المجال 2

النسخ

1 روبة األستاذ : المجال الثاني: الكيمياء الحيوية النشاط العملي رقم 0: phmètre معايرة محلول حمضي لألالنين بواسطة محلول NaOH عن طريق ال النشاط العملي رقم 0: الكشف عن مكونات مزيج من األحماض األمينية بطريقة الكروماتوغرافيا الورقية النشاط العملي رقم 0: الكشف عن البروتينات و األحماض األمينية العطرية النشاط العملي رقم 0: wohlgemuth تقدير نشاط األميالز بطريقة النشاط العملي رقم 0: تقدير ألبومين البيض بالطريقة اللونية

2 النشاط العملي رقم 0: معايرة محلول حمضي لألالنين بواسطة محلول NaOH عن طريق ال phmètre األالنين حمض أميني أحادي الوظيفة الحمضية وأحادي الوظيفة األمينية تذكير: COOH NH zwittèrion في محلول مائي يكون على شكل أيون ثنائي القطب H N + COO k H في وسط حمضي األيون الثنائي القطب يلعب دور أساس وبالتالي يثبت بروتون ثابت التفكك هو + H N + COO + H + H N + COO H k H في وسط أساسي األيون الثنائي القطب يلعب دور حمض وبالتالي يحرر بروتون ثابت التفكك هو + (Zwitterion) H N + COO + OH H N COO + H O لذلك يمتاز األالنين بالخاصية األمفوتيرية: + OH + OH H COO COO N + COOH H N + H N + H + + H + ph < phi Cation كاتيون A + أي أيون متعادل كهربائيا ph = phi ثنائي القطب أيون Zwitterion ph > phi Anion أنبون A ( ph isoélectrique نقطة التعادل الكهربائي( ph هو ph i A + A + تكون األحماض األمينية على شكل أيون ثنائي القطب

3 الهدف: تحديد قيمة ال ph i لألالنين 0 المبدأ: يتمثل في معايرة محلول حمضي من األالنين بواسطة محلول قياسي من أساس قوي NaOH باستعمال جهاز ال phmètre تتم المعايرة عبر مرحلتين: يتم تعديل الحموضة األولى وفق المعادلة اآلتية: H N + COO H + OH H N + COO + H O يتم تعديل الحموضة الثانية وفق المعادلة اآلتية: H N + COO + OH H N COO + H O 0 المواد و األدوات الالزمة : بيشر المواد