea هما السموم المتكتلة بالح اررة الشبيهة بسموم بكتريا الكولي ار Vibrio cholerae والسموم الثابتة heat-labile toxin (LT) بالح اررة اما السموم الشبيهة بسموم بكتريا higella التي تدعى.heat-stable toxin (T) فتسبب االسهال الدموي bloody diarrhea ويمكن ان تسبب البكتريا نفسها وليس shiga toxins سمومها االسهال الدموي وذلك بعد انغ ارزها في بطانة االمعاء مسببة مرض يدعى بالديزنتري.)Levinson, 2016( dysentery 13

32 الفصل االول المقدمة واستع ارض الم ارجع :Menengitis\epticemia السحايا \ 1- التهاب تسمم الدم E. coli مرض التهاب السحايا عند االطفال الرضع تسببه بكتريا التي تمتلك نوعا متخصصا E. coli من المستضدات المحفظية يدعى K1. اما تسمم الدم فتسببه بكتريا التي تمتلك السموم الداخلية endotoxin والتي تتكون من (LP) وتكون االصابة اكثر شيوعا في االطفال الرضع بسبب فقدانهم الجسم المضاد من نوع Immunoglobulin M )IgM( وقد يحدث كإصابة ثانية.)oltani et al., 2018; Jaweetz et al., 2016 نتيجة االصابة باصابات المسالك البولية ( -3 اصابات المسالك البولية Urinary tract infection تعد من اهم واكثر االم ارض شيوعا اذ تحدث نتيجة االصابة بالبكتريا في الجهاز تكاثرها و البولي الذي يتكون من المسالك البولية السفلى )االحليل والمثانة ) والمسالك البولية العليا cystitis )الحالبين والكليتين( االلتهاب يبدأ عادة بالمسالك البولية السفلى فيسمى بالتهاب المثانة asymptomatic والتهاب االحليل urethritis الذي يحدث بعد تجرثم بالبكتريا البول catheter- ويكون بدون اع ارض والتهاب المسالك البولية المرتبط بالقسطرة bacteriuria.associated urinary tract infection ويمكن ان يتطور الى المسالك البولية العليا مسببا التهاب الحالبين واصابات الكلى وحويض الكلى phyelonephritis وتعد االصابة ببكتريا bacteremia المسبة الصابات المسالك البولية المصدر الرئيس لإلصابة بتجرثم الدم E. coli.(forsyth et al., 2018; Foxman, 2014) بكتريا تعد.E coli من اكثر اف ارد العائلة المعوية المسببة الصابات المسالك البولية تشكل حوالي اذ )Jawetz et al., 2016 %09 من اصابات المسالك البولية ( فضال عن انواع اخرى من البكتريا التي 14

33 الفصل االول المقدمة واستع ارض الم ارجع Proteus mirabilis taphylococcus saprophyticus( اصابات تسبب المسالك البولية هي Pseudomonas spp. Klebsiella pneumoniae erratia spp. Enterobacter spp..)foxman, 2014; Mirzarazi, 2013( )treptococcus group B E. coli antimicrobial مقاومة بكتريا.E coli للمضادات الحيوية resistance المضادات الحيوية عبارة عن نواتج ايضية ثانوية طبيعية او مصنعة تنتج من قبل االحياء المجهرية في الطور الثابت ولها القدرة على تثبيط االحياء المجهرية االخرى دون التأثير المضيف جسم خاليا في يمتلك بعضها طيفا محدودا narrow spectrum antibiotics اي تكون محددة بنوع معين او مجموعة محددة من االحياء المجهرية والبعض االخر يمتلك طيفا واسعا broad spectrum antibiotics اي تعمل على مختلف مجاميع االحياء المجهرية. البعض منها يكون ذا تأثير قاتل bactericidal والبعض االخر تأثير مثبط يكون ذا اوال اكتشافها تم من قبل العالم الكسندر Alexander Fleming في bacteriostatic م بعد اكتشافه لعقار البنسللين penicillin بالصدفة لكن هذا العقار بقي حتى قام العالمان عام )0068( و باستخالصه وفي عام )0040( م انتشر بشكل واسع )المرجاني Ernst Chain Haward Flory.)Ali et al., 2018 ; 6900 تعد صفة المقاومة للمضادات الحيوية التي تمتلكها البكتريا احدى اهم المشاكل الصحية واالقتصادية في العالم االمر الذي دفع الباحثين الى التحري عن مضادات جديدة للتغلب على السالالت البكتيرية المقاومة. اذ تؤدي االصابة بالبكتريا المقاومة الى العالج مدة طول وزيادة خطورة االصابة. وهناك عدة انماط extensively-drug multi-drug resistant منها )MD( من المقاومة للمضادات الحيوية 15

34 الفصل االول المقدمة واستع ارض الم ارجع المقاومة من نوع (MD) تعني ان البكتريا Pan-Drug esistant (PD) و resistant (XD) تكون مقاومة على االقل لواحد من بين ثالث مضادات حيوية والمقاومة من نوع (XD) تعني ان البكتريا مقاومة ألثنين او كل المضادات الحيوية المأخوذة اما المقاومة من نوع (PD) فتعني ان البكتريا تكون.)Basak et al., 2016 مقاومة لجميع المضادات الحيوية ( صفة المقاومة هذه تكون اما فطرية او مكتسبة acquired تكتسبها اما عن طريق الطف ارت innate في الجينات )طف ارت كروموسومية )chromosomal mutations او تكتسبها عن طريق انتقال المادة الور اثية من بكتريا الى اخرى بعدة طر ائق اما عن طريق االقت ارن البكتيري conjugation ويتم فيها انتقال transposons او المادة الو ارثية بين خلية واخرى مباشرة مثل plasmids البال زميدات الجينات القافزة و عن طريق التحول ويتم فيها اخذ الجينوم البكتيري المتحرر من البكتريا الميتة او عن transformation الحث طريق ويتم فيها انتقال المعلومات الو ارثية بين الخاليا البكتيرية بوساطة العاثيات transduction وقد )2016.)Laird, ادت الطف ارت الى زيادة مقاومة البكتريا للمضادات الحيوية bacteriophages tetracycline الستربتومايسين %39 فكانت سابقا مقاومة لما يقارب ال من التت ارسايكلين والسلفيزوكسازول sulfisoxazole لكن بعد حصول الطف ارت وانتقال بالزميدات المقاومة streptomycin لها اصبحت مقاومة ايضا الى االمبسلين ampicillin الكنامايسين kanamycin و التيكارسيلين (. تظهر البكتريا عددا من اليات المقاومة Afzal, 2017;hariff et al., 2013( ticarcillin للمضادات الحيوية بعد انتقال جينات المقاومة اليها وهي كاالتي: 16

35 الفصل االول المقدمة واستع ارض الم ارجع 1- تغيير في موقع الهدف Target modification تؤثر هذه االلية في بناء االحماض النووية nucliec acids فتزيد من مقاومة البكتريا ciprofloxacin لمضادات الفلوروكينولينات fluoroquinolones مثل السبروفلوكساسين ribosomes والريفامايسين rifamycin فضال عن في تأثيرها ال اريبوسومات في محدثة خلال erythromycin صنع البروتين مما يؤدي الى زيادة مقاومة البكتريا لمضادات االرثرومايسين.)Kotsyuba et al., 2014( والريفامايسين rifamycin -1 تغيير في نفاذية الغشاء الخلوي Alteration of cell membrane permeability نتيجة لتغير طبيعة البروتين في الغشاء الخلوي تتغير ثقوب الغشاء الخلوي او انظمة النقل فيه membrane transport system مما يؤثر في عمل ويجعل منه غير الحيوي المضاد قادر على عبور انظمة النقل في الغشاء ونتيجة لهذه التغي ارت تمنح هذه االلية مقاومة البكتريا quinolones لمضادات التت ارسايكلين tetracycline والكينولينات مثل السبروفلوكساسين وبعض انواع االمينوكاليكوسايد مثل aminoglycoside الجنتامايسين ciprofloxacin nitrofurantoin فضال عن 2017( al.,.)kapoor et المضاد الحيوي gentamicin.)6903 ومضادات السلفانمايد sulfonamides )الشويخ -3 انتاج االنزيمات Production of enzymes β-lactam ring تؤثر هذه االلية في بناء الجدار الخلوي اذ يتم تحطيم حلقة البيتاالكتام الموجودة في مضادات البنسلينات والسيفالوسبورينات cephalsporins بوساطة penicillins انزيمات البيتاالكتاميز مؤديا الى اكتساب البكتريا المقاومة لهذه المضادات β-lactamases 17

36 الفصل االول المقدمة واستع ارض الم ارجع aminoglycosides فضال عن دور االن زيمات في تحطيم مضادات االمينوكاليكوسايد glycopeptide الكلو ارمفينيكول chloramphenicol الكاليكوببتايد والكينولينات Kotsyuba et ( التي تنتج انزيمات topoisomerase المثبطة لتضاعف الدنا quinolones.)al., تغيير المسالك االيضية Alteration of metabolic pathways تستعمل البكتريا حامض الفوليك folic acid الذي تحصل عليه من البيئة جاه از محدثة تغيي ار في المسالك االيضية لها مما يتيح لها اكتساب المقاومة لمضادات الت ارميثوبريم ومضادات السلفا ( 2017 al.,.)kapoor et فضال عن sulfonamides trimethoprim امتالكها الى مضخات الدفق efflux pumps التي تضخ المواد الضارة خارج البكتريا وتسمح.)Paltansing, 2015 بالبقاء لها في بيئة غير مالئمة ( مضخات الدفق Efflux pumps عبارة عن ناقالت بروتينية تقع في الغشاء الخلوي تؤدي دو ار هاما في نقل المواد المختلفة وطرحها خارج الخلية للتخلص من التأثير الضار لها لذا تعد وسيلة مهمة لمقاومة البكتريا للمضادات الحيوية. اذ hydrophilic هذه الناقالت تعمل على نقل مواد كثيرة خارج الخلية مثل المحبة للماء المواد السامة amphipathic substances الكارهة للماء hydrophobic او فضال عن االصباغ الصبغة مثل الحم ارء ethidium crystal violet المصفرة acriflavine و صبغة البنفسج البلورية و صبغة بروميد االثيديوم fatty acids المعقمات المطه ارت antiseptics الحوامض الدهنية disinfectants bromide العناصر الثقيلة العضوية heavy metals المذيبات organic solvents والمضادات الحوية 18

37 الفصل االول المقدمة واستع ارض الم ارجع مثل مضادات البيتاالكتام β-lactams الماكروليدات macrolides التت ارسايكلين antibiotics Zhi Li et al., ( novobiocin chlramphenicol الكلو ارمفينيكول tetracycline و النوفوبايوسين.)2016 ; Venter et al., تصنيف انظمة الدفق Classification of efflux pumpss صنفت مضخات الدفق باالعتماد على ثالثة معايير وكاالتي : 0- باالعتماد على خصوصيتها للمواد المنقولة substrate specificity تكون اما مضخات دفق عامة general efflux pumps لها القدرة على مواد ذات طرح ت اركيب كيميائية مختلفة خارج الخلية البكتيرية كما في مضخات الدفق المتعددة في البكتريا ذات طرح على القدرة مضادات تعود ألصناف مختلفة في التركيب الكيميائي لذا فهي تساهم في المقاومة specific efflux المتعددة للمضادات 2018( al.,.)alav et او مضخات دفق متخصصة التي تكون متخصصة بنقل مواد معينة وطرحها خارج الخلية كما في المضخات pumps المتخصصة في دفق نوع واحد من المضادات الحيوية )2015 al.,.)anes et 6- باالعتماد على مصدر الطاقة ource of Energy تشمل المضخات التي تعتمد على المصدر الكيميائي للطاقة إلنجاز وظائفها اي التي تعتمد على النقل الفعال طرح في active transport المواد خارجا وهي تشمل صنفين رئيسيين هما مضخات الدفق التي تعتمد على مصادر الطاقة االولية primary active transporters التي تستعمل الطاقة الناتجة عن التحلل المائي (ATP) adenosine triphosphate لجزيئة 19

38 الفصل االول ومضخات الدفق التي تعتمد على مصادر الطاقة الثانوية المقدمة واستع ارض الم ارجع secondary active transporters (Na) التي تعتمد على تدرج )H) ايون الهيدروجين او على تدرج أيون الصوديوم كمصدر.)Delmar et al., 2014( للطاقة في عملية طرح المواد خارج الخلية 6- باالعتماد على المنشأ الو ارثي elationship) :(Phylogenic تصنف هذه المضخات على صنفين رئيسيين طبقا للمنشأ الو ارثي هما مضخات الدفق الكروموسومية chromosomal efflux pumps اي تحمل الجينات المشفرة لها على كروموسوم الخلية وتمنح الخاليا صفة المقاومة الطبيعية او الذاتية intrinsic resistance فتسمح للبكتريا البقاء في بيئة معينة كما في البيئة ذات التركيز العالي للمضادات الحيوية وهذه تتواجد في الخاليا plasmid efflux pumps حقيقة النواة وبدائية النواة و مضخات الدفق البالزميدية وتحمل plasmids الجينات المشفرة لها على عناصر و ارثية مثل محمولة البالزميدات أو الجينات القافزة aquired resistance أو على integrons تمنح الخاليا صفة المقاومة المكتسبة transposons.)puzari and Chetia, 2017 ( وتواجدها يكون في الخاليا بدائية النواة السيما الخاليا البكتيرية CmlA كما في انظمة الدفق من عائلة )MF( والتي تشمل انظمة الدفق TetA/B/E(.ND الذي ينتمي الى عائلة الدفق OqxAB-TolC ونظام الدفق )Flo هنالك جينات يمكن ان تشفر لنقل أكثر من مادة مختلفة في التركيب الكيميائي عبر مضخة multidrug resistance efflux pumps دفق واحدة وهذه تسمى بمضخات الدفق المتعددة.)Blair et al., 2014 وهي بذلك تمنح البكتريا صفة المقاومة المتعددة للمضادات الحيوية ( وهناك خمس عوائل من انظمة الدفق في بدائية النواة 2016( al., )Zhang et هي : 20

39 الفصل االول المقدمة واستع ارض الم ارجع.Major Facilitator uper Family (MF).mall Multidrug esistance Family (M).Multidrug and Toxic Efflux Family (MATE).ATP-Binding Cassete Family (ABC) عائلة عائلة عائلة عائلة عائلة( ND ).esistance - Nodulation - Division Family (ATP) (ABC) مضخات تعتمد الدفق ضمن عائلة الدفق على تحلل جزيئة كمصدر للطاقة اما االخرى العوائل فتعتمد على الطاقة الباعثة للبروتون (PMF) Proton motive Force كمصدر للطاقة. ومن اشهر العوائل واكثرها انتشا ار هي عائلة ND التي تسود في البكتريا السالبة لصبغة ك ارم مثل ) Proteus spp. Klapsiella pneumoniae almonella spp. Pseudomonas spp. (.)Delmar et al., 2014( اكتشفت مضخات الدفق ألول مرة كآلية من آليات المقاومة ضد التت ارسايكلين tetracycline في ND.)Blanco et al., 2016( بكتريا E. coli العائلة تنقسم ثالثة اقسام على على اساس مكوناتها وتشمل مضخات الدفق ذات المكون الواحد التي تتمثل بالبروتين AcrB المت ا وجد في الغشاء الداخلي inner للخلية والذي يشفر عنه جين يدعى acrb ولا ذي ينقل المضادات المحبة للماء ومضخات membrane ذات مكونين التي تتمثل ببروتين في الغشاء الداخلي والبروتينات الدهنية AcrA المتواجد في الف ارغ AcrB البالزمي يدعى جين عنها يشفر والتي acra ومضخات ذات ثالثة مكونات periplasmic space tripartiteالتي تتمثل ببروتين في الغشاء الداخلي و بروتينات في الف ارغ البالزمي وقناة AcrA AcrB شبيهة بالقمع بروتينية تدعى المتواجدة في الغشاء الخارجي outer membrane تنقل والتي للخلية Toic 21

40 الفصل االول المقدمة واستع ارض الم ارجع.)Abdelhamid and Abozahra, 2017 اغلب المضادات 2016( al., ; Hayashi et المحبة للماء E.coli ND تقسم وايضا عائلة مضخات الدفق في بكتريا عائلتين ثانويتين على باالعتماد على المواد التي تنقلها: -0 (HAE-ND) :Hydrophobic and Amphiphilic Efflux ND وهي مضخات الدفق التي تنقل المواد السامة والضارة المتعادلة و الكارهة للماء وتشمل البروتينات AcrAB.MdtEF MdtC AcrAD MdtAB AcrEF (HME-ND) :Heavy Metal Efflux ND وهي المضخات التي تنقل العناصر الثقيلة -6 Delmar et ( copper- transporting efflux system (CusCFBA) وتشمل نضام واحد هو.E.coli يوضح الجدول )0-0( أمثلة مضخات الدفق الموجودة في بكتريا.)al.,2014 انظمة الدفق والمضادات الحيوية التي يتم..E coli خارج بكتريا نقلها جدول )1-1(: عائلة نظام الدفق Family MF MATE M نظام الدفق Efflux ystem EmrAB-TolC Bcr MdfA MdtG MdtH MdtL MdtM NorE EmrE نوع المضاد الحيوي المثبط Nal Tc, Km, Fos...Tc, if, Cmp, Ery, Neo, Fq Fos Fq Cmp Cmp, Fq Cmp, Fq, Fos, Tmp Tc 22

41 الفصل االول المقدمة واستع ارض الم ارجع Nal, Fos Ery Fq, ß-lactams, Tc, Cmp, Nov, Ery, Fus, i, 3rdGC Fq, ß-lactams, Tc, Cmp, Nov, Ery, Fus, if, 3rdGC AGs, Ery, PolyB Fos Fq Ery MdtJK MacAB-TolC AcrAB-TolC1 AcrEF-TolC 2 AcrD 2 -AcrA-TolC CusAB-? 2 MdtABC-TolC 2 MdtEF-TolC 2 ABC ND Nal: nalidixic acid; Tc: tetracycline glycylcyclines; Km: kanamycin; Fos: fosfomycin; if: rifampicin; Cmp: chloramphenicol; Ery: erythromycin; Neo: neomycin; Tmp: trimethoprim; Fq: (fluoro)quinolones; Nov: novobiocin; Fus: fusidic acid; AGs: aminoglycosides; PolyB: polymyxin B; Tmp: trimethoprim; ulf: sulfamethoxazole; 3rdGC: cefepime, cefpirome (Lai et al., 2016; Zhi li et al., 2016). ND )MexAB-OprM( الدفق نظام يتواجد عائلة من بكتريا في Acinetobacter الدفق ونظام AdeABC فيتواجد في بكتريا Pseudomonas aeruginosa ويعد نظام الدفق )AcrAB-TolC( في بكتريا E.coli االكثر شيوعا بالنسبة ألنظمة الدفق baumannii االخرى اذ تنمو في وسط يحتوي على كمية قليلة من المغذيات او عندما تنمو في طور الثباتstationary في كما الشكل )6-0( الذي يوضح شكل نظام الدفق )AcrAB-TolC( و يتواجد ايضا في.)Anes etal., 2015( Klebsiella بكتريا ssp. almonella و ssp. 23

42 الفصل االول المقدمة واستع ارض الم ارجع نظام الدفق )AcrAB-TolC( في بكتريا.E coli االمتكون من البروتين الموجود في الغشاء الداخلي الشكل )1-1(:.)Amaral et al., )2014 في الغشاء الخارجي Toic والقناة AcrA والبروتينات الموجودة في الف ارغ البالزمي AcrB 9... تفاعل البلمرة المتسلسل (PC) Polymeres Chain eaction هي عملية تضاعف المادة الو ارثية كما ونوعا ماليين الم ارت بالط ارئق االنزيمية وخارج الجسم الحي جدا. قصير بزمن وإلج ارء العملية يلزم توفر انزيم البلمرة Taq polymerase البادئات In vitro القواعد النيتروجينية منقوصة االوكسجين ثالثية الفوسفات (dntp) وقالب nitrogen bases primers avi et al., ; 6998 thermocycler الدنا DNA template التدوير وجهاز الح ارري )الخفاجي ويمكن استغالل هذه التقانة في التشخيص الجيني للكائنات الحية ومنها اف ارد العائلة المعوية.)2014 باستعمال البادئات الخاصة بالجين 16rNA اذ تستعمل بشكل واسع في Enterobacteriaceae 24

43 الفصل االول المقدمة واستع ارض الم ارجع تشخيص الكائنات الحية ومنها االحياء المجهرية اذ تسهل تشخيص المكروبات التي يمكن تنميتها بالط ارئق الزرعية التقليدية والتي تكون صعبة النمو والتشخيص بالط ارئق بشكل ايضا وتستعمل التقليدية كبير في التعرف على التنويع المكروبي في البيئة. تقوم هذه التقانة على اساس ان كل المكروبات تمتلك تسلسالت 16rNA المتكون من تسع مناطق متغايرة (V1-V9) hyper variable regions تتكون من تغاي ارت منها ما يكون على مستوى الجنس ومنها ما يكون على مستوى النوع ويتم مضاعفة التسلسالت النيوكليوتيدية للمناطق من الثابتة تقانة فتستعمل PC لتصنيف المكروبات الى اجناس وايضا تستعمل لتصنيف المكروبات 16rNA conserved regions من انواع متعددة تعود للجنس نفسه و تتبادل هذه المناطق مع المناطق الثابتة التي تستعمل لتصنيف مجاميع واسعة من المكروبات. فضال عن ان العديد من البكتريا تمتلك جين متطابق بنسبة %00 كما هو الحال في تشابه التسلسالت الجينية للجين التشخيصي لكل من 16rNA Khalaf and Al-kafaji, 2014 ; Jenkins et al., ( higella spp. بكتريا E. coli بكتريا و.)

44 الفصل الثاني المواد وط ارئق العمل

45 الفصل الثاني المواد وطرائق العمل 2. المواد وط ارئق العمل Materials and methods 1.2 المواد Materials االجهزة Laboratory equipments المختبرية جدول االجهزة -1: المختبرية المستعملة في الد ارسة 2 التسلسل الجهاز الشركة المصنعة )المنشأ( Kelon (Korea) refrigerator 1 ثالجة Biorad (U) ELIA جهاز االلي از )enzyme linked immunosorbent assay( 2 Optima (Japan) 3 جهاز الترحيل الكهربائي electrophoresis system GFL (Germany) water distillator 4 جهاز التقطير Daiham (outh Korea) bench centrifuge جهاز الطرد المركزي 5 FAWEM (Brazil) vortex 6 المازج جهاز ATTO (Japan) 7 جهاز تصوير الهالم gel documentation unit Bioneer (Korea) PC thermal cycler جهاز 8 التدوير الح ارري AcT Gen (Taiwan) جهاز قياس تركيز DNA nano drop الدنا 9 Mennert (Germany) incubator 10 حاضنة Daiham (outh Korea) water bath 11 حمام مائي DLTG (China) 12 فرن كهربائي electreic hot air oven Labtech (Korea) 13 كابينة الزرع (hood) laminar air flow ATTO (Japan) digital camera 14 كامي ار رقمية Brand-W(Germany) 15 ماصات دقيقة بأحجام مختلفة micropipettes 26

46 الفصل الثاني المواد وطرائق العمل Kruss (Germany) tuart (UK) Major science (Taiwan) Martini (UA) Webco (Germany) Denver (Germany) light microscope hot plate and magnetic stiror مجهر ضوئي مسخن ح ارري ممغنط مصدر لألشعة فوق البنفسجية ultraviolet transilluminator ph meter autoclave sensitive electric balance مقياس الرقم الهيدروجيني مؤصدة مي ازن كهربائي حساس المواد الكيميائية Chemical materials جدول 2-2: المواد الكيميائية المستعملة في الد ارسة التسلسل المادة الكيميائية الشركة المصنعة )المنشأ( BiobasicINK (Canada) BDH (England) agarose hydrogen peroxide االكاروز بيروكسيد الهيدروجين 1 2 DIFCO (England) BDH (England) ثالثي مثيل-فوسفات-ثنائي امين الفنيلين ثنائي كلوريد tetramethyl-p-phenylendiamine dihydrochloride H 2 O 4 الهيدروجي حامض الكبريتيك المركز 3 4 BDH (Englan( seder oil 5 العدسات زيت BDH (England) ethanol (70%) 6 كحول اثيلي Bioneer (Korea) 7 كحول اثيلي مطلق (99%) ethanol absolute 27

47 الفصل الثاني المواد وطرائق العمل BDH (England) BaCl 2. 2H 2 O 8 كلوريد الباريوم المائي BDH (England) NaCl 9 كلوريد الصوديوم BDH (England) glycerol 10 كليسيرول Bioneer (Korea) 11 ماء مقطر ال أيوني deionized sterile distal water Fluka (witzerland) 12 مسحوق البنفسج البلوري crystal violet powder CDH (UK) urea 13 يوريا االوساط الزرعية الجاهزة eady- made culture media جدول 3-2: االوساط الزرعية المستعملة في الد ارسة التسلسل الوسط الزرعي وسط احمر المثيل-فوكس بروسكاور Methyl ed-voges -Proskauer وسط اساس اكار الدم الشركة المصنعة )المنشأ( Himedia (India) Himadia (India) Blood Agar Base 1 2 COMagar (France) وسط اكار الكروم Chromagar Orientation اورينتيشن 3 (Holland) 4 وسط اكار المكونكي MacConkey Agar Himedia (India) Urea Agar Base اكار اليوريا اساس وسط 5 Oxoid (England) Eosin Methylelen Blue Agar وسط اكار ايوسين مثلين االزرق 6 Oxoid (England) 7 وسط اكار تريبتون الصويا Trypton oy Agar Himadia (India) 8 وسط اكار سيمون ستريت immon Citrat Agar Oxoid (England) 9 وسط اكار مولر-هنتون Muller-Hinton Agar 28

48 الفصل الثاني المواد وطرائق العمل Oxoid (England) 10 وسط اكار الهكتون المعوي Hekton Enteric Agar Oxoid (England) Nutrient Agar 11 وسط االكار المغذي Himedia (India) Pepton Water 12 وسط ماء الببتون Oxoid (England) Brain-Heart Infusion Broth وسط مرق نقيع القلب والدماغ 13 olutions, stains and reagents المحاليل الصبغات والكواشف جدول 4-2: الصبغات والكواشف والمحاليل المستعملة في الد ارسة التسلسل الصبغات والكواشف والمحاليل )المنشأ( الشركة المصنعة Geneaid (Thailand) loading dye 1 التحميل محلول Biobasic INK (Canada) 2 صبغة بروميد االثيديوم ethidium bromide Himedia (India) 3 كاشف احمر المثيل methyl red regent Vac and eralnst (Iraq) Kovac`s egent 4 كاشف كوفاكس Vac and eralnst (Iraq) Voges-Proskauer (VP1-VP2) فوكس- كاشف بروسكاور 5 محاليل صبغة ك ارم صبغة البنفسج البلوري crystal violet stain witzerland safranin stain 6 صبغة السف ارنين iodine االيودين ethanol %69 الكحول االثيلي Biobasic INC (UA) Chemical Point (Germany) Tris-Borate-EDTA buffer (TBE) phosphate buffer saline محلول دارئ الترحيل الكهربائي محلول دارئ الفوسفات الملح 7 8 chuchard (German) 9 محلول ملحي فسلجي normal saline solution 29

49 الفصل الثاني المواد وطرائق العمل المضادات الحيوية Antibiotics جدول 5-2: اق ارص المضادات الحيوية المستعملة في الد ارسة التسلسل الحيوي المضاد الرمز تركيز المضاد مايكروغ ارم/القرص الشركة المصنعة )المنشأ( 25 PY Carbenicillin 1 30 CTX Cefotaxime 2 30 CAZ Ceftazidime 3 10 CIP Ciprofloxacin 2 Bioanalyse (Turkey) E CN Erythromycin Gentamicin F Nitrofurantoin 7 30 NV Novobiocin 8 5 A ifampin 9 10 TE Tetracycline 11 30

50 الفصل الثاني المواد وطرائق العمل...6 العدد المختبرية Kits جدول 9-2: العدد المستعملة في الد ارسة التسلسل العدة المكونات الشركة المصنعة )المنشأ( -GT Buffer 30 ml -GB Buffer 40 ml Geneaid )Thailand) -W1 Buffer 45 ml -Wash Buffer 100 ml with Ethanol -Elution Buffer 30 ml -Proteinase K 1.1 with Deionized terile Distal Water -GD Columns 100 pcs -2ml Collection Tubes 100 pcs عدة استخالص الحمض النووي المجيني Mini Genomicالدنا Kit 1 Bioneer (Korea) Bioneer (Korea) الدليل الحجمي ) ( زوج قاعدة الدناLadder -Top DNA Polymerase 1U -dntp.(datp,dctp,dgtp,dttp) -reaction Buffer,With 1.5 mm MgCl 2 KCl 2 30mM -Tris-HCl (ph 9.0( 10mM -tabilizer and Tracking Dye (Laodding Dye) - tandard 96 PC tubes PC AccuPower PreMix

51 الفصل الثاني المواد وطرائق العمل 7... تسلسالت البوادئ Primer sequences جدول 7-2 تسلسالت البوادئ المستعملة في الد ارسة الناتج )زوج المصدر تتابع البادئ (5 3 ) sequence Primer قاعدي( CGAGTGGCGGACGGGTG F (Maleki et al., AGT ) TCGACATCGTTTACGGC GTGGA CTCTCAGGCAGCTTAGC F (Maleki et al., CCTAA ) TGCAGAGGTTCAGTTTTG ACTGTT GGTCGATTCCGTTCTCCG F (Maleki et al., TTA ) CTACCTGGAAGTAAACG TCATTGGT التسلسل الجين 16rNA acra acrb 8... المواد االخرى Other materials جدول 8-2: المواد االخرى المستعملة في الد ارسة التسلسل االداة الشركة المصنعة )المنشأ( Biozek(witzerland) petri dishes 1 أطباق بتري AFMA (Jordan) Geneaid (Korea) microtiter 96 wells plates eppendorf tubes أطباق معايرة تحتوي على أنابيب أبندو فر 69 حفرة tubes, beakers, flasks بيك ارت أنابيب فالسكات 4 AFCO (Jordan) cotton swabs 5 مسحات قطنية 32

52 الفصل الثاني المواد وطرائق العمل Girenier (China) 6 مسحات قطنية مع وسط نقل transporter swabs Himedia (India) loop 7 ناقل AFCO (Jordan) 8 وحدات ترشيح دقيقة (0.22) filter millipore 2.2 ط ارئق العمل Methods التعقيم terilization )2117( Brown and mith تم تعقيم االوساط الزرعية والمحاليل باستعمال طريقتان بحسب وكاالتي : التعقيم بالح اررة عقمت جميع االوساط الزرعية الجاهزة والتركيبية وأغلب المحاليل المستعملة في هذه الد ارسة والتي ال 2 15 باوند/أنج autoclave تتأثر بالح اررة بجهاز المؤصدة بدرجة ح اررة º121 م وتحت ضغط لمدة 15 دقيقة أما الزجاجيات فقد تم تعقيمها بالفرن الكهربائي oven درجة ح اررة عند 180 م لمدة ساعتين. التعقيم بالترشيح من قسم تم تعقيم المحاليل التي تتأثر طبيعتها بالح اررة مثل السكريات واليوريا وبعض الصبغات 1222 مايكروميتر. باستعمال وحدات الترشيح الدقيقة millipore filters ذات قطر 33

53 الفصل الثاني المواد وطرائق العمل تحضير االوساط الزرعية Preparation of culture media تحضير االوساط الزرعية الجاهزة eady-made cutler media preparation حضرت االوساط الزرعية الجاهزة وهي )وسط اكار chromagar Orientation اورنتيشن الكروم وسط Eosine Methyiene Blue MacConkey اكار المكونكي agar وسط االيوسين مثلين االزرق Methyl ed-voges Proskauer وسط اكار السيمون وسط احمر المثيل - فوكس بروسكاور Peptone Water وسط االكار ستريت immon s Citrate agar وسط ماء الببتون المغذي وسط مرق نقيع القلب والدماغ Brain-Heart Infusion Broth وسط اكار تربتون Nutrient agar Muller-Hinton agar الصويا Trypton oy agar ووسط اكار مولر- هنتون ) بحسب تعليمات م 121 الشركة المصنعة لها والتي كانت مثبتة على العبوة الخاصة بكل وسط عقمت ح اررة بدرجة المؤصدة 15 2 وضغط 15 باوند/انج لمدة دقيقة بعدها صبت االوساط الزرعية في أطباق بتري وأنابيب معقمة وحضنت بدرجة ح اررة 37 م لمدة 22 ساعة للتأكد من عدم تلوثها بعدها حفظت في الثالجة بدرجة 2 م لحين االستخدام. Laboratory culture media االوساط الزرعية التركيبة وسط اكار اليوريا Urea agar 22 تم تحضير هذا الوسط بحسب تعليمات الشركة المصنعة بإذابة و ذلك غ ارم من وسط اكار اساس اليوريا في 950 ملليتر من الماء المقطر المعقم ثم عقم الوسط بالمؤصدة ثم ترك ليبرد إلى درجة ح اررة 34

54 الفصل الثاني المواد وطرائق العمل %21 50 مº 50 ثم أضيف اليوريا محلول من ملليتر ( المحضر باذابة من اليوريا في غ ارم 1222 Millipore filter ملليتر من الماء المقطر ثم عقم باستعمال وحدات الترشيح ذات القطر مايكروليتر( ثم صب الوسط في انابيب معقمة وحفظ بدرجة 4 م لحين االستعمال.استعمل هذا الوسط.(Tille, 2017) للكشف عن قابلية البكتريا على انتاج انزيم اليوريا وسط أكار الدم Blood agar حضر وسط Blood agar base الدم أكار اساس حسب تعليمات الشركة المصنعة وعقم بالمؤصدة %5 ثم برد إلى درجة ح اررة 51 م بعدها أضيف إليه الدم بنسبة ومزج بلطف ثم صب في اطباق hemolycin بتري معقمة وترك ليتصلب. استعمل هذا الوسط للتحري عن انتاج انزيم الهيمواليسين من قبل العزالت قيد الد ارسة (2007 al.,.)forbes et وسط اكار الهكتون المعوي Hekton enteric agar حضر هذا الوسط بعد تعقيم الماء المقطر بالمؤصدة ثم برد الى درجة ح اررة 51 م بعدها اضيف اليه الوسط تحت الظروف المعقمة ومزج جيدا ثم صب في اطباق بتري معقمة وترك ليتصلب. استعمل.)Brown and mith, 2017( وباقي اجناس العائلة المعوية E. coli هذا الوسط للتفريق بين بكتريا 35

55 الفصل الثاني المواد وطرائق العمل تحضير المحاليل Preparation of solution محلول العكورة ماكفرالند McFarland حضر هذا المحلول مختبريا كما يأتي : BaCl 2. 2H 2 O اذيب )أ(: المحلول غ ارم من كلوريد الباريوم المائي 100 ملليتر من الماء في المقطر المعقم. H 2 O 4 الى 99 ملليتر من الماء اضيف )ب(: المحلول 1 ملليتر من حامض الكبريتيك المركز المقطر اضيف 0.5 ملليتر من المحلول الى )أ( ملليتر من المحلول للحصول على عكارة )ب( ) خلية/ملليتر 10 8 x 1.5 بتركيز ( ومزجت جيدا في قنينة زجاجية معتمة ومحكمة الغلق. (Vandepitte et al., 2003) لمنع تبخرها وحفظت في مكان مظلم لحين االستعما محلول صبغة البنفسج البلوري %1 Crystal violate solution Crystal violate powder حضر هذا المحلول بإذابة 1 غم من مسحوق البنفسج البلوري في 100 ملليتر من الماء المقطر ثم رشح المحلول باستعمال وحدات الترشيح الدقيقة ذات قطر نفاذية مايكروميتر وحفظ في الثالجة لحين االستعمال.استعمل هذا المحلول في الكشف عن تكوين الغشاء 0.22 للعزالت الحيوي البكتيرية قيد الد ارسة.)Christensen et al., 1985( 36

56 الفصل الثاني المواد وطرائق العمل محلول دارئ الترحيل (TBE) Tris Borate EDTA buffer 10 حضر هذا المحلول تعليمات بحسب الشركة المصنعة Biobasic بإضافة ملليتر من دارىء 1x بتركيز 10x الى 90 ملليتر من الماء المقطر المعقم للحصول على تركيز من الدارىء في قنينة TBE زجاجية معقمة ثم حفظ في الثالجة بدرجة ح اررة 2 م لحين االستعمال. محلول صبغة بروميد االيثيديوم Ethidium bromide الخاص بالكشف المظهري لمضخات الدفق 5 حضر محلول خزين 5 تركيزه ملغ ارم/ملليتر بأذابة ملغ ارم من مسحوق صبغة االثيديوم في بروميد ملليتر من الماء المقطر المعقم حضرخمس ت اركيز )5 25( مايكروغ ارم/ملليتر بعدها 1.)Martins et al., 2011( Phosphate buffer saline محلول دارئ الفوسفات الملحي (PB) 1000 حضر هذا المحلول حسب تعليمات الشركة المصنعة باذابة 9.86 غ ارم في ملليتر من الماء 7.2 المقطر للحصول على الرقم الهيدروجيني. استعمل هذا المحلول في تجربة الكشف عن تكوين الغشاء. الحيوي من قبل العزالت قيد الد ارسة محاليل البوادئ Primers solutions bioneer حضرت محاليل البوادئ وفقآ لتعليمات الشركة المصنعة و ذلك باستعمال الماء المقطر 111 بيكومول/مايكروليتر اذ تم تحضير محلول كل بادئ الالأيوني المعقم من اجل الحصول على تركيز 37

57 الفصل الثاني المواد وطرائق العمل على نحو منفصل فكان كل منها ذا تركيز بيكومول/مايكروليتر اخذ اذ تم 11 مايكروليتر من المحلول 11 الخزين لكل بادئ واضيف الى مايكروليتر من الماء المقطر الالأيوني ثم مزج جيدآ 61 stock solution م 21- بجهاز المازج vortex وحفظ في درجة ح اررة لحين االستعمال في حين حفظت المحاليل الخزينة للبوادئ في درجة ح اررة -21 م مع م ارعات مزج المحاليل جيدا بعد اخ ارجها من الثلج بجهاز المازج لغرض مجانستها قبل االستعمال تحضير الكواشف eagents preparation كاشف االوكسديز Oxidase reagent tetramethyl-p-phenylenediamine حضر هذا الكاشف وذلك بإذابة 1 غ ارم من مادة في مللتر من الماء المقطر المعقم وحفظ في قنينة زجاجية معتمة استعمل هذا 100 dihydrochloride للكشف الكاشف عن قابلية البكتيريا على انتاج انزيم االوكسديز( Alem, 2006.(Tadesse and كاشف الكتاليز Catalase reagent المتكون من هذا الكاشف حضر بيروكسيد الهيدروجين بتركيز %3 من المحلول االصلي بتركيز %30 وحفظ في قنينة معتمة استعمل هذا الكاشف للكشف عن قابلية البكتيريا إلنتاج انزيم الكتاليز.)Tadesse and Alem, 2006 ( 38

58 الفصل الثاني المواد وطرائق العمل العزالت البكتيرية Bacterial isolates Bacterial sample collection العينات جمع البكتيرية جمعت 111 بول عينة من المرضى الذين يعانون من اع ارض اصابات المسالك البولية وتحت اش ارف الطبيب المختص من مستشفيات مختلفة في مدينة بغداد شملت )مستشفى مدينة االمامين الكاظمين )ع( التعليمي مستشفى الطفل المركزي التعليمي ومستشفى بغداد التعليمي والمختب ارت التعليمية ومستشفى حماية.2118/11/1 الطفل التعليمي في مدينة الطب( 2118/7/11 للفترة من ولغاية اذ استعملت حاويات الجمع countainers لجمع العينة من منتصف البول في الصباح الباكر لجميع المرضى ثم زرعت العينات 37 وذلك باخذ 111 مايكروليتر من البول وزرعها على عدة اوساط تفريقية ثم حضنت بدرجة ح اررة م لمدة centrifuge ساعة. بعدها نبذت العينات مركزيا بجهاز المركزي النبذ بسرعة دورة/الدقيقة لمدة 22 دقائق ثم مزج ال ارسب بجهاز المازج لمدة نصف دقيقة بعدها وضعت قطرة من ال ارسب على الشريحة الزجاجية وفحصت تحت المجهر الضوئي باستخدام قوة تكبير يعد وجود خاليا دم بيض او اكثر في حقل المجهر فضال عن وجود ما بين مستعمرة نقية نامية في الطبق نتيجة موجبة التشخيص المزرعي Cultural identification درست الصفات المظهرية للمستعم ارت المعزولة بعد ز ارعة العزالت البكتيرية وتنقيتها على اوساط زرعية مختلفة )وسط اكار المكونكي وسط االيوسين مثلين االزرق وسط اكار الهكتون المعوي اكار الدم وسط ووسط اكار الكروم اورينتيشن( وشملت الد ارسة كل من الشكل والحجم والقوام واللون والحافات واالرتفاعات للمستعم ارت البكتيرية المعزولة ( 2017 al.,.)wanger et 39

59 الفصل الثاني المواد وطرائق العمل التشخيص المجهري Microscopic identification MacConkey حضرت مسحات من العزالت البكتيرية التي تم تنميتها على وسط اكار المكونكي عمرها ك ارم بتقانة ساعة ثم فحصت تحت المجهر الضوئي لرؤية شكل الخاليا وترتيبها والوانها )Levinson, 2016 تبعا لتفاعلها مع صبغة ك ارم ( التشخيص الكيموحيوي Biochemical identification اختبار االوكسديز Oxidase test نقلت مستعمرة نامية على وسط اكار المكونكي عمرها 22 ساعة على ورقة ترشيح filter paper بوساطة عيدان خشبية معقمة wooden sticks ثم اضيف اليها قطرة من كاشف االوكسديز المحضر مسبقآ وفقآ االرجواني في اللون الى يعد تغير )60-30( ثانية دليل على انتاج انزيم االوكسديز.) للفقرة (.)Hemraj et al., 2013( oxidase اختبار الكتاليز Catalase test نقلت مستعمرة نامية على وسط اكار المكونكي عمرها 22 ساعة على شريحة زجاجية معقمة وجافة بوساطة عيدان معقمة ثم اضيفت فوقها قطرة واحدة من كاشف بتركيز الكتاليز خشبية Wooden ticks يعد ظهور الفقاعات على سطح الشريحة الزجاجية دليل على انتاج انزيم الكتاليز.%3.)Hemraj et al., 2013( 40

60 الفصل الثاني المواد وطرائق العمل اختبار االندول Indole test pepton اجري هذا االختبار من خالل تلقيح انابيب الحاوية على االختبار الببتون ماء وسط بالمستعمر ات البكتيرية ثم حضنت لمدة ساعة وبدرجة ح اررة أضيف للوسط بعدها 37 مº water قطرة من كاشف.kovac s reagent كوفاكس يعد ظهور حلقة حمر اء اللون على سطح الوسط دليل على ايجابية االختبار 2007) al., (Forbes et اختبار المثيل االحمر Methyl red test لقحت االنابيب الحاوية على وسط المثيل االحمر فوكس بروسكاور )M-VP( بالمستعم ارت البكتيرية ثم حضنت لمدة 24 ساعة وبدرجة ح اررة مº ثم اضيف لكل انبوبة قط ارت من كاشف المثيل االحمر.methyl red regent يعد تحول لون الوسط الى االحمر دليل على ايجابية االختبار.)Hemraj et al., 2013) Voges- Proskauer test اختبار فوكس بروسكاور لقحت االنابيب الحاوية على وسط المثيل االحمر فوكس بروسكاور )M-VP( بالمستعم ارت 10 البكتيرية ثم حضنت لمدة 24 ساعة وبدرجة ح اررة 37 مº ثم اضيف لكل انبوبة من المحلول قطر ات نفثول االلفا ثم قط ارت من المحلول الثاني (VP2( هيدروكسيد 5 alpha naphthol االول (VP1( 5 البوتاسيوم KOH ثم رجت االنابيب جيدا ولوحظت النتائج بعد دقائق ثم سجلت النتائج بعد نصف ساعة. ظهور اللون االحمر دليل على ايجابية االختبار) 2017 mith,.)brown and 41

61 الفصل الثاني المواد وطرائق العمل اختبار استهالك الست ارت Citrate utilization test زرع وسط السيمون ستريت بمستعم ارت تم تنميتها بكتيرية على وسط المكونكي بطريقة التخطيط وحضن عند درجة ح اررة 24 ساعة. ولمدة 37 مº يعد تحول لون الوسط من األخضر إلى األزرق مع ظهور نمو بكتيري داللة على النتيجة الموجبة. استعمل هذا االختبار لغرض معرفة قابلية العزالت البكتيرية على استهالك Brown and ( الست ارت كمصدر وحيد للكاربون والطاقة وعلى استهالك أمالح االمونيوم كمصدر للنيتروجين.)mith, اختبار اليوريز Urease test تم تلقيح االنابيب الحاوية على وسط اكار اليوريا الذي تم تحضيره وفقا للفقرة ) ( من خالل م يعد 37 على التخطيط سطح الوسط المائل ثم حضنت لمدة 22 ساعة بدرجة ح اررة الى لون الوسط تحول الوردي دليل على اللون ايجابية االختبار. اجري هذا االختبار للكشف عن قابلية البكتريا على انتاج انزيم اليوريز 2017) (Tille, اختبار انتاج الهيمواليسين Hemolysin production test زرعت العزالت البكتيرية على االطباق الحاوية على وسط اكار الدم Blood agar وحضنت االطباق الفا بيتا كاما ) 22 ح اررة بدرجة 37 م لمدة ساعة ثم قرئت النتائج بمالحظة نوع التحلل (.)Tille, 2017( 42

62 الفصل الثاني المواد وطرائق العمل حفظ العزالت البكتيرية وادامتها Preservation of bacterial isolates الحفظ قصير المدى hort-term preservation زرعت االنابيب الحاوية على وسط االكار المغذي Nutrient agar بطريقة التخطيط بصورة مائلة و بالعزالت البكتيرية بطريقة التخطيط وحضنت االنابيب بدرجة 37 م لمدة ساعة 22 وجددت العزالت slant شهريا 2002) Prescotte,.)Harley and الحفظ طويل المدى Long-term preservation لقحت االنابيب الحاوية على 5 نقيع القلب والدماغ مرق وسط ملليتر من المحضر مسبقا وفقا للفقرة م 37 والمضاف الية %15 كليسيرول.E coli ثم حضنت بعزالت بكتريا االنابيب بدرجة هذه ) ( م لحين االستعمال )2003,.)WH 21- لمدة 22 ساعة بعدها حفظت االنابيب في درجة اختبار مقاومة البكتريا للمضادات الحيوية Antibiotic resistance test kirby-baure اختبرت حساسية.E coli بكتريا للمضادات الحيوية باستعمال طريقة بحسب ما جاء al. Vandepitte et وكاالتي : )2113 في ( نقلت )5-3( من المستعم ارت التي تم تنميتها اكار على وسط المكونكي بعمر 22 الى ساعة -1 normal saline انبوبة تحوي على 5 ملليتر من المحلول الملحي الفسلجي وضبطت للفقرة ) ( 1.5 المحلول مع عكارة محلول ماكفرالند عكارة المحضر مسبقا وفقآ والذي يعادل 1.5( )10 8 x خلية/ملليتر. 43

63 الفصل الثاني المواد وطرائق العمل ادخلت المسحة القطنية المعقمة في االنبوبة الحاوية على العالق البكتيري وتم تدويرها -2 وضغطها على الجدار الداخلي لالنبوبة إل ازلة اللقاح ال ازئد وبعد ذلك مررت على اطباق حاوية على وسط اكار مولر- متجانس. هنتون عدة م ارت وباتجاهات مختلفة للحصول على نمو وضعت اق ارص المضادات الحيوية على سطح الوسط المزروع وعلى ابعاد متساوية -3 وضغطت االق ارص بلطف باستعمال الملقط المعقم وبعدها حضنت االطباق بدرجة ح اررة º37 م لمدة 24 ساعة. سجلت نتائج التثبيط حول مناطق اقطار االق ارص بالملمتر وذلك باستعمال المسطرة ثم -4 قورنت النتائج بجداول قياسية )2017,.)CLI Biofilm formation test اختبار قابلية البكتريا على تكوين الغشاء الحيوي تم الكشف عن تكوين الغشاء الحيوي باستعمال طريقة الصفيحة العيارية microtiter plate المعقمة ذات )69( حفرة حسب ما جاء في مع اج ارء بعض التحوي ارت وكاالتي: )2117( Fusco et al. وسط مرق لقح نقيع القلب والدماغ بالمستعم ارت البكتيرية بعدها حضن لمدة 24 ساعة وبدرجة -1 م. ح اررة 37 وضع في حفر العمود االول لطبق المعايرة مايكروليتر من نقيع القلب والدماغ غير الحاوي على البكتيريا )سيطرة سالبة(. 44

64 الفصل الثاني المواد وطرائق العمل وسط مرق من مايكروليتر نقيع القلب والدماغ 3- وضع في الحفر الثالثة االولى للعمود الثاني 200 الملقح بالعزلة البكتيرية االولى )ثالث مكر ارت لكل عزلة( بعدها اتبعت الطريقة لكل عزلة نفسها الى العمود االخير. حضنت اطباق المعايرة لمدة 24 ساعة وبدرجة ح اررة م وبعد الحضن تم التخلص من 37-2 محتوى الحفر ثم غسلت بمحلول دارئ الفوسفات الملحي المحضر مسبقآ وفقآ للفقرة ) (. %1 المحضر crystal violate اضيف 200 مايكروليتر من صبغة البنفسج البلوري بتركيز مسبقا وفقآ للفقرة ) ( لمدة دقيقة ثم ازيلت الصبغة بغسلها بالماء المقطر المعقم وترك الطبق ليجف بدرجة ح اررة الغرفة لمدة 45 دقيقة. اضيف مايكروليتر من كحول االيثانول بتركيز %66. Optical Density )OD قيست الكثافة الضوئية ( باستعمال جهاز االلي از ELIA طول وعند -7 موجي 630 نانومتر. تم تحديد كفاءة العزالت في انتاج الغشاء الحيوي بمقارنة الق ارءات وفقآ للمعادالت االتية: -8 non-adherent تعد أ- العزلة غير مكونة للغشاء الحيوي اذا كان معدل الكثافة الضوئية للسيطرة اكبر او يساوي معدل الكثافة الضوئية للعزلة OD(.(ODc weakly adherent ب- تعد العزلة ضعيفة التكوين للغشاء الحيوي اذا كان معدل الكثافة الضوئية للعزلة اكبر من معدل الكثافة الضوئية للسيطرة او يساوي او اصغر من ضعفي الكثافة الضوئية للسيطرة.(ODc<OD 2xODc) 45

65 الفصل الثاني المواد وطرائق العمل moderately adherent ت- تعد العزلة متوسطة التكوين للغشاء الحيوي اذا كان معدل الكثافة الضوئية للعزلة اكبر من ضعفي الكثافة الضوئية للسيطرة او تساوي او اصغر من اربعة اضعاف السيطرة.(2xODc<OD 4xODc) strong adherent ث- تعد العزلة شديدة التكوين للغشاء الحيوي اذا كان معدل الكثافة الضوئية للعزلة اكبر من اربعة اضعاف معدل السيطرة) OD>4xOD ). Morphological detection of efflux الكشف المظهري عن مضخات الدفق pump حضرت التخافيف العشرية للعزالت البكتيرية كافة باستعمال محلول الملح الفسلجي المعقم وقورنت عكارته مع محلول ثابت العكورة القياسي )ماكفرالند(. اجري هذا الكشف على العزالت البكتيرية التي تمتلك صفة المقاومة للمضادات الحيوية والتي لها القابلية على تكوين الغشاء الحيوي biofilm باعتماد الطريقة المحورة عن طريقة العجلة الخشبية EtBr-agar cartwheel method باستعمال وسط تربتون اكار الصويا و صبغة بروميد االثيديوم بت اركيز مختلفة ما جاء في al. )2113( Martins et حسب وكما يأتي: ) , 11 حضرت ت اركيز مختلفة من صبغة بروميد االيثيديوم )5 مايكروغ ارم /ملليتر -1 بإضافة كميات مختلفة من الصبغة أعاله الى وسط اكار تربتون الصويا بعد تعقيمه وتبريده قليال. رجت األوساط جيدا وبعد تعقيمها صبت في أطباق معقمة تم تقسيمها مسبقا بصورة شعاعية -2 وحفظت في درجة ح اررة الثالجة لحين االستعمال. 3- مررت المسحات القطنية المعقمة على العالق البكتيري المخفف ثم ضغطت على الجدار الداخلي للتخلص من المزروع ال ازئد ثم زرعت بشكل خط شعاعي من حافة الطبق الى مركزه لكل عزلة ولكل تركيز بعدها حضنت االطباق بدرجة 19 ساعة. ح اررة 37 م ولمدة 46

66 الفصل الثاني المواد وطرائق العمل اختبرت العزالت البكتيرية وذلك باستعمال مصدر لالشعة فوق البنفسجية لمالحظة شدة التألق. -2 استخالص الحامض النووي Genomic DNA extraction المجيني استعملت العدة المجهزة من قبل شركة Geneaid لغرض استخالص الدنا المجيني النووي الحامض DNA nano drop اذ تم االستخالص بحسب البروتوكول المرفق واستعمل جهاز قياس تركيز الدنا لقياس وتركيز نقاوة الحامض النووي الدنا. المجيني تحضير هالم Preparation of agarose gel االكاروز )2111( وكاالتي: حضر بحسب طريقة ambrook and ussell 1x TBE Buffer 125 غ ارم من هالم االكاروز في 111 ملليتر من محلول الدارئ بتركيز 1- اذيب م 91 وباستخدام الصفيحة الح اررية لمدة 15 دقيقة وبدرجة ح اررة 5 درجة ح اررة 51 م وبعدها اضيف مايكروليتر من صبغة بروميد االيثيديوم 2- ترك الهالم ليبرد الى ومزجت جيدا مع الهالم. 3- صب هالم االكاروز في قالب الترحيل )Tray( بعد تثبيت االمشاط فيه بعدها ترك ليتصلب في درجة حر ارة الغرفة لمدة دقيقة. ثم ازيلت االمشاط من الهالم بعناية للحصول على الحفر. 31 المستخلص Extracted DNA التحري عن الحامض النووي المجيني loading dye مايكروليتر من عينة مع الدنا التحميل محلول من مايكروليتر مزج 5 بعدها نقل المزيج الى الحفر الموجودة في هالم االكاروز تركيزه %

67 الفصل الثاني المواد وطرائق العمل الحاوي على دارئ TBE بتركيز 2- نقل القالب الى حوض جهاز الترحيل الكهربائي tank اذ غمر سطح الهالم بمحلول الدارئ ورحلت عينات الدنا بإم اررها على فرق جهد قدره 1x فولت 111 ولمدة ساعتين. 3 -حددت الدنا حزم مواقع المستخلص باستعمال مصدر لالشعة فوق البنفسجية وبطول موجي ambrook and ( نانوميتر ثم صور الهالم لغرض التأكد من وجود الدنا 321.)ussell, 2001 Polymerase chain reaction (PC( تفاعل البلمرة المتسلسل PC PreMix AccuPower حضر مزيج هذا التفاعل باستعمال عدة وبحسب تعليمات الشركة المصنعة وكاالتي: (PC) 1- حضر مزيج تفاعل البلمرة في انابيب المتسلسل المجهزة مع العدة والحاوية على مكونات تفاعل البلمرة المتسلسل مع اضافة المكونات االخرى لمزيج التفاعل كما في جدول.)6-2( 2- اغلقت االنابيب ومزجت بجهاز المازج لمدة 5 ثوان. التدوير الح ارري لتفاعل البلمرة المتسلسل لغرض 3- نقلت االنابيب الى جهاز thermocycler اج ارء عمليات تضخيم الدنا amplification على وفق الظروف الح اررية المثلى للدو ارت.)ambrook and ussell, 2001) و اجري تفاعل Thermo Cycling Conditions البلمرة باستعمال جهاز المتسلسل التدوير الح ارري برمجته حسب التفاعل تمت بعد ان المبين في ) al.,.(maleki et الجدول 48

68 الفصل الثاني المواد وطرائق العمل الجدول 6-2: مكونات وحجوم مزيج تفاعل البلمرة المتسلسل PC التسلسل المكونات الحجم بالمايكروليتر 5 PreMix AccuPower 1 محلول 3 2 مستخلص الدنا المستعمل كقالب Template DNA Forward Primer eversed Primer البادئ Primer البادئ االمامي البادئ العكسي Deionized Nuclease Free Water الماء الالأيوني الخالي من االنزيم 5 25 Total volume 6 الحجم النهائي المتسلسل PC الجدول 11-2: الظروف المثلى إلج ارء تفاعل البلمرة التسلسل المرحلة درجة الح اررة المئوية )م ( الوقت عدد الدو ارت دقائق 5 دورة واحدة 65 مرحلة المسخ االولي Initial DNA Denaturation 1 31 دورة مسخ ال الدنا DNA Denaturation ثانية 2 49

69 الفصل الثاني المواد وطرائق العمل 31 ثانية 16srNA االرتباط acra/acrb Annealing 3 25 ثانية االستطالة Extention 2 مرحلة االستطالة النهائية Final Extention دقائق 5 دورة واحدة 72 5 التحري عن وجود حزم المضخم الدنا مايكرولتر من نقل الدنا المضخم )ناتج تفاعل الى الحفر )PC في هالم االكاروز تركيزه 5-1. %125 مايكروليتر من نقل الدليل الحجمي حجمه في زوج قاعدة DNA ladder 2-2 الحفرة االولى لقياس حجم المضخم وذلك الدنا بمقارنة حجم الجين المضخم مع حجوم الدليل الحجمي. غمر سطح الهالم بالدارئ بتركيز ورحلت عينات الدنا بإم اررها على فرق 1x TBE buffer 3 PC 81 جهد قدره 111 دقيقة بعدها ولمدة فولت تم فحص الهالم الحاوي على ناتج باستعمال 291 مصدر االشعة فوق البنفسجية UV-transiluminator وبطول موجي قدره و نانوميتر gel documentation unit بجهاز تصوير الهالم صور لتحديد الحزم وقياس او ازنها الجزيئية ladder عند مقارنتها مع مواقع الحزم التابعة الى الدليل الحجمي ذات األو ازن الجزيئية المعروفة زوج قاعدة. 50

70 الفصل الثاني المواد وطرائق العمل...15 التحليل التتابعي للجينات DNA sequencing ارسلت عينات للجينات الدنا مع البوادئ ( F( الى شركة acra,acrb,16srna )outh Korea Geumchen, eoul وتم تحليل النتائج وفقا لبرنامج ( Macrogen Inc المتوفر على موقع NCBI لمعرفة تسلسل وعدد القواعد DNATA lasergene Editeq النيتروجينية. 51

71 الفصل الثالث النتائج والمناقشة

72 الفصل الثالث النتائج والمناقشة.3 النتائج والمناقشة esults and discussion 3.3 عزل بكتريا Escherichia coli urinary tract جمعت 011 بول عينة من المرضى الذين يعانون من المسالك البولية اصابات من مستشفى االمامين الكاظمين )ع( التعليمي مستشفى الطفل المركزي التعليمي infections (UTIs) الطب ومستشفى بغداد التعليمي مستشفى حماية االطفال التعليمي والمختب ارت التعليمية في مدينة للمدة 8102/01/0 من 8102/7/01 الى وبعد اج ارء الفحوصات المظهرية المجهرية البايوكيميائية والجزيئية E. coli الحصول على تم 01 عزلة تعود الى بكتريا كما موضح في الجدول) 0-3 ( التشخيص المظهري Morphological identification شخصت E. coli عزالت بكتريا مبدئيا باالعتماد على الصفات المظهرية وذلك بعد تنميتها على كل Eosin Methyline وسط من وسط اكار المكونكي MacConkey agar اكار االيوسين مللين االرر Chromagar وسط اكار الدم Blood agar وسط اكار الكروماجين Blue agar (EMB) ووسط اكار المعوي الهكتون.Hekton Enteric agar اوضحت النتائج ان البكتريا كانت Orientation مخمرة لسكر الالكتور فأعطت مستعم ارت وردية ناعمة ولماعة وذات حافة حادة على وسط المكونكي اكار crystal violet التفريقي الذي يحتوي على امالح الصف ارء وصبغة البنفسج البلورية التي تسمح بنمو البكتريا السالبة لصبغة ك ارم بضمنها العائلة المعوية وتلبط نمو البكتريا الموجبة لصبغة ك ارم. واعطت العزالت مستعم ارت خض ارء معدنية لماعة على وسط اكار االيوسين مللين االرر وهذه الصفة من الصفات المميزة لبكتريا E. coli عن غيرها من اف ارد العائلة المعوية نتيجة الحتواء الوسط على صبغات االيوسين والمليلين 52

73 الفصل الثالث النتائج والمناقشة االرر التي تترسب في الوسط الحامضي بعد ارتباطها مع بعضها فتعطي لمعانآ اخضر معدنيآ يدل مما على ان البكتريا انتجت الحوامض العضوية نتيجة لتخميرها سكريات الالكتور والسكرور. وسط اكار اما الكروماجين فان البكتريا تنتج انزيمات تعمل على تحليل المولد اللوني المت ارفق β-glucuronidases او ما يسمى β-glucuronid chromagenic substrate فتحرر الحامل chromagenic conjugate اللوني فتعطي بذلك اللون الوردي للمستعم ارت البكتيرية. وكانت المستعم ارت التي تم chromaphore تنميتها على وسط اكار الدم اغلبها غير محللة للدم ما عدا عزالت ثالثة )%6( كانت محللة للدم تحلل كامل من نوع بيتا مما يدل على انتاج انزيم الهيمواليسين hemolysin كما موضح في β-hemolysis الشكل) 0-3 ( و الملحق )8(. عند تنمية المستعم ارت البكتيرية على وسط اكار الهكتون وجد انها المعوي اظهرت مستعم ارت صف ارء الى برتقالية اللون نتيجة لكونها بكتريا مخمرة لسكر الالكتور اذ يعد هذا الوسط من االوساط التفريقية التي تفر بين البكتريا السالبة لصبغة المخمرة لسكر ك ارم وغير الالكتور المخمرة لسكر الالكتور كذلك يفر بين Wanger et al., 2017; (.higella كل من بكتريا almonella و بكتريا وهذا يتفق مع ما جاء في.)Jawetzet al., 2016; harmin et al., 2010 اظهرت النتائج التي توصل اليها الباحث )8100( في الهند ان نسبة Bhattacharyya et al. عزالت بكتريا المعزولة من اصابات المسالك البولية المحللة للدم كانت )%01( كما اشار الى ان E. coli البكتيريا كانت متغايرة في انتاج انزيم الهيمواليسين لذا hemolysin فإنها كانت ضعيفة الض اروة. وبينت الد ارسة التي اج ارها الباحث )8101( ان معظم العزالت البكتيرية اظهرت مستعم ارت harmin et al. 53

74 الفصل الثالث النتائج والمناقشة وردية على وسط اكار الكروماجين و مستعم ارت بيضاء صغيرة حادة الحواف على وسط اكار الدم في حين ان )%78( منها اظهرت مستعم ارت وردية على وسط المكونكي. اكار الشكل المظهري لمستعم ارت بكتريا.E coli على عدة اوساط تشخيصية وهي )3- مستعم ارت وردية على الشكل )3-3(: -2 وسط اكار MacConkey agar المكونكي مستعم ارت خض ارء معدنية لماعة على االيوسين مثيلين اكار وسط Blood االزرق -3 Eosin Methylene Blue agar مستعم ارت بيضاء حليبية غير محللة للدم على وسط اكار الدم -5 Chromagar orientation مستعم ارت وردية على وسط اكار الكروم اورنتيشن مستعم ارت برتقالية -4 agar على وسط اكار الهكتون المعوي (. Hekton Enteric agar 54

75 الفصل الثالث النتائج والمناقشة التشخيص المجهري Microscopic identification تم اج ارء التصبيغ بصبغة ك ارم Gram s stain وذلك عن طريق المستعمرة من مسحة تحضير النامية على وسط اكار المكونكي عمرها )84-02( ساعة ظهرت خاليا عصوية قصيرة سالبة البكتريا Levinson لصبغة ك ارم وغير مكونة لألبواغ non spore forming وهذه النتائج تتفق مع جاء في ما.)2016( التشخيص الكيموحيوي Biochemical identification تم اج ارء االختبا ارت الكيموحيوية biochemical على جميع العزالت فكانت موجبة جميعها E. coli الختبار الكتاليز catalase test ان بكتريا اذ قد عملت على تحليل الكاشف بيروكسيد الهيدروجين oxidase test الى ماء و أوكسجين. وكانت البكتريا سالبة الختبار االوكسديز تحول لون عدم من خالل cytochrom oxidase المستعم ارت الى االرجواني عند اضافة الكاشف اذ ان البكتريا ال تمتلك انزيم urease test كمستقبل للهيدروجين وسالبة الختبار اليوريز لعدم تحول لون الوسط االمر الذي ان يؤكد البكتريا غير مستهلكة لليوريا لعدم امتالكها.urease انزيم اليوريز indole test اما نتائج اختبا ارت مجموعة ال IMViC فكانت البكتريا موجبة لكل من اختبار االندول isoamyl alcohol نتيجة لظهور حلقة حم ارء على سطح الوسط في طبقة الكحول االيزوميلي نتيجة لتح لل الحامض االميني التربتوفان triptophane انزيم بوساطة tryptophase ويعد هذا الكشف مهمآ في التفريق بين بكتريا.E coli واف ارد العائلة المعوية االخرى وذلك بعد الكشف عنه باستعمال كاشف كوفاكس methyl red test نتيجة لوجود الحامض الناتج موجبة الختبار و المليل االحمر Kovac s reagent 55

76 الفصل الثالث النتائج والمناقشة peptose glucose من استهالك وتخمير البكتريا لسكر الكلوكور و الببتور مما ادى انتاج الحامض وتغير االس الهيدروجيني للوسط مما ادى الى تحول لون الوسط الى اللون االحمر. كانت البكتريا الختبار سالبة ايضا الفوكس-بروسكاورVoges-Proskauer اللون ظهور نتيجة glucoe االصفر الى البني للوسط السائل الذي يعود سببه الى عدم تحويل البكتريا لسكر الكلوكور الى acetylmethylcarbinol كارب ون لي مليل استا لي (االستون (Acetoine مما يؤدي الى عدم تفاعل Acetoine potassium hydroxide (VP1) الكاشفين alphanaphthol و )VP2( مع االسيتون الختبار سالبة وكانت الناتج الست ارت Citrate الذي يدل على عدم استعمال البكتريا للست ارت كمصدر وحيد citrate permease للكاربون نتيجة لعدم امتالكها ألنزيم فكانت النتيجة عدم تغير لون الوسط للون ph citric acid لعدم المزر االخضر انتاج حامض الستريك وعدم تغير االس الهيدروجيني Tille, 2017; Brown and mith, 2017; harmin et al., ( ما جاء في مع وهذا يتوافق كل من.) التشخيص الجزيئي Molecular identification PC باالعتماد اخضعت جميع العزالت البكتيرية الى التشخيص الجزيئي وذلك باستعمال تقانة 16rNA الجين التشخيصي على الذي يتميز بكونه و قليل التغاير ثابتآ جينآ في النوع طويلة لمدة E. coli البكتيري واظهرت النتائج ان التسلسل الخاص بالجين التشخيصي الخاص ببكتريا موجود في جميع DNA ladder وجد ان الحزم العزالت وبنسبة )%011( وبالمقارنة مع الحزم المتضاعفة والدليل الحجمي 56

77 الفصل الثالث النتائج والمناقشة و )B8-3( الناتجة كانت ذات ورن جزيئي 787 روج قاعدة كما موضح في الشكل )A8-3( والمالحق.)A 6( و (A 0( تتفق نتائج هذه الد ارسة مع نتائج الد ارسة المحلية التي توصل اليها الباحلان جعار وهميم )8106( اذ بلغت )%011( 16rNA العزالت البكتيرية امتالك نسبة للجين تتفق كما الد ارسة الحالية ايضا مع الد ارسة Lai et Maleki التي توصل اليها الباحث al. et )8107( في اي ارن والد ارسة التي توصل اليها الباحث )8106( في ماليزيا اذ تم التشخيص الجزيئي لجميع العزالت البكتيرية باستعمال الجين التشخيصي al. وايضا Jenkins et تتفق نتائج الد ارسة الحالية مع نتائج الد ارسة التي اج ارها الباحث. al.16rna.16rna E. coli )8108( التي اظهرت ان حميع عزالت بكتريا كانت تمتلك للجين التشخيصي هذه تعد الطريقة من اسرع الط ارئق ودا في تشخيص البكتريا واكلرها حساسية في تشخيص conserved regions الممرضات ويحتوي هذا الجين على المناطق اللابتة التي تتداخل مع المناطق المتغايرة variable regions البالغ عددها 9 مناطق متغايرة التي يستفاد منها في تحديد هوية الجنس والنوع البكتيري وذلك لكون الجين التشخيصي 16rNA موجودا في كل االنواع البكتيرية كما انه قليل او التغاير ان التغيير العشوائي في التسلسل الجيني يكون ضئيل جدا على مر الزمن روج قاعدة من هذا الجين تكون كافية جدا لألغ ارض التعليمية والبحلية 2015( al.,.)uardana, 2014; rinivasan et 57

78 الفصل الثالث النتائج والمناقشة. جدول )3-3(: نتائج االختبا ارت التشخيصية لبكتريا.E coli االختبار النتائج esult Test النمو على وسط المكونكي MacConkey agar النمو على وسط االيوسين مللين االرر agar النمو على وسط اكار الدم مستعم ارت وردية مخمرة لسكر الالكتور lactose fermenting مستعم ارت خض ارء معدنية لماعة green metalic sheen متغايرة variable EMB Blood agar النمو على وسط اكار الكروم Chromagar orientation النمو على وسط اكار الهكتون المعوي Hekton Enteric agar صبغة ك ارم شكل الخاليا وتجمعها مستعم ارت وردية صغيرة مستعم ارت برتقالية صغيرة مخمرة لسكر الالكتور - عصيات rods _ انزيم االوكسديز انزيم الكتاليز انزيم اليوريا االندول المليل االحمر فوكس-بروسكاور gram stain oxidase catalase urease Indole methyl red Voges-Proskauer _ citrate 16rNA الست ارت الجين التشخيصي () اختبار موجب )-( اختبار سالب 58

79 الفصل الثالث النتائج والمناقشة E: M 727 زوج قاعدة (A) 100 E: M 727 زوج قاعدة 40 E39 E38 E37 E36 E35 E34 E33 E32 E31 E30 E29 E28 E27 E26 M (B) 100 الشكل )2-3(: الترحيل الكهربائي لناتج تفاعل البلمرة المتسلسل لجين )727 16rNA زوج قاعدة ) لعزالت بكتريا.E 80 دقيقة. المسار M 311 في %3.5 اكاروز agaros وفرق جهد فولت لمدة يمثل الدليل الحجمي ) coli )B 2-3( )E: 50 26( والمسا ارت )A 2-3 ( )E: 25 زوج قاعدة ) المسا ارت )1 في الشكل في الشكل تمثل عزالت بكتريا.E coli التي تمتلك الجين 16rNA 59

80 الفصل الثالث النتائج والمناقشة بعد التشخيص المظهري والكيموحيوي والجزيئي تم الحصول على )%01( عزلة بكتيرية تعود الى 01 بكتريا تعد بكتريا المسبب الرئيس الصابات المسالك البولية )UTIs( اذ تصيب E. coli اذ.E. coli حوالي %91 من المرضى الذين يعانون من اصابات المسالك البولية ( )UTIs في العالم )2016.)Levinson, تتوافق الد ارسة الحالية مع الكلير من الد ارسات المحلية والعالمية التي ذكرت ان بكتريا كانت من المسببات الرئيسة الصابات المسالك البولية ومن بين الد ارسات المحلية هي التي E. coli قام بها كل من شويخ وجاسم )8106( في مستشفيات مدينة بغداد والمناطق المحيطة بها المحلية والد ارسة التي قامت بها الباحلة البوصالح )8104( في مدينة القادسية فكانت نسبة عزل البكتريا )%4016( و) %06 ( من عينات التوال على البول ايضا مقاربة للد ارسة التي اج ارها الباحلان Ponnusamy و وكانت في الهند و ايضا مقاربة للد ارسة التي اج ارها الباحث )8102( في Hegazy et al. )8103( Nagappan مصر فكانت نسبة بكتريا من البكتريا المسببة الصابات المسالك البولية )%0417( و) %03.20 ( E. coli التوال. على بينما لم تتفق هذه الد ارسة مع نتائج الد ارسة التي توصل اليها الباحلان جعار وهميم )8106( في مدينة القادسية اذ بلغت نسبة العزالت البكتيرية المعزولة من اصابات المسالك البولية )%39116(. ان هذا االختالف في نسبة االصابة يعود الى االختالف في الظروف الجغ ارفية والصحية وعدد العينات فضال عن المضادات الحيوية تناول قبل اخذ العينة وجاسم )شويخ 8106(. كما ان سبب النسبة العالية لبكتريا قد يكون بسبب تكيف البكتريا للعيش في بيئة المسالك البولية وتحملها للظروف البيئية غير E. coli المالئمة فضال عن امتالكها الى عوامل ض اروة كليرة وقوية تزيد من قابليتها على احداث االصابة منها امتالكها لعوامل االلتصا التي تمكن البكتريا من الخطوة االولى من االصابة adherance وهي االلتصا وانتاج المحفظة capsule والسموم المحللة ألنسجة المضيف واهم سبب في النسبة العالية لهذه toxins 60

81 الفصل الثالث النتائج والمناقشة البكتريا في اصابات المسالك البولية هو انتقال البكتريا من فتحة المخرج تعد التي البيئة الطبيعية لها الى الفتحة البولية 2018( anjbar,.)aeispour and Antimicrobial resistance مقاومة بكتريا E.coli للمضادات الحيوية 2.. اختبرت حساسية العزالت البكتيرية لعشرة مضادات حيوية مختلفة وقد كانت البكتريا متباينة في مقاومتها لهذه المضادات المختبرة اذ كانت جميع العزالت البكتيرية متعددة المقاومة للمضادات الحيوية.multi-drug resistance (MD) )%92( 49 carbenicillin )%011( عزلة اظهرت النتائج ان 01 بكتيرية مقاومة للمضاد الحيوي 44 rifampin )%94( 47 erythromycin عزلة مقاومة للمضاد الحيوي عزلة مقاومة للمضاد الحيوي )%76(32 عزلة مقاومة للمضاد الحيوي ceftazidime عزلة مقاومة للمضاد الحيوي )%22( )%66( 33 عزلة مقاومة للمضاد )%74( 37 عزلة مقاومة للمضاد الحيوي novobiocin cefotaxime )%31( 00 ciprofloxacin 86 الحيوي tetracycline )%08( عزلة مقاومة للمضاد الحيوي عزلة nitrofurantoin )%4( مقاومة للمضاد الحيوي gentamicin وعزلتان مقاومة للمضاد الحيوي كما موضح في الشكل )3-3( و الملحق )0(. carbenicillin تتفق نتائج هذه الد ارسة بالنسبة للمضاد الحيوي مع الد ارسات السابقة النتائج ومنها Ibrahim et al. المحلية التي توصلت اليها الباحلة )8104( التي بلغت فيها نسبة العزالت البكتيرية المقاومة للمضاد الحيوي carbenicillin )%011( اذ بينت هذه الد ارسة ان العديد من انزيمات plasmid في البيتاالكتاميز β-lactamases التي يتم التحكم بها من قبل الجينات المحمولة على البالرميد 61

82 النسبة المؤية للمقاومة )%( الفصل الثالث النتائج والمناقشة البكتريا السالبة لصبغة ك ارم يمكنها ان تحلل كل من المضادات الحيوية الكاربنسلين carbenicillin واالمبسلين والسيفالوثين وغيرها من المضادات الحيوية التابعة نفسها للمجموعة cephalothin ampicillin )8107( وايضا تتوافق نتائج الد ارسة الحالية مع النتائج التي توصل اليها al. Hinthong et الباحث والتي بلغت فيها نسبة العزالت البكتيرية المقاومة لهذا المضاد الحيوي )%9818(. 120% 100% 100% 98% 94% 88% 94% 80% 76% 74% 66% 68% 60% 40% 20% 0% 2% 2% 6% 52% 42% 26% 24% 30% 16% 10% 8% 10% 6% 2% 2% 4% 2% المضادات الحيوية نسبة العزالت االحساسة نسبة العزالت المتوسطة نسبة العزالت المقاومة النسبة المئوية لمقاومة بكتريا.E coli لمضادات حيوية مختلفة باستعمال طريقة Kirby-Bauer بعد الشكل )3-3(: تنميتها على وسط وسط اكار مولر- هنتون. Farsimadan بينما لم تتفق نتائج هذه الد ارسة مع النتائج التي توصل اليها الباحلان Kafilzadeh و نسبة مقاومة كانت اذ العزالت البكتيرية لهذا المضاد الحيوي )%4812( ان البكتريا واشاروا الى )8106( قد استعملت اليات عديدة في المقاومة لهذا المضاد الحيوي كما اشاروا الى ان اسباب المقاومة العالية ألكلر 62

83 الفصل الثالث النتائج والمناقشة المضادات الحيوية تعود الى االستعمال المفرط للمضادات الحيوية الطف ارت التي تشفر لإلنزيمات فضال عن انتقال المقاومة بوساطة البالرميد.plasmid cephalosporins اما نتائج الد ارسة الحالية بالنسبة لمضادات الجيل اللالث من مجموعة السيفالوسبورينات cefotaxime التي تتضمن المضادين الحيويين ceftazidime و فتتفق مع الد ارسة التي قام بها الباحث E. coli ح ارن )8108( الذي وجد ان بكتريا كانت عالية المقاومة للمضادات التابعة لمجموعة الحيوية البيتاالكتام β-lactams اذ كانت نسبة مقاومة البكتريا لهذين المضادين الحيويين )%7216( و )%7616( التوال. على وايضا تتفق مع الد ارسة التي توصل اليها الباحث. al )8106( uresh et والتي بلغت في الهند فيها نسبة العزالت البكتيرية المقاومة لهذين المضادين الحيويين )%92( و )%011( على ان وبينوا التوال السبب الرئيس لهذه المقاومة العالية للبكتريا هو امتالكها مضخات دفق كفوءة في المضادات الحيوية طرح Hegazy خارج الخلية وا ارلة تأثيرها الضار بالخلية و ان هذه الد ارسة جاءت مقاربة لما توصل اليه الباحث )8102( في مصر التي بينت د ارستهم ان نسبة عزالت بكتريا E.coli المقاومة للمضاد الحيوي et al )8102( الباحث. al Hegazy et لم تتفق نتائج هذه الد ارسة مع د ارسة )%7414( بينما cefotaxime له )%6413(. بالنسبة للمضاد الحيوي ceftazidime فيها نسبة بلغت اذ البكتريا مقاومة )8100( في Lee et al. اختلفت نتائج الد ارسة الحالية مع نتائج الد ارسة التي توصل اليها الباحث كوريا الشمالية والد ارسة التي توصل اليها الباحلان و )8106( والد ارسة التي Farsimadan Kafilzadeh )%612( و )8107( توصل اليها الباحث. al Maleki et اذ في اي ارن بلغت نسبة مقاومة البكتريا )%0010( و) %4818 ( بالنسبة للمضاد الحيوي ceftazidime و التوال على )%3219( و) %8610 ( 63

84 الفصل الثالث النتائج والمناقشة cefotaxime و) %31 ( بالنسبة للمضاد الحيوي على التوال وقد بينت د ارستهم ان السبب المقاومة في.efflux pumps لهذين المضادين الحيويين قد يعود الى ان البكتريا تمتلك كانت انظمة الدفق الطبيعية β-lactams من اسباب مقاومة بكتريا.E coli لمضادات البيتاالكتام هو انتاج انزيمات penicillinase cephalosporinase البيتاالكتاميز β-lactamases التي تتضمن انزيمات و اذ تعمل هذه االنزيمات على β-lactam حلقة البيتاالكتام تحطيم فتلبط عمل المضادات الحيوية التابعة لمجاميع البنسللينات penicillins والسيفالوسبورينات cephalosporins ايضا من اسباب المقاومة هو تغيير في نفاذية الغشاء الخارجي للخلية البكتيرية و امتالكها انظمة الدفق efflux pumps واالكلر شيوعا هو نظام Platansing, ( E. coli ND الدفق AcrAB-ToIC التابع لعائلة الذي يكون اكلر شيوعا في بكتريا ; الشويخ.) تتفق نتائج الد ارسة الحالية بالنسبة للمضاد الحيوي السبروفلوكساسين ciprofloxacin التابع لمجموعة الكينولينات مع النتائج التي توصل اليها الباحث al. )8106(Tajbakhsh et في quinolones كانت اي ارن اذ نسبة مقاومة البكتريا لهذا المضاد الحيوي )%06180( وقد بين ان نسبة المقاومة للمضادات الحيوية بضمنها هذا المضاد الحيوي تكون اعلى في العزالت البكتيرية المنتجة للغشاء الحيوي biofilm منها ameriz- في العزالت البكتيرية غير المكونة له وايضا تتفق مع النتائج التي توصل اليها الباحث نسبة مقاومة كانت اذ المكسيك في البكتريا لهذا المضاد الحيوي )%4713( )8102( Castillo et al. وقد بين ان المقاومة العالية للسبروفلوكساسين ciprofloxacin تعود الى ان هذه المجموعة من المضادات الحيوية كانت تملل االختيار االول بالنسبة لعالج استعمالها بشكل مفرط. اصابات المسالك البولية في المكسيك ما ادى الى 64

85 الفصل الثالث النتائج والمناقشة تتفق هذه الد ارسة ايضا مع نتائج الد ارسة التي توصل اليها الباحث. al Malekzadegan et )8102( في اي ارن التي بينت ان نسبة )%0016( من العزالت البكتيرية كانت للمضاد الحيوي مقاومة فضال عن انها بينت ان النسبة العالية للمقاومة تكون اعلى في العزالت البكتيرية المأخوذة ciprofloxacin من البول منها في العزالت البكتيرية المأخوذة من المواقع االخرى من الجهار البولي ملل الحالبان والكلى وان هذا المضاد الحيوي يعد اكلر مضاد حيوي من مجموعة الكينولينات quinolones استعماآل في عالج اصابات المسالك البولية وان االستعمال المفرط له ادى الى ريادة نسبة المقاومة بشكل ملحوظ في السنوات االخيرة وايضا تتفق مع نتائج الد ارسة التي قام بها الباحث al. Abdu et )8102( في نيجيريا اذ كانت نسبة مقاومة البكتريا لهذا المضاد الحيوي )%46( وقد بين ان البكتريا كانت متعددة المقاومة للمضادات )8104( اذ Asadi الحيوية. بينما لم تتفق نتائج الد ارسة الحالية مع النتائج التي توصلت اليها الباحلة كانت نسبة مقاومة البكتريا لهذا المضاد الحيوي )%8017(. quinolones من اسباب مقاومة بكتريا.E coli للمضادات الحيوية التابعة لمجموعة الكينولينات efflux هي تغيير في الموقع الهدف تقليل في نفاذية الغشاء الخارجي للبكتريا و امتالكها ألنظمة الدفق التي تشمل )2015.)Paltansing, وتلبيط تصنيع ال (AcrAB-ToIC, MdfA,YhiV( pumps Zaman et al., ( عن طريق تلبيط انزيم DNA gyrase او بفعل حدوث طف ارت جينية فيه DNA.)2017 gentamicin اظهرت نتائج الد ارسة الحالية بالنسبة للمضاد الحيوي جنتامايسين التابع لمجموعة االمينوكاليكوسايدات aminoglycosides نتائج متوافقة مع النتائج التي توصل اليها الباحث )8106( التي بينت ان نسبة العزالت المقاومة لهذا المضاد الحيوي كانت )%37( وايضا uresh et al. 65

86 الفصل الثالث النتائج والمناقشة )8102( ameriz-castillo et al. تتوافق مع النتائج التي توصل اليها الباحث المكسيك اذ بلغت في نسبة مقاومة البكتريا لهذا المضاد الحيوي )%8218( واشارت هذه الد ارسة الى ان المضاد الحيوي يعد الخيار االفضل في عالج اصابات المسالك البولية. بينما لم تتفق نتائج هذه الد ارسة مع gentamicin )8104( النتائج التي توصلت اليها الباحلة Asadi اذ بلغت نسبة مقاومة البكتريا لهذا المضاد الحيوي وقد بينت ان هذه المقاومة نسبة تعود الى ان بكتريا.E coli تمتلك عوامل ض اروة ضعيفة جدا ال )%0017( تمكنها من مقاومة التأثير القاتل للمضادات الحيوية. من اسباب مقاومة بكتريا.E coli للمضادات الحيوية التابعة لمجموعة االمينوكاليكوسايدات هي امتالك البكتريا ألنظمة الدفق التابعة للعائلة ND وتغيير في نفاذية الغشاء aminoglycosides الخارجي للخلية البكتيرية.)Paltansing,2015( عن فضال امتالكها االنزيمات المحورة N-acetyl ملل phosphotransferase و Aminoglycoside Modifying Enzymes (AMEs).)Zaman et al., 2017( transferase tetracycline تتفق نتائج الد ارسة الحالية بالنسبة للمضاد الحيوي تت ارسايكلين مع النتائج التي )8106( توصل اليها الباحث al. Tajbakhsh et في اي ارن اذ كانت نسبة مقاومة البكتريا لهذا المضاد tetracycline الحيوي )%70( وقد بين هؤالء الباحلين ان معظم العزالت البكتيرية المقاومة ل كانت منتجة للغشاء الحيوي biofilm نتيجة المتالكها عوامل ض اروة قوية وتتفق ايضا مع النتائج التي توصل اليها Abozahra الباحلان Abdelhamid و )8107( في مصر اذ بلغت نسبة مقاومة البكتريا لهذا المضاد وقد بين هذان ان الباحلان اهم عامل مسبب للمقاومة في بكتريا.E coli هو امتالكها الحيوي )%6413( لمضخات الدفق وعند تلبيط هذه المضخات تسترجع البكتريا حساسيتها للمضادات الحيوية بشكل كبير. بينما 66

87 الفصل الثالث النتائج والمناقشة لم تتفق هذه الد ارسة مع النتائج التي توصل اليها الباحث في بنغالدش وقد بينت ان )8106( Islam et al. نسبة مقاومة البكتريا لهذا المضاد الحيوي )%86167( اذ واسعة الطيف بينما كانت حساسة لهذا المضاد الحيوي. كانت العزالت البكتيرية مقاومة للمضادات الحيوية من اسباب مقاومة بكتريا عزالت لمضادات التت ارسايكلين tetracyclines هي تغيير في E. coli نفاذية الغشاء الخارجي وامتالكها ألنظمة الدفق مضخات الدفق السيما للعائلة التابعة efflux pumps.)kapoor, 2017 ( ND الموقع الهدف في وتغيير اظهرت نتائج الد ارسة الحالية مقاومة عالية جدا للمضاد الحيوي erythromycin التابع لمجموعة Abera Kibret الماكروليدات macrolides وهذه النتائج مقاربة للنتائج التي توصل اليها الباحلان و كانت نسبة مقاومة البكتريا لهذا المضاد الحيوي وايضا جاءت مقاربة للنتائج التي )2914( )8100( اذ Pricop et al. )8104( توصل اليها الباحلان Onuoha وFatokun والنتائج التي توصل اليها الباحث التي بينت ان نسبة مقاومة البكتريا لهذا المضاد الحيوي كانت عالية جدا اذ بلغت )%2012( و )8100( التوال. بينما لم تتفق الد ارسة الحالية مع النتائج التي توصل اليها الباحلان Kafilzadeh و )%011( على )8106( في اي ارن اذ بلغت نسبة مقاومة البكتريا لهذا المضاد الحيوي )%0812(. Farsimadan من اسباب مقاومة بكتريا عزالت للمضادات.E coli الحيوية التابعة لمجموعة الماكروليدات هي التحلل المائي الذي يعمل على تحلل المضاد الحيوي وتلبيط فعاليته hydrolysis macrolides انتاج انزيمات و التي تلبط عمل المضاد الحيوي وامتالك انظمة phosphorylation Glogsylation target alteration AcerAB-ToIC مضخة الدفق السيما الدفق فضال عن تغيير في الموقع الهدف.)Zaman et al., 2017( 67

88 الفصل الثالث النتائج والمناقشة novobiocin جاءت نتائج الد ارسة الحالية بالنسبة للمضاد الحيوي متقاربة مع النتائج التي توصل اليها الباحث al. Poongothai et )8108( التي اظهرت ان نسبة العزالت البكتيرية المقاومة لهذا المضاد Farsimadan Kafilzadeh الحيوي بلغت )%9810( مع ومتفقة النتائج التي توصل اليها الباحلان و في اي ارن اذ بلغت نسبة مقاومة البكتريا لهذا المضاد الحيوي )%6213( بينما اظهرت التي النتائج )8106( )8104( توصل اليها الباحلان Avşar و Berber نسبة ان عالية جدا من العزالت البكتيرية التابعة لبكتريا E. coli كانت مقاومة لهذا المضاد الحيوي والتي بلغت )%011(. ومن اهم اسباب مقاومة بكتريا E. coli efflux pumps للمضاد الحيوي novobiocin هي امتالكها ألنظمة الدفق فضال عن انتقال صفة المقاومة اليها بوساطة البالرميدات plasmids فضال عن حصول الطف ارت الو ارثية العشوائية التي تحور من مكونات الخلية البكتيرية وتحولها الى بكتريا مقاومة ( Berber, Blair et al., 2014 ; Avsar and.)2014 يعد المضاد الحيوي nitrofurantoin من اقدم وافضل المضادات الحيوية التي يجب استعمالها في عالج المرضى المصابين باصابات المسالك البولية وذلك للمقاومة الضعيفة التي اظهرتها العزالت التابعة لبكتريا البكتيرية.E coli لهذا المضاد الحيوي. جاءت هذه الد ارسة متوافقة مع الكلير من الد ارسات Mittal et al. السابقة ومنها نتائج الد ارسة التي توصل اليها الباحث )8104( في الهند ونتائج الد ارسة )8100( التي توصل اليها الباحث al. Abujnah et في مصر و نتائج الد ارسة التي توصل اليها الباحث في اي ارن بعد عزلهم للبكتريا من المرضى الذين يعانون من اصابات المسالك البولية )8106( Tajbakhsh )%6( و )%019( اظهرت نتائجهم ان نسبة مقاومة البكتريا لهذا المضاد الحيوي كانت ضعيفة جدا اذ بلغت al. )8100( Mishra et في و) %6180 ( التوال. بينما على اظهرت نتائج الد ارسة التي توصل اليها الباحث 68

89 الفصل الثالث النتائج والمناقشة )8102( الهند ونتائج الد ارسة التي توصل اليها الباحث al. Abdu et في السودان ان نسبة مقاومة )%4010( و )%88( nitrofurantoin للمضاد الحيوي البكتريا بلغت على التوال. ومن اسباب مقاومة البكتريا لهذا المضاد الحيوي هو امتالكها ألنظمة الدفق efflux pumps قلة نفاذية الغشاء الخلوي وحدوث الطف ارت الكروموسوية ( 2017 al.,.)kapoor, 2017 ; Zaman et 3.3 انماط المقاومة المتعددة للمضادات الحيوية لعزالت بكتيريا.E coli esistance profile (antibiotype) اضهرت جميع.E coli عزالت بكتريا مقاومة متعددة لمجموعة مضادات حيوية مختلفة اذ كانت من بكتريا عزلتان.E coli هي )E21-E9( مقاومة للالثة مضادات حيوية هي بكتيرية عزالت ثالثة E28-E26 E25-E12 ( 6 مقاومة ل 4 مضادات حيوية هي بكتيرية عزالت )E39-E4-E1( كانت -E23-E22-E20-E17-E5 ( 9 كانت مقاومة ل 0 مضادات حيوية هي بكتيرية عزالت )E38-E33- E16--E15- E14-( 2 )E43-E42-E34- E30 كانت مقاومة ل 6 مضادات حيوية هي بكتيرية عزالت مضادات حيوية 03 هي -E7-E6-E3) بكتيرية عزلة -E37 E11( E50-E46-E45- كانت مقاومة ل 7 )E48-E49-E41-E40-E35-E31-E29-E18-E13-E10 كانت مقاومة ل 2 مضادات حيوية 2 عزالت 9 هي بكتيرية )E47-E44-E36-E32-E27-E19-E8-E2( كانت مقاومة ل مضادات حيوية و عزلة 01 هي واحدة بكتيرية )E24( كانت مقاومة ل مضادات حيوية كما في الجدول )8-3(. 69

90 ةشقانملاو جئاتنلا ثلاثلا لصفلا 70 :)2-3( لودجلا ايريتكب تلازعل ةيويحلا تاداضملل ةددعتملا ةمواقملا طامنا E. coli Antibiotype PY E A CAZ CTX NV TE CIP CN F ددع )%(تلازعلا.3 8 )%4(.2 8 )%4(.3 0 )%8(.4 0 )%8(.5 0 )%8(.6 8 )%4(.7 0 )%8(.8 0 )%8(.9 0 )%8(.31 0 )%01(.33 8 )%4(.32 0 )%8(.33 3 )%6(.34 3 )%6(.35 0 )%8(.36 0 )%8(.37 0 )%8( )%81(.39 8 )%4(.21 7 )%04(.23 0 )%8(.22 0 )%8( E: Erythromycin, PY: Carpenicillin, A: ifampin, NV: Novobiocin, CAZ: Ceftazidime, CTX: Cefotaxime, TE: Tetracycline, CN: Gentamicin, F: Nitrofurantoin, CIP: Ciprofloxacin.

91 الفصل الثالث النتائج والمناقشة )8104( والنتائج Ibrahim et al. تتفق هذه النتائج مع النتائج المحلية التي توصلت اليها الباحلة المحلية التي توصلت اليها الباحلة العبيدي )8107( التي اظهرت ان نسبة العزالت البكتيرية المتعددة Ali et al. المقاومة للمضادات الحيوية كانت ( %011( وايضا تتفق مع النتائج التي توصل اليها الباحث )8104( في باكستان والنتائج التي توصل اليها الباحث )8102( في مصر اذ كانت Gawad et al. نسبة العزالت المتعددة المقاومة للمضادات الحيوية ( و) %96177 ( وكان التوال على )%7710( ) MD منها ما هو مقاوم لمضادين حيويين ومنها ما هو مقاوم ألكلر من ثالثة مضادات حيوية. بينما لم تتفق النتائج الحالية مع النتائج التي توصل اليها الباحث. al Bhattacharyya et )8100( و النتائج التي توصل اليها الباحث كانت )8102( اذ نسبة العزالت البكتيرية المتعددة المقاومة amírez Castillo et al. للمضادات الحيوية )%80( و )%6313( على التوال اذ بين كل منهما ان البكتريا كانت مقاومة لمضادين حيويين فأكلر. ان السبب الرئيس لهذه المشكلة الخطيرة يرجع الى الزيادة الكبيرة في مقاومة البكتريا للمضادات الحيوية الواسعة الطيف نتيجة االستعمال المفرط ( وان لهذه المضادات الحيوية 2018 al.,) Gawad et مقاومة بكتريا المسببة الصابات المسالك البولية تملل خط ار كبي ار على الصحة العامة ألنها مقاومة E. coli.)polse et al., 2016 لمختلف مجاميع المضادات الحيوية (..4 تكوين الغشاء الحيوي Biofilm formation اجري الكشف عن قابلية بكتريا على تكوين الغشاء الحيوي biofilm باستعمال طريقة E. coli الصفيحة العيارية ذات ال حفرة واظهرت النتائج ان نسبة عالية من 96 microtiter plate method 71

92 الفصل الثالث النتائج والمناقشة E. )%91( 40 بكتريا عزالت.E coli كانت منتجة للغشاء الحيوي. فكانت بكتريا تعود الى بكتيرية عزلة لها القابلية على انتاج الغشاء الحيوي وبدرجات مختلفة وذلك بالمقارنة مع السيطرة السالبة فكانت coli )%08( 6 strong adherent عزلتان )%4( منها لها القابلية على االنتاج القوي للغشاء الحيوي عزالت )%74( بكتيرية لها القابلية على االنتاج المتوسط للغشاء الحيوي moderately adherent و 37 عزلة بكتيرية لها القابلية على االنتاج الضعيف للغشاء الحيوي weakly adherent الشكل )3- كما موضح في 4( و الشكل )0-3( والملحق )8(. تتفق نتائج الد ارسة الحالية في قابلية البكتريا على تكوين الغشاء الحيوي مع النتائج التي توصل اليها الباحث Tajbakhsh )8106( والتي اظهرت ان نسبة العزالت البكتيرية التي لها القابلية على انتاج الغشاء )8102( Gawad et al. الحيوي كانت )%011( وتقارب ايضا نتائج الد ارسة التي قام بها الباحث في )8102( مصر والنتائج التي توصل اليها الباحث al. poursina et في الهند التي بلغت فيها نسبة )%21( العزالت البكتيرية التي لها القابلية على انتاج الغشاء الحيوي )%7610( بينت هذه التوال اذ على و E. coli الد ارسة ان االشخاص المصابين باصابات المسالك البولية التي تسببها بكتريا المنتجة للغشاء الحيوي يكونوا اكلر عرضة لإلصابة مجددا بالمرض بعد الشفاء منه. بينما اظهرت نتائج الد ارسة التي )8100( توصل اليها الباحث al. Mishra et في الهند والنتائج التي توصل اليها الباحث )8106( في النيبال ان نسبة العزالت البكتيرية التي لها القابلية على انتاج الغشاء Neupane et al. الحيوي كانت )%01( و )%3916( على التوال. 72

93 الفصل الثالث النتائج والمناقشة Negative السيطرة السالبة control trong adherent القوية االنتاج Moderately المتوسطة االنتاج Weakly الضعيفة االنتاج غير المكونة للغشاء الحيوي biofilm-non formation الشكل )4-3(: انتاج الغشاء الحيوي biofilm من قبل عزالت بكتريا.E coli بطريقة الصفيحة العيارية ذات 96 حفرة. تعد قابلية بكتريا.E coli على انتاج الغشاء الحيوي احد اهم عوامل ض اروة البكتريا التي تمنحها البكتريا المقاومة ألغلب المضادات الحيوية )2013.)oto, عند تواجد البكتريا في البيئة السائلة وعند توافر الظروف البيئية سوف تتحول من بكتريا غير منتجة للغشاء الحيوي تعيش في البيئة السائلة الى بكتريا منتجة للغشاء الحيوي تعيش على السطوح الصلبة اذ تعمل البكتريا عدة تحوي ارت وتغي ارت لتالئم البيئة الجديدة pilli ومنها التغي ارت في التعبير عن الجزيئات السطحية ملل المستقبالت الموجودة على سطح االسواط وعوامل الض اروة virulence factors والمخلفات االيضية ملل الحوامض والكاربوهيد ارت والسموم وغيرها فتتاح للبكتريا فرصة اكبر للبقاء في الظروف غير المالئمة )2014.)oto, 73

94 الفصل الثالث النتائج والمناقشة 10% 4% 12% القوية االنتاج trong adherent المتوسطة االنتاج Moderately adherent الضعيفة االنتاج Weakly adherent 74% غير المكونة للغشاء الحيوي Biofilm-non formation الشكل )5-3(: النسبة المئوية لقابلية بكتريا.E coli على انتاج الغشاء الحيوي.biofilm تعد البكتريا المنتجة للغشاء الحيوي مقاومة للمضادات الحيوية بأكلر 0111 مرة من البكتريا غير المنتجة له ويعود ذلك لعدة اسباب منها قلة انتشار المضاد الحيوي خالل المادة البينية اللزجة للغشاء الحيوي انتقال جينات المقاومة في داخل بيئة الغشاء الحيوي بين الخاليا البكتيرية سواء بوساطة البالرميد transposons الجينات القافزة ام ام بفعل حدوث الطف ارت العشوائية التي تؤدي الى ريادة مقاومة plasmid الخاليا للسموم والمضادات الحيوية التعبير عن مضخات الدفق efflux pumps بشكل اكبر في الخاليا iones المكونة للغشاء الحيوي تلبيت الغشاء الحيوي عن طريق تغير في ت اركيز االيونات و االس واخي ار وجود الخاليا persister cell المقيمة الفعالة ايضيآ غير التي لها دور في الحفاظ الهيدروجيني ph.)oto, 2014( على الخاليا البكتيرية المتواجدة تحت الغشاء الحيوي كآلية دفاعية ميكانيكية ذاتية 74

95 الفصل الثالث النتائج والمناقشة 5.3 الكشف المظهري عن مضخات الدفق Phenotypic detection of efflux pumps E. coli اجري الكشف عن مضخات الدفق في 01 عزلة بكتيرية تعود لبكتريا باستعمال طريقة العجلة الخشبية CW) ethedium bromide agar cartwheel method (EtBr باالعتماد على )%71( 30 صبغة بروميد االيليديوم كدليل للكشف المظهري. أظهرت النتائج ان عزلة بكتيرية كانت موجبة للكشف المظهري موضح كما في الشكل )6-3( والجدول )3-3(. وذلك باالعتماد على اقل تركيز لم تظهر.) فيه العزالت تلئلئ تحت مصدر االشعة الفو بنفسجية )UV( Gressler et al., )2014 نتائج تتقارب Gawad et al. مع ما الد ارسة هذه توصل اليها الباحث )8102( في مصر التي اظهرت ان نسبة البكتريا الموجبة للكشف المظهري لمضخات الدفق )%98( كانت عالية جدا بنسبة واشار الى ان مضخات الدفق كانت مسؤولة عن اكتساب البكتريا صفة المقاومة المتعددة للمضادات الحيوية. efflux pumps )8106( بينما لم تتوافق نتائج الد ارسة الحالية مع النتائج التي توصل اليها الباحث al. uresh et في الهند الذي بين ان حوالي )%00( من البكتريا السالبة لصبغة ك ارم كانت تمتلك صفة المقاومة المتعددة efflux pumps اذ بلغت للمضادات الحيوية وهذه النسبة كانت ترجع الى امتالك البكتريا ألنظمة الدفق بكتريا نسبة.E coli الموجبة للكشف المظهري لمضخات الدفق )%87191( اما النتائج التي توصل اليها )8107( التي Kashef الباحلان Helmy و بينت ان العزالت البكتيرية تمتلك انواعآ مختلفة من مضخات الدفق اذ بلغت نسبة العزالت البكتيرية الموجبة للكشف المظهري عن مضخات الدفق )%41104(. 75

96 الفصل الثالث النتائج والمناقشة عزالت بكتريا غير المتألقة في ت اركيز مختلفة من صبغة بروميد االيثيديوم تحت االشعة فوق E. coli الشكل )6-3(: ethedium bromide agar البنفسجية في تجربة الكشف المظهري عن مضخات الدفق بطريقة العجلة الخشبية تلئلئ عزالت بكتريا على وسط trypton soy agar الحاوي E. coli -3.cartwheel method (EtBr CW) trypton soy E. coli مايكروليتر/ملليتر( من صبغة بروميد االيثيديوم.2- تلئلئ عزالت بكتريا على وسط على )5 الحاوي على )10 مايكروليتر/ملليتر( من صبغة بروميد االيثيديوم تلئلئ عزالت بكتريا.E coli على وسط -3. agar E. -4. الحاوي على )15 مايكروليتر/ملليتر( من صبغة بروميد االيثيديوم تلئلئ عزالت بكتريا trypton soy agar على وسط الحاوي على )20 مايكروليتر/ملليتر( من صبغة بروميد االيثيديوم.5- تلئلئ trypton soy agar coli tryptic soy agar عزالت بكتريا.E coli على وسط الحاوي على )25 مايكروليتر/ملليتر( من صبغة بروميد االيثيديوم. 76

97 الفصل الثالث النتائج والمناقشة الجدول )3-3(: نتائج الكشف المظهري عن مضخات الدفق efflux pumps في بكتريا.E coli باستعمال ت اركيز مختلفة من صبغة بروميد االيثيديوم ethidium bromide في وسط اكار تربتون الصويا trypton soy agar رقم العزالت ت اركيز صبغة 10 - بروميد االثيديوم المستعملة )مايكروغ ارم/ملليتر( E: E. coli النتيجة السالبة )العزالت المتلئلئة ) E1 E4-E7-E11- E12-E13-E14- E15-E16-E17- E18-E19-E20- E21-E23-E25- E27-E30-E32- E36-E37- E41- E50 E3-E5-E10- E46 E6 E8 E9 E22 E24-E29 E26-E31-E39 E28-E35 E33-E42 E34 E38-E48 E40 E43 E44 E45 E47-E49 )( النتيجة الموجبة )العزالت غير المتلئلئة ) )-( 77

98 الفصل الثالث النتائج والمناقشة ان تعبير البكتريا عن مضخات الدفق يرتبط ارتباطا وثيقا بالمقاومة للمضادات الحيوية كما ان مضخات الدفق تعد السبب الرئيسي الكتساب البكتريا صفة المقاومة المتعددة للمضادات الحيوية أذ تعمل مضخات الدفق على طرد كميات كبيرة من المواد الكيميائية من ضمنها المضادات الحيوية خارج البكتريا اذ تقلل من تركيزها داخل الخلية تلبط عملها ومن ثم نفسه الوقت وفي تمنح البكتريا فرصة التعرض للطف ارت AcrAB-ToIC E. coli العشوائية. من اكلر مضخات الدفق شيوعا في بكتريا هي مضخة الدفق التابعة لنظام الدفق من عائلة ND التي تعمل على طرد العديد من المواد الكيميائية فضال عن المضادات الحيوية tetracycline, chlortetracycline, doxycycline, novobiocin, مضادات ملل ( erythromycin, nafcillin, rifampin, doxorubicin, levofloxacin, carbenicillin, ) cefamandole, cephalothin, cephaloridin, oxacillin, linezolid, ciprofloxacin.)un et al., 2014( Genotypic detaction E. coli الكشف الجزيئي مضخة عن الدفق في بكتريا 6.. of efflux pump in E. coli AcrA acrb acra تم الكشف عن جيني مضخة و الدفق التي تشفر عن بروتينات وAcrB E. coli 01 AcrAB-ToIC على التوال ضمن مضخة الدفق في عزلة بكتيرية تعود لبكتريا بتقانة وذلك تفاعل البلمرة المتسلسل )PC( باستعمال thermocycler جهار التدوير الح ارري للتأكد من وجودها في جميع العزالت البكتيرية 78

99 الفصل الثالث النتائج والمناقشة تقانة :PC الكشف الجزيئي عن الجين acra باستعمال بتقانة )PC( اظهرت نتائج الكشف الجزيئي عن الجين acra الذي حجمه )017( روج قاعدة acra )%011( 01 thermocycler التدوير جهار واستعمال الح ارري ان تمتلك الجين عزلة بكتيرية بين وبالمقارنة الحزم المتضاعفة والحزم التابعة الى الدليل الحجمي DNA ladder وجد ان الحزم الناتجة.)B7-3( )A 7-3( كانت ذات ورن جزيئي 017 في الشكل موضح كما قاعدة روج و تتفق نتائج هذه الد ارسة مع النتائج التي توصل اليها الباحث )8107( اذ بلغت Maleki et al. نسبة العزالت البكتيرية التي تمتلك الجين )%9010( وقد بين الباحث ان العزالت البكتيرية كانت acra متعددة المقاومة للمضادات بينما لم تتفق الحيوية. نتائج هذه الد ارسة مع النتائج التي توصل اليها الباحث )8102( في مصر اذ بلغت نسبة العزالت البكتيرية التي تمتلك هذا الجين )%74124( Gawad et al. وقد بين ان هنالك عالقة وثيقة بين امتالك البكتريا لمضخة الدفق AcrAB والمقاومة لمجاميع مختلفة من المضادات الحيوية كما اشار الى ان هذا الجين يكون متواجد دائما مع الجين acrb البكتيرية. في جميع العزالت 79

100 الفصل الثالث النتائج والمناقشة E: M زوج قاعدة 1000 (A) E: M 40 E39 E38 E37 E36 E35 E34 E33 E32 E31 E30 E29 E28 E27 E26 M زوج قاعدة (B) E. coli 317( الترحيل الكهربائي لناتج تفاعل البلمرة المتسلسل للجين acra زوج قاعدة ) لعزالت بكتريا الشكل )7-3(: 80 دقيقة. المسار M 311 في %3.5 اكاروز agaros وفرق جهد فولت لمدة يمثل الدليل الحجمي ) زوج -A7( والمسا ارت )B7- )E: 50 26( )E: 25 المسا ارت )1 في الشكل )3 في الشكل )3 تمثل عزالت قاعدة ( بكتريا.E coli التي تمتلك الجين.acrA تقانة :PC الكشف الجزيئي عن الجين acrb باستعمال بتقنية )PC( بينت نتائج الكشف الجزيئي عن الجين acrb الذي حجمه )010( روج قاعدة )%011( thermocycler التدوير جهار باستعمال الح ارري العزالت البكتيرية ان جميع الجين تمتلك 80

101 الفصل الثالث النتائج والمناقشة DNA ladder وبالمقارنة بين الحزم المتضاعفة والحزم التابعة الى acrb الدليل الحجمي وجد ان الحزم.)B2-3 )A2-3( و ( الناتجة كانت ذات ورن جزيئي 010 روج قاعدة كما الشكل في موضح E: M زوج قاعدة (A) E: M 40 E39 E38 E37 E36 E35 E34 E33 E32 E31 E30 E29 E28 E27 E26 M 105 زوج قاعدة (B) الشكل )8-3(: الترحيل الكهربائي لناتج تفاعل انزيم البلمرة المتسلسل للجين )315 acrb زوج قاعدة ) لعزالت بكتريا.E coli في %3.5 اكاروز agaros وفرق جهد 311 فولت لمدة 80 دقيقة. المسار M يمثل الدليل الحجمي ) زوج قاعدة ) المسا ارت 1( 25 )E: في الشكل 3( 8 )A والمسا ارت 26( 50 )E: في الشكل 3( 8- )B تمثل عزالت بكتريا.E coli التي تمتلك الجين.acrB 81

102 الفصل الثالث النتائج والمناقشة كانت النتائج الحالية مقاربة الى النتائج التي توصل اليها الباحث al. )8107(Maleki et في اي ارن اذ بلغت نسبة العزالت البكتيرية التي تمتلك الجين )%28191( بينما لم تتفق نتائج هذه الد ارسة مع acrb النتائج التي توصل اليها الباحث و في اي ارن )8106( والنتائج التي توصل Farsimadan Kafilzadeh اليها الباحث )8102( في مصر اذ بلغت نسبة العزالت البكتيرية التي تمتلك هذا الجين Gawad et al. bacterial و التوال. على تتواجد هذه الجينات على الكروموسوم البكتيري )%74124( )%70( منظمات وتعد بروتينية اي تنظم عمل البروتينات. يمكن لهذا النوع من المضخات ان تطرد chromosome كميات كبيرة من المواد االخرى اضافة الى المضادات الحيوية ملل العناصر اللقيلة المواد العضوية نواتج المركبات النباتية و المخلفات االيضية للبكتريا ويمكن ان تمنح البكتريا المقاومة الطبيعية للمضادات الحيوية.)Blanco et al., 2016 ( فضال عن المقاومة المكتسبة للمضادات الحيوية )%011( كما قد تبين ان العزالت البكتيرية كانت تمتلك الجينين acrb نفسها وبالنسبة معا و acra موضح في الجدول )4-3( وهذه ما يتوافق مع نتائج الباحث )8102( التي اظهرت ان Gawad et al. نسبة العزالت البكتيرية التي تمتلك هذين الجينين معا )%74124(.. E. coli النسبة المئوية لجيني مضخة الدفق acra و acrb بكتريا في الموجودة الجدول )4-3(: التسلسل الجين عدد العزالت التي النسبة المئوية لوجود الجين Genes تمتلك الجين )%( )%011( )%011( acra acrb

103 الفصل الثالث النتائج والمناقشة ان العالقة بين قابلية بكتريا.E coli على تكوين الغشاء الحيوي biofilm وبين امتالكها لمضخات الدفق efflux pumps تعود الى دور مضخات الدفق في تكوين الغشاء الحيوي كما ان الجينات المشفرة عن مضخة AcrAB-ToIC الدفق وجدت منظمة بشكل كبير تحت تأثير الغشاء الحيوي وخالل التعرض mutants للعديد من المضادات الحيوية. فقد وجد في الد ارسات السابقة ان العزالت البكتيرية الطافرة التي emrd, emre, ( تفقد الجينات المشفرة عن نظام الدفق من عائلة (PMF) Proton Motive Force )emrk, acrd, acre, mdte تظهر قابلية ضعيفة جدا على تكوين الغشاء الحيوي اكلر من السالالت.)oto, 2013 االبوية االصلية لذا فنظام الدفق )PMF( له دور كبير في تكوين الغشاء الحيوي ( هذه الد ارسة اظهرت ان معظم العزالت البكتيرية القابلية على التي لها الغشاء الحيوي انتاج كانت )%91( 40 acrb معظمها تمتلك الجينات المشفرة عن مضخة acra و الدفق فكانت عزلة بكتيرية تمتلك 38 acrb المقاومة جيني acra و لها القابلية على انتاج الغشاء الحيوي biofilm كما اظهرت النتائج ان عزلة بكتيرية موجبة للكشف المظهري عن مضخات الدفق كانت لها القابلية على الغشاء انتاج )%64( )%4( الحيوي biofilm بينما 8 موجبة للكشف كانت بكتيرية عزلة المظهري عن مضخات الدفق ال تمتلك القابلية على انتاج الغشاء الحيوي كما موضح في الجدول )0-3( والملحق )3(. 83

104 الفصل الثالث النتائج والمناقشة الجدول )5-3(: العالقة بين الكشف المظهري والكشف الجزيئي عن مضخات الدفق efflux pumps والقابلية على تكوين الغشاء الحيوي biofilm في بكتريا.E coli الغشاء الحيوي عدد العزالت )%( نتائج االختبا ارت الكشف المظهري عن مضخات الدفق عدد العزالت )%( العالقة بين العزالت الموجبة للكشف المظهري امتالك الغشاء الحيوي عدد العزالت )%( الكشف الجزيئي عن مضخات الدفق عدد العزالت )%( العالقة بين العزالت الموجبة للكشف الجزيئي امتالك الغشاء الحيوي عدد العزالت)%( )91( 40 )011( 01 )64( 38 )71( 30 )91( النتيجة 40 الموجبة )1( 1 )1( 1 )4( 8 )31(00 )01( النتيجة 0 السالبة هنالك عالقة كبيرة بين امتالك البكتريا لمضخات الدفق و القابلية على انتاج الغشاء الحيوي اذ بين MF الباحث al. Alva et )8102( ان مضخات الدفق من عائلة ND و عائلة كانت مسؤولة بدرجة كبيرة عن انتاج الغشاء الحيوي في بكتريا.E coli بالمقارنة مع العائالت االخرى لمضخات الدفق كما بين هذا الباحث AcrAB ان دور مضخة الدفق خالل تكوين الغشاء الحيوي هي لمنع ت اركم المواد السامة بضمنها المضادات الحيوية داخل الخلية. 7.3 التحليل التتابعي DNA sequencing 16rNA تم تحليل الحمض النووي الدنا المجيني للبوادئ الخاصة بكل من الجين التشخيصي والجينين acra و acrb وذلك بعد 81 عن مضخة المشفرين الدفق اخذ مايكر وغ ارم /مايكروليتر من المضخم الدنا acra الجين 16rNA التابع الى E27 العزلة الخاص بكل من الجين التشخيصي )PC product( 84

105 الفصل الثالث النتائج والمناقشة E40 و الجين acrb والدنا المضخم product( )PC التابع الى العزلة الخاص بالجين التشخيصي الدنا المضخم التابع الى العزلة الخاص بالجين والدنا acra المضخم التابع الى العزلة E43 16rNA )DNATA lasergene Editeq( الخاص بالجين acrb وبعد تحليل النتائج في برنامج E8 National Center for Biotechnology المتوفر في الموقع العالمي لبنك الجينات االمريكي )NCBI( وجد انها كانت )%011( تعود لبكتريا الموقع في موجودة كما هو كانت E.coli Information acra و 16rNA العالمي )NCBI( كما وجد ان حجم حزم القواعد النيتروجينية الخاصة بالجينات )9-3( )01-3( و )00-3( كما في التوال على روج قاعدة و االشكال ) ( acrb (A, B, C :9( و )A, B, C :2( )A, B, C :7( )A, B, C :6 ( والمالحق) C:0 )A, B, وقد تم تسجيل البوادئ acra 16rNA و acrb الخاصة بالجينات في الموقع العالمي لبنك الجينات االمريكي )NCBI( ضمن التسلسالت LC LC LC و التوال. على تعد هذه الطريقة من احدث في التعرف الط ارئق واهم على هوية البكتريا المرضية كما يتم من خالل هذه الطريقة الكشف عن حدوث الطف ارت الو ارثية في جينات المقاومة والجينات االخرى وذلك من خالل التعرف على تسلسل القواعد النيتروجينية العائدة للجين 2015( al.,.)rinivasan et 85

106 الفصل الثالث النتائج والمناقشة ef. CGAGTGGCGGACGGGTGAGTAATGTCTGGGAAACTGCCTGATGGAGGGGGATAACTACTGGAAACGGTAGCTAATACCGCATAACGTCGCAAGACCAAAG ef. AGGGGGACCTTCGGGCCTCTTGCCATCGGATGTGCCCAGATGGGATTAGCTAGTAGGTGGGGTAACGGCTCACCTAGGCGACGATCCCTAGCTGGTCTGA ef. GAGGATGACCAGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCCAT ef. GCCGCGTGTATGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGTACTTTCAGCGGGGAGGAAGGGAGTAAAGTTAATACCTTTGCTCATTGACGTTACCCGCAGAAGA ef. AGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCACGCAGGCGGTTTGTTAAGT ef. CAGATGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATCTGATACTGGCAAGCTTGAGTCTCGTAGAGGGGGGTAGAATTCCAGGTGTAGCGGTGAAATG ef. CGTAGAGATCTGGAGGAATACCGGTGGCGAAGGCGGCCCCCTGGACGAAGACTGACGCTCAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCT ef. GGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCGA الشكل )9-3(: التحليل التتابعي للجين 16srNA لبكتريا.E coli في العزلة E40 86

107 الفصل الثالث النتائج والمناقشة ref..seq TGCAGAGGTTCAGTTTTGACTGTTACTACGCCAACGGCGGGCATCTGCTGGCCACCTTGTTGGGCCTGTTTGTCGTCACATCCTGTTAGGGCTAAGCTGC ref..seq CTGAGAG الشكل )31-3(: التحليل التتابعي للجين acra لبكتريا.E coli في العزلة E ef. CTACCTGGAAGTAAACGTCATTGGTCAGGCCACGGAAGGTGGCAGCCAGCAACGCACCGATAACCCCCAGCGGAACGACCAGCATAACGGAGAACGGAAT ef. CGACC الشكل )33-3(: التحليل التتابعي للجين acrb لبكتريا.E coli للعزلة E8. 87

108 االستنتاجات والتوصيات

109 االستنتاجات والتوصيات االستنتاجات -1 اظهرت جميع عزالت بكتريا.E coli المعزولة من اصابات المسالك البولية مقاومة متعددة للمضادات الحيوية (MD) multidrug resistance فكانت اعلى مقاومة للمضاد الحيوي. carbenicilline بنسبة )%111( واقل مقاومة للمضاد الحيوي nitrofurantoin بنسبة )%4( 2- بينت نتائج الد ارسة الحالية ان )%01( من عزالت بكتريا.e coli لها القابلية على انتاج الغشاء الحيوي.biofilm 3- اظهرت عزالت بكتريا.E coli نتائج موجبة للكشف المظهري عن انظمة الدفق efflux pumps. بنسبة )%01( الدفق acra -4 بينت نتائج الد ارسة الحالية ان معظم عزالت بكتريا.E coli كانت تمتلك جيني مضخة و acrb التي تشفر عن بروتينات مضخة الدفق بنسبة )%111( لكل منهما. 88

110 االستنتاجات والتوصيات التوصيات العديد من الد ارسات للكشف عن اسباب مقاومة بكتريا.E coli المعزولة من زيادة اصابات 1- اج ارء المسالك البولية للمضادات الحيوية من خالل الكشف عن جينات المقاومة للمضادات الحيوية وباألخص تلك التي تشفر efflux pumps عن انظمة الدفق االخرى..efflux pump inhibitors العديد من الد ارسات عن مثبطات انظمة الدفق 2- اج ارء بين المواطنين حول استعمال المضادات الحيوية بدون وصفة طبية لمنع 3- نشر الوعي الصحي السالالت ظهور البكتيرية لها. المقاومة 4- د ارسة الكشف المظهري والجيني عن انظمة الدفق في االجناس المرضية االخرى السالبة والموجبة لصبغة ك ارم. 5- د ارسة التعبير الجيني gene expression لجينات المقاومة المشفرة عن بروتينات انظمة الدفق باعتماد تقانة.real time PC 89

111 المصادر

112 المصادر المصادر العربية البوصالح رواء ماجد دمحم. )4102(. التحري عن عوامل الض اروة لبكتيريا اشيريشيا القولون المعزولة من المرضى المصابين بالتهاب المجاري البولية وقياس نمط بعض الحركيات الخلوية لديهم. رسالة ماجستير..041 كلية العلوم \جامعة القادسية.صفحة جعاز وداد سمير وهميم سعد سلمان. )4102(. التنميط المصلي والكشف الجزيئي لبعض جينات المقاومة لجرثومة اإلشيريشيا القولونية المعزولة من األطفال المصابين بأخماج المجاري البولية في مدينة الناصرية. مجلة جامعة ذي قار. 00)3(: ح ارن عمر حسين. )4104 (. التحري عن جينات المقاومة لمضادات البيتاالكتام من البكتريا المعزولة من... بعض االصابات السريرية في الديوانية. رسالة ماجستير كلية العلوم جامعة القادسية الخفاجي زهرة محمود. التقنية الحيوية الميكروبية )توجهات جزيئية(. دار طباعة. دمشق :.)4112( صفحة 001. شويخ رحيم صبر و جاسم فرح علي حميد. )4102(. انواع البكتريا المسببة اللتهابات المسالك البولية :)2(40 ومدى مقاومتها للمضادات الحيوية في بعض مستشفيات بغداد. مجلة القادسية للعلوم الصرفة الشويخ رنا مجاهد عبد هللا. )4102(. المضادات الحيوية و استعماالتها. دار دجلة.االردن. صفحة.004

113 المصادر العبيدي نادية احمد هادي. )4100(. عزل وتشخيص بعض انواع البكتريا من المرضى المصابين بالتهاب.03-0 المسالك البولية وتحديد مقاومتها للمضادات الحياتية. مجلة جامعة ذي قار. المرجاني دمحم فرج. )4100(. المضادات الحيوية : المقاومة البكتيرية للمضادات الحيوية. دار دجلة. االردن.صفحة

114 المصادر المصادر االجنبية Abdelhamid,. M. and Abozahra,.. (2017). Expression of the Fluoroquinolones Efflux Pump Genes Acra And Mdfa in Urinary Escherichia coli Isolates. PJM. 66(1): Abdu, A. ; Kachallah, M. and Yusuf Bolus, D. (2018). Antibiotic usceptibility Patterns of Uropathogenic Escherichia coli Among Patients with Urinary Tract Infections in a Tertiary Care Hospital in Maiduguri, North Eastern, Nigeria. J. Biosci Biotechnol Discov. 3: Abujnah, A. A. Zorgani, A. ; abri, M. A. M. ; El-Mohammady, H.; Khalek,. A. and Ghenghesh, K.. (2015). Multidrug esistance and Extended-pectrum β-lactamases Genes Among Escherichia coli from Patients with Urinary Tract Infections in Northwestern Libya. Libyan J Med. 10(1): Afzal, A. M.. (2017). Antibiotic esistance Pattern of Escherichia coli and Klebsiella pecies in Pakistan: A Brief Overview. J Microb. Biochem. Technol. 9(6): Alav, I. ; utton, J. M. And ahman, K. M. (2018). ole of Bacterial Efflux Pumps in Biofilm Formation. J Antimicrob Chemother Ali, I. ; Kumar, N. ; Ahmed,. and Dasti, J. I. (2014). Antibiotic esistance in Uropathogenic E. coli trains Isolated from Non-Hospitalized Patients in Pakistan. J of Clin and Dia es. 8(9): 1-4. Ali, J ; afq, Q. A. and atcliffe, E. (2018). Antimicrobial esistance Mechanisms and Potential ynthetic Treatments. Future ci. 4(4):

115 المصادر Amaral, L.; Martins, A.; pengler, G. and Molnar, J. (2014). Efflux Pumps of Gram-Negative Bacteria: What They Do, How They Do it, with What and How to Deal with Them. Front Pharmacol. 4(168):1-11. Anes, J.; Mccusker, M. P.; Fanning,. And Martins, M. (2015). The Ins and Outs of ND Efflux Pumps in Escherichia coli. Front Microbiol. 6:1-14. Asadi,.; Kargar, M.; olhjoo, K.; Najaf, N. and Ghorbani-Dalini,. (2014). The Association of Virulence Determinants of Uropathogenic Escherichia coli with Antibiotic esistance. Jundishapur J Microbiol. 7(5): 1-5. Avsar, C. and Berber, I. (2014). Plasmid Profiling and Antibiotics esisitance of Escherichia coli trains Isolated from Mytilus galloprovincialis and eawater. J Coast Life Med. 2(9): Basak,.; ingh, P. and ajurkar, M. (2016). Multidrug esistant and Extensively Drug esistant Bacteria: A tudy. Journal of Pathogens Bhattacharyya,.; arfraz, A.; Ansari, M. A. A. and Jaiswal, N. ( 2015). Characterization and antibiogram of Uropathogenic Escherichia coli from a tertiary care hospital in Eastern India. Int J Curr Microbiol App ci. 4(2): Blair, J. M.; ichmon, G. E. and Piddock, L. J. (2014). Multidrug efflux pumps in Gram-Negative Bacteria and Their ole in Antibiotic esistance. Future Microbiol. 9(10): Blanco, P.; Hernando-Amado,.; eales-calderon, J. A.; Corona, F.; Lira, F.; Alcalde-ico, M.; Bernardini, M.; anchez, M. B. and Martinez, J. L. (2016). Bacterial Multidrug Efflux Pumps: Much More than Antibiotic esistance Determinants. Microorganisms. 4(14):

116 المصادر Bray, J. (1945). Isolation of antigenically homogeneous strains of Bacteria E. coli neop-olitanum from summer diarrhea of infants. J Pathol Bacteriol. 57: Brown, A. E. and mith, H.. (2017). Bensonʼs Microbiological Applications, Laboratory Manual in General Microbiology. 14 th ed. McGraw-Hill Higher Education. New York. 438pp. Christensen, G. D.; impson, W. A.; Younger, J. J.; Baddour, L. M.; Barrett, F. F.; Melton, D. M. and Beachey, E. H. (1985). Adherence of Coagulase-Negative taphylococci to Plastic Tissue Culture Plates: A Quantitative Model for The Adherence of taphylococci to Medical Devices. JCM. 22(6): CLI. (2017). Performance tandard for Antimicrobial usceptibility Testing. 27 th ed. CLI upplement M100.Wayne,PA:Clinical and Laboratory tandards Institute Delmar, J. A.; u, C-C. and Yu, E. W. (2014). Bacterial Multidrug Efflux Transporters. Annu ev Biophys. 43: Forbes, B. A.; aham, D. F. and Weissfeld, A.. (2007). Baily and cott s Diagnostic Microbiology. 12 th ed. Mosby, Inc., an anffilliate of Elsevier, Inc. 1031pp. Forsyth, V.. Armbruster, C. E.; mith,. N.; Pirani, A.; pringman, A.; Walters, M..; Nielubowicz, G..; Himpsl,. D.; nitkin, E..; Mobley, H. L. T. (2018). apid Growth of Uropathogenic Escherichia coli During Human Urinary Tract Infection. M bio. 9(2): Foxman, B. (2014). Urinary Tract Infection yndromes Occurrence, ecurrence, Bacteriology, isk Factors, and Disease Burden. Infect Dis Clin N Am. 28:

117 المصادر Fusco, A.; Coretti, L.; avio, V.; Buommino, E.; Lembo, F. and Donnarumma, G. (2017). Biofilm Formation and Immunomodulatory Activity of Proteus mirabilis Clinically Isolated trains. Int J Mol ci.18(2): Garrity, G. M.; Brenner, D. J.; Krieg, N..; taley, J. T.; Chairman, J.; Boone, D..; Chairman, V.; Devos, P.; Goodfellow, M.; ainey, F. A. and chleifer, K-H. (2005). Bergey s Manual of ystematic Bacteriology. Vol Two. Part B. 2 nd ed. pringer. UA. PP Gawad, W. E.; Helmy, O. M.; Tawakkol, W. M. and Hashem, A. M. (2018). Antimicrobial esistance, Biofilm Formation, And Phylogenetic Grouping of Uropathogenic Escherichia coli Isolates in Egypt: The ole of Efflux Pump- Mediated esistance. Jundishapur J. Microbiol. 11(2):1-7. Gharajalar,. N. and ofiani, V. H. (2017). Patterns of Efflux Pump Genes Among Tetracycline esistance Uropathogenic Escherichia coli Isolates Obtained from Human Urinary Infections. Jundishapur J Microbiol Gressler, L. T.; Vargas, A. C. D.; Costa, M. M. D.; Pötter, L.; ilveira, B. P. D.; angioni, L. A. and Botton,. D. A. (2014). Genotypic and phenotypic detection of efflux pump in hodococcus equi. Brazilian J Microbiol. 45(2): Hadi, O. M.; Al-Maliki, A. H.; Al-Zubaidy, M.. M. and Nihmah, Y. K. (2014). Prevalence of Uropathogenic Escherichia coli in Al-Hashymia District of Babylon Province. JUBPA. 9(22): Harly, J. P. and Prescott, L. M. (2002). Laboratory Exercises in Microbiology. 5 th ed. McGraw-Hill education, Inc. PP

118 المصادر Hayashi, K.; Nakashima,.; akurai, K.; Kitagawa, K.; Yamasaki,.; Nishino, K. and Yamaguchi, A. (2016). AcrB-AcrA Fusion Proteins That Act as Multidrug Efflux Transporters. J Bacteriol. 198(2): Hegazy, E. E. Alam El-Din,. A.; Amin, A. M.; Mahgoub, F. M. and El-Gamal,. A. (2018). Microbiological Profile of Urinary Tract Infections with special eference to Antibiotic usceptibility Pattern of Escherichia coli Isolates. Int J Curr Microbiol App ci. 7(2): Helmy, O. M. and Kashef, M. T. (2017). Defferent Phenotypic and Molecular Mechanisims Associated with Multidrug esistance in Gram-Negative Clinical Isolates from Egypt. Infect Drug esist. 10: Hemraj, V.; Diksha,. and Avneet, G. (2013). A eview on Commonly Used Biochemical Test for Bacteria. IJL. 1(1): 1-7. Hinthon, W.; Pumipuntu, N.; antajit,.; Kulpeanprasit,.; Buranasinsup,.; ookrung, N.; Chaicumpa, W.; Aiumurai, P. and Indrawattana, N. (2017). Detection and Drug esistance Profile of Escherichia coli from ubclinical Mastitis Cows and Water upply in Dairy Farms in araburi Province, Thailand. Peer J Ibrahim, I. A.; Al-hwaikh,. M. and Ismaeil, M. I. (2014). Virulence and Antimicrobial esistance of Escherichia coli Isolated from Tigris iver and Children Diarrhea. Infect Drug esist. 7: Islam, M. A.; Kabir,. M. L. and eel,. M. L. (2016). Molecular Detection and Characterization of Escherichia coli Isolated from aw Milk old in Different Markets of Bangladesh. Bangl J Vet Med. 14 (2):

119 المصادر Jawetz, E.; Melnick, J. A. and Adelberg, E. A. (2016). eview of Medical Microbiology 27 th ed. McGraw-Hill education, Inc : 851pp. Jenkins, C.; Ling, C. L.; Ciesielczuk, H. L.; Lockwood, J.; Hopkins, J.. McHugh, T. D.; Gillespie,. H. and Kibbler, C. C. (2012). Detection and Identification of Bacteria in Clinical amples by 16srNA Gene equencing: Comparison of Two Different Approaches in Clinical Practice. J Med Microbiol. 61: Kafilzadeh, F. and Farsimadan, F. (2016). Investigating Multidrug Efflux Pumps in elation to the Antibiotic esistance Pattern in Escherichia coli trains from Patients in Iran. Biomed es. 27(4): Kapoor, J.; aigal,. and Elongavan, A. (2017). Action and esistance Mechanisms of Antibiotics: A Guide for Clinicians. J Anaesthesiol Clin Pharmacol. 33(3): Khalaf, T. T. and Al-Khafaji, Z. M. (2014). Prevalence of Oxalobacter formigenes Among the Iraqi Populatio. J Pharm Pharm ci. 3(7) : Kibret, M. and Abera, B. (2011). Antimicrobial usceptibility Patterns of E. coli from Clinical ources in Northeast Ethiopia. Afr Health ci. 11(1): Kotsyuba, K..; Voronkova, O..; Vіnnіkov, A. І. and hevchenko, T. M. (2014). Mechanisms of Antibiotic esistance of Enterobacteriaceae Family epresentatives. Vìsn Dnìpropetr Unìv er Bìol Med. 5(1): Lai, Y. M.; Zaw, M. T.; Aung, T.. and Lin, Z. (2016). Detection of equence Type 131 in Multi-Drug esistant Uropathogenic Escherichia coli Isolates from Two Hospitals of abah. AJP. 10 (3):

120 المصادر Laird, E. D. (2016). Characterization of Antibiotic esistance Profiles of urface Water Bacteria in an Urbanizing Watershed. Msc. Thesis. Texas A and M Universit. 59 PP. Lee, J. H.; ubhadra, B.; on, Y-J.; Kim, D. H.; Park, H..; Kim, J. M.; Koo,. H.; Oh, M. H.; Kim, H-J. and Choi, C. H. (2015). Phylogenetic Group Distributions, Virulence Factors and Antimicrobial esistance Properties of Uropathogenic Escherichia coli trains Isolated from Patients with Urinary Tract Infections in outh Korea. Lett Appl Microbiol. 62: Levinson, W. (2016). eview of Medical Microbiology and Immunology. 14 th ed. McGraw-Hill education, Inc. PP 821. Maleki, D.; Jahromy,. H.; Karizi,. Z. and Eslami, P. (2017). The Prevalence of acra and acrb Genes Among Multiple-Drug esistant Uropathogenic Escherichia coli Isolated from Patients with UTI in Milad Hospital, Tehran. Avicenna J Clin Microb Infec. 4(1): 1-7. Malekzadegan, Y.; Khashei,.; Ebrahim-araie, H.. and Jahanabadi, Z. (2018). Distribution of Virulence Genes and Their Association with Antimicrobial esistance Among Uropathogenic Escherichia coli Isolates from Iranian Patients. BMC Infect Dis. 18(572):1-9. Malema, M..; Abia, A. L. K.; Tandlich,.; Zuma, B.; Kahinda, J-M. M. and Ubomba-Jaswa, E. (2018). Antibiotic-esistant Pathogenic Escherichia coli Isolated from ooftop ainwater-harvesting Tanks in the Eastern Cape, outh Africa. Int J Environ es. Public Health. 15(892):

121 المصادر Martins, M.; Mccusker, M. P.; Viveiros, M.; Couto, I. ; Fanning,.; Pages, J. M.; Amaral, L. (2013). A imple Method for Assessment of MD Bacteria for Over- Expressed Efflux Pumps. Open Microbiol J. 7: Martins, M.; Viveiros, M.; Couto, I.; Costa,..; Pacheco, T.; Fanning,.; Pages, G-M. and Amaral, L. (2011). Identification of Efflux Pump Mediated Multidrug resistant Bacteria by the Ethidium Bromide-agar Cartwheel Method. in vivo. 25: Mirzarazi, M.; ezatofghi,. E.; Pourmahdi, M. and Mohajeri, M.. (2013). Antibiotic esistance of Isolated Gram Negative Bacteria from Urinary Tract Infections (UTIs) in Isfahan. Jundishapur J Microbiol. 6(8): 1-5. Mishra,. K.; Basukala, P.; Basukala, O.; Parajuli, K.; Pokhrel, B. M. and ijal, B. P. (2015). Detection of Biofilm Production and Antibiotic esistance Pattern in Clinical Isolates from Indwelling Medical Devices. pringer. 70: Mittal,.; harma, M. and Chaudhary, U. (2014). tudy of Virulence Factors of Uropathogenic Escherichia coli and its Antibiotic usceptibility Pattern. Indian J Pathol Microbiol. 57(1): Neamati, F.; Firoozeh, F.; affari, M. and Zibaei, M. (2015). Virulence Genes and Antimicrobial esistance Pattern in Uropathogenic Escherichia coli Isolated from Hospitalized Patients in Kashan, Iran. Jundishapur J Microbiol. 8(2): 1-6. Neupane,.; Pant, N. D.; Khatiwada,.; Chaudhary,. and Banjara, M.. (2016). Correlation Between Biofilm Formation and esistance Toward Different Commonly Used Antibiotics Along with Extended pectrum Beta Lactamase Production in Uropathogenic Escherichia coli Isolated from the Patients uspected of Urinary Tract Infections Visiting hree Birendra Hospital, Chhauni, Kathmandu, Nepal. AIC. 5(5):

122 المصادر Oliveira,. V.; Oliveira, M. C. and Pelli, A. (2017). Disease Infection by Enterobacteriaceae Family in Fishes: A eview. J Microbiol Exp. 4(5): Olowe, B. M.; Oluyege, J. O.; Famurewa, O.; Ogunniran, A. O. and Adelegan, O. (2017). Molecular Identification of Escherichia coli and New Emerging Enteropathogen, Escherichia fergusonii, from Drinking Water ources in Ado- Ekiti, Ekiti tate, Nigeria. J Microbiol es. 7(3) : Onuoha,. C. and Fatokun, K. (2014). Prevalence and Antimicrobial usceptibility Pattern of Urinary Tract Infection (UTI) Among Pregnant Women in Afikpo, Ebonyi tate, Nigeria. AJL. 2(2): Paltansing,. (2015). Antimicrobial esistance In Enterobacteriaceae : Characterization and Detection. Leiden University. 155pp. Polse,.F.; Yousif,. Y. and Assafi, M.. (2016). Prevalence and Antimicrobial usceptibility Patterns of Uropathogenic E. coli Among People in Zakho, Iraq. Int J es Med ci. 4(4): Ponnusamy, P. and Nagappan,. (2013). Extended pectrum Beta-Lactamase, Biofilm-producing Uropathogenic Pathogens and Their Antibiotic usceptibility Patterns from Urinary Tract Infection- An Overview. Intl J Microbiol es. 4(2): Poongothai, P.; ajan,. and Jegadeeshkumar, D. (2012). Emergence of Multidrug esistant trains of E. coli Isolated from Urinary Tract Infection in Namakkal. Int J Appl Biol Pharm Technol. 3(3): Poursina, F.; epehrpour,. and Mobasherizadeh,. (2018). Bioflm Formation in Nonmultidrug esistant Escherichia coli Isolated from Patients with Urinary Tract Infection in Isfahan, Iran. Adv Biomed es. 7(40):

123 المصادر Pricop, C.; uditu, N.; Vrinceanu,.; Puia, D.; Dimitriu, D. C. Ciuta, C.; Todosi, L. and Checherita, I. A. (2015). Multidrug esistant Urinary Tract Infections in Moldova, omania: Focusing on Uropathogens and Their Antibiotic usceptibility. Can We Do More?. Nobel Med. 11(3): Puzari, M. and Chetia, P. (2017). ND efflux pump mediated antibiotic resistance in Gram-Negative Bacteria Escherichia coli and Pseudomonas aeruginosa: A Major Issue Worldwide. World J Microbiol Biotechnol. 33(24): 1-8. aeispour, M. and anjbar,. (2018). Antibiotic esistance, Virulence Factors and Genotyping of Uropathogenic Escherichia coli trains. Antimicrob esist Infect Control. 7(118):1-9. amírez-castillo, F. Y.; Moreno Flores, A. C.; Avelar González, F. J.; Márquez Díaz, F.; Harel, J. and Guerrero Barrera, A. L. (2018). An Evaluation of Multidrug esistant Escherichia coli Isolates in Urinary Tract Infections from Aguascalientes, Mexico: Cross ectional tudy. Ann Clin. Microbiol Antimicrob. 17(34):1-13. avi, I.; Baunthiyal, M. and axena, J. (2014). Advances in Biotechnology. pringer. India. PP.259. ivas, L.; Mellor, G. E.; Gobius, K. and Fega, N. (2015). Detection and Typing trategies for Pathogenic Escherichia coli. pringer. New York. 110pp. ambrook, J. and ussell, D. (2001). Molecular Cloning Laboratory Manual. 3 rd ed. Cold pring Harbor, New York. UA. PP hariff, A.; henoy, M..; Yadav, T. and adhakrishna, M. (2013). The Antibiotic usceptibility Patterns of Uropathogenic Escherichia coli, with pecial eference to the Fluoroquinolones. J Of Clin And Dia es. 7(6):

124 المصادر harmin,.; Alamgir, F. Begum, F. and Jaigirdar, K. H. (2010). Use of Chromogenic Agar Media for Identification of Uropathogen. Bangladesh J Med. Microbiol. 4 (1): ilva, D. P.; chofield, M. C.; Parsek, M.. and Tseng, B.. (2017). An Update on the ociomicrobiology of Quorum ensing in Gram-Negative Biofilm Development. Pathogens. 6(51): 1-9. oltani,.; Emamie, A. D.; Dastranj, M; Farahani, A.; Davoodabadi, A. and Mohajeri, p. (2018). ole of Toxins of Uropathogenic Escherichia coli in Development of Urinary Tract Infection. JPI. 21(1): oto,. M. (2013). ole of Efflux Pumps in the Antibiotic esistance of Bacteria Embedded in a Biofilm.Virulence. 4(3): oto,. M. (2014). Importance of Biofilms in Urinary Tract Infections: New Therapeutic Approaches. Advances in Biology. 13pp. paulding, C. N.; Klein,. D.; uer,.; Kau, A. L.; chreiber, H. L.; Cusumano, Z. T.; Dodson, K. W.; Pinkner, J..; Fremont, D. H.; Janetka, J. W.; emaut, H.; Gordon, J. I. and Hultgren,. J. (2017). elective Depletion of Uropathogenic E. coli from the Gut by a FimH Antagonist. Nature. 546: rinivasan,.; Karaoz, U.; Volegova, M.; MacKichan, J.; KatoMaeda, M.; Miller,.; Nadarajan,.; Brodie, E. L. and Lynch,. V. (2015). Use of 16rNA Gene for Identification of a Broad ange of Clinically elevant Bacterial Pathogens. PLO ONE. 10(2): uardana, I. W. (2014). Analysis of Nucleotide equences of the 16rNA Gene of Novel Escherichia coli trains Isolated from Feces of Human and Bali Cattle. J Nucleic Acids :

125 المصادر un, J.; Deng, Z. and Yan, A. (2014). Bacterial Multidrug Efflux Pumps: Mechanisms, Physiology and Pharmacological Exploitations. Biochem Biophys es Commun. 453: uresh, M.; Nithya, N.; Jayasree, P. and Kumar, M. P. (2016). Detection and Prevalence of Efflux Pump-Mediated Drug esistance in Clinical Isolates of Multidrug-esistant Gram-Negative Bacteria from North Kerala,India. Asian J Pharm Clin es. 19(3): Tadesse, A. and Alem, M. (2006). Medical Bacteriology. EPHTI. PP Tajbakhsh, E.; Ahmadi, P. Abedpour-Dehkordi, E.; Arbab-oleimani, N. and Khamesipour, F. (2016). Biofilm Formation, Antimicrobial usceptibility, erogroups and Virulence Genes of Uropathogenic E. coli Isolated from Clinical amples in Iran. Antimicrob esist Infect Control. 5(11): 1-8. Terlizzi, M. E.; Gribaudo, G. and Maffei, M. E. (2017). UroPathogenic Escherichia coli (UPEC) Infections: Virulence Factors, Bladder esponses, Antibiotic, and Non-Antibiotic Antimicrobial trategies. Front Microbiol. 8(1566): Tille, P.M. (2017). Baily And cott s Diagnostic Microbiology. 41 th ed. Elsevier, Inc. China. 1115pp. Vandepitte, J.; Verhaegen, J.; Engbaek, K.; ohner, P.; Piot, P. and Heuck, C. C. (2003). Bacteriological Investigations. In: World Health Organization.2 nd ed. Basic Laboratory Procedures in Clinical Bacteriology, WHO, Geneva. 167pp. Venter, H.; Mowla,.; Ohene-Agyei, T. and Ma,. (2015). ND-type drug efflux pumps from Gram-negative bacteria: molecular mechanism and inhibition. Front. Microbiol. 6(377):

126 المصادر Wanger, A.; Chavez, V.; Huang,.. P.; Wahed, A.; Actor, J. K. and Dasgupta, A. (2017). Microbiology and Molecular Diagnosis in Pathology. Elsevier Inc. All ights eserved. 300pp. WHO (World Health Organization). (2003). Basic Laboratory Procedures in Clinical Bacteriology. 2 nd ed. Geneva. witzerland. Zaman,. B.; Hussain, M. A.; Nye,.; Mehta, V.; Mamun, K. T. and Hossain, N. (2017). A eview on Antibiotic esistance: Alarm Bells are inging. Cureus. 9(6): 1-9. Zhang, C.; Chen, X.; tephanopoulos, G. and Too, H-P. (2016). Efflux Transporter Engineering Markedly Improves Amorphadiene Production in Escherichia coli. Biotechnology and Bioengineering. 9999: 1-9. Zhi Li, X.; Elkins, C. A. and Zgurskaya, H. I. (2016). Efflux-Mediated Antimicrobial esistance in Bacteria Mechanisms, egulation And Clinical Implications. International Publishing. witzerland. 848pp. Zowawi, H. M.; Harris, P. N. A.; oberts, M. J.; Tambyah, P. A.; chembri, M. A.; Pezzani, M. D.; Williamson, D. A. and Paterson, D. L. (2015).The Emerging Threat of Multidrug-esistant Gram-Negative Bacteria in Urology. Nat ev Urol

127 المصادر مصادر االنترنت

128

129 المالحق Antibiotics الملحق )1( مقاومة عزالت بكتريا.E coli للمضادات الحيوية رقم F CN CIP TE NV CTX CAZ A E PY العزلة I I I E1 E2 I E3 E4 I E5 E6 E7 E8 I I E9 E10 E11 I E12 E13 E14 I E15 E16 E17 E18 E19 I E20 106

130 المالحق I E21 E22 E23 E24 E25 E26 E27 I I E28 E29 I E30 I E31 E32 I E33 E34 E35 E36 E37 I I I E38 I E39 E40 E41 E42 E43 107

131 المالحق E44 E45 E46 E47 E48 E49 E50 PY: Carbenicilline,E: Erythromycin, A: ifampicin, CAZ: Ceftazidime, CTX: Cefotaxim, NV: Novobiocin, TE: Tetracycline, CIP: Ciprofloxacin, CN: Gentamicin, F: Nitrofurantoin, : esistance,: ensitive, I:Intermedate. الملحق )2( بعض عوامل الض اروة لبكتريا.E coli التي تشمل ( القابلية على تكوين الغشاء الحيوي )Urease انتاج انزيم الهيمواليسين Hemolysin و انتاج انزيم اليوريا Biofilm رقم العزلة E1 E2 E3 E4 E5 انتاج انزيم انتاج انزيم الغشاء الحيوي الجنس المصدر Urease Hemolysin Biofilm ex ources - - انثى مدينة االمامين الكاظمين )ع( التعليمي المختب ارت التعليمية انثى - - / مدينة الطب مدينة االمامين الكاظمين انثى - - )ع( التعليمي المختب ارت التعليمية انثى - - / مدينة الطب المختب ارت التعليمية انثى - - / مدينة الطب - - انثى مستشفى حماية E6 108

132 المالحق االطفال/مدينة الطب المختب ارت التعليمية انثى - - / مدينة الطب مدينة االمامين الكاظمين ذكر - - )ع( التعليمي مستشفى الطفل المركزي انثى - - التعليمي مدينة االمامين الكاظمين انثى - - )ع( التعليمي مستشفى بغداد ذكر التعليمي/مدينة الطب مستشفى بغداد انثى - - التعليمي/مدينة الطب مستشفى حماية انثى - - االطفال/مدينة الطب مستشفى حماية انثى - - االطفال/مدينة الطب مستشفى حماية ذكر - - االطفال/مدينة الطب المختب ارت التعليمية /مدينة ذكر - - الطب المختب ارت التعليمية/مدينة انثى - - الطب مستشفى الطفل المركزي انثى - - التعليمي المختب ارت التعليمية /مدينة انثى - - E7 E8 E9 E10 E11 E12 E13 E14 E15 E16 E17 E18 E19 الطب 109

133 المالحق مستشفى الطفل المركزي انثى - - التعليمي المختب ارت التعليمية /مدينة انثى الطب مستشفى حماية انثى - - االطفال/مدينة الطب مدينة االمامين الكاظمين انثى - - )ع( التعليمي مستشفى حماية ذكر - - االطفال/مدينة الطب مستشفى حماية انثى β - االطفال/مدينة الطب مستشفى الطفل المركزي انثى β - التعليمي مدينة االمامين الكاظمين ذكر - - )ع( التعليمي مستشفى الطفل المركزي انثى - - التعليمي المختب ارت التعليمية /مدينة انثى - - الطب مدينة االمامين الكاظمين ذكر - - )ع( التعليمي مدينة االمامين الكاظمين انثى )ع( التعليمي المختب ارت التعليمية /مدينة انثى - - E20 E21 E22 E23 E24 E25 E26 E27 E28 E29 E30 E31 E32 الطب - - انثى مدينة االمامين الكاظمين E33 110

134 المالحق )ع( التعليمي مدينة االمامين الكاظمين انثى - - )ع( التعليمي مستشفى بغداد انثى - - التعليمي/مدينة الطب المختب ارت التعليمية /مدينة انثى - - الطب المختب ارت التعليمية /مدينة ذكر - - الطب المختب ارت التعليمية /مدينة انثى - - الطب مستشفى حماية انثى االطفال/مدينة الطب مستشفى حماية انثى - - االطفال/مدينة الطب مستشفى بغداد ذكر التعليمي/مدينة الطب مدينة االمامين الكاظمين ذكر - - )ع( التعليمي مدينة االمامين الكاظمين انثى - - )ع( التعليمي مدينة االمامين الكاظمين انثى - - )ع( التعليمي مستشفى حماية ذكر - - االطفال/مدينة الطب مدينة االمامين الكاظمين انثى β - E34 E35 E36 E37 E38 E39 E40 E41 E42 E43 E44 E45 E46 )ع( التعليمي 111

135 المالحق مستشفى بغداد انثى - - التعليمي/مدينة الطب مستشفى حماية ذكر - - االطفال/مدينة الطب المختب ارت التعليمية /مدينة انثى - - الطب مستشفى حماية انثى - - E47 E48 E49 E50 االطفال/مدينة الطب : النتيجة الموجبة - النتيجة السالبة الغشاء الحيوي ( : ضعيفة القابلية على تكوين الغشاء الحيوي : متوسطة القابلية على تكوين الغشاء الحيوي قوية القابلية على تكوين الغشاء الحيوي ) β: محللة للدم من نوع بيتا β-hemolysine الملحق )3( العالقة بين الكشف المظهري والكشف الجيني عن مضخات الدفق Efflux Pumps E. coli والقابلية على تكوين الغشاء الحيوي Biofilm في بكتريا رقم القابلية على الكشف المظهري الكشف الجيني عن مضخات الدفق acrb gene acra gene تكوين الغشاء الحيوي - عن مضخات الدفق العزلة E1 E2 E3 E4 E5 E6 E7 E8 E9 E10 E11 E12 E13 112

136 قحلاملا 113 E14 E15 E16 E17 E18 E19 E20 E21 - E22 E23 E24 E25 E26 - E27 E28 - E29 E30 E E32 E33 E34 - E35 - E36 E37 E38 E E40 E41 - E42 E43 E44 - E45 E46 - E E48 E49 - E50 ةبجوملا ةجيتنلا - ةبلاسلا ةجيتنلا

137 المالحق الملحق )4( نتائج قياس نقاوة DNA في جهاز نانو دروب Nano Drop ample Con(ng/ul) 260/ Abs280 Abs260 Type 280 رقم العزلة dsdna E1 dsdna E2 dsdna E3 dsdna E4 dsdna E5 dsdna E6 dsdna E7 dsdna E8 dsdna E9 dsdna E10 dsdna E11 dsdna E12 dsdna E13 dsdna E14 dsdna E15 dsdna E16 dsdna E17 dsdna E18 dsdna E19 dsdna E20 dsdna E21 dsdna E22 dsdna E23 dsdna E24 dsdna E25 dsdna E26 dsdna E27 dsdna E28 dsdna E29 dsdna E30 dsdna E31 dsdna E32 114

138 المالحق dsdna E33 dsdna E34 dsdna E35 dsdna E36 dsdna E37 dsdna E38 dsdna E39 dsdna E40 dsdna E41 dsdna E42 dsdna E43 dsdna E44 dsdna E45 dsdna E46 dsdna E47 dsdna E48 dsdna E49 dsdna E50 115

139 المالحق. E27 E. coli الملحق )5-A( التحليل التتابعي للجين 16srNA لبكتريا للعزلة 116

140 المالحق. E27 E. coli الملحق )5-B( التحليل التتابعي للجين acra لبكتريا للعزلة. E27 E. coli الملحق )5-C( يوضح التحليل التتابعي للجين acrb لبكتريا للعزلة. E27 E. coli الملحق )6-A( التسلسل التتابعي للجين 16rNA لبكتريا في العزلة Amplicon eferring locus sequences (5-3 ) length 16 rna DNA sequences CGAGTGGCGGACGGGTGAGTAATGTCTGGGAAACTGCCTGATGGAGGGGGATAACTA CTGGAAACGGTAGCTAATACCGCATAACGTCGCAAGACCAAAGAGGGGGACCTTCGG GCCTCTTGCCATCGGATGTGCCCAGATGGGATTAGCTAGTAGGTGGGGTAACGGCTC ACCTAGGCGACGATCCCTAGCTGGTCTGAGAGGATGACCAGCCACACTGGAACTGAG ACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAA GCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTATGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGTACTTTC AGCGGGGAGGAAGGGAGTAAAGTTAATACCTTTGCTCATTGACGTTACCCGCAGAAG AAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCAAGCGTTAA TCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCACGCAGGCGGTTTGTTAAGTCAGATGTGAAATC CCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATCTGATACTGGCAAGCTTGAGTCTCGTAGAGGG GGGTAGAATTCCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCTGGAGGAATACCGGTGG CGAAGGCGGCCCCCTGGACGAAGACTGACGCTCAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAA CAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCGA* bp 117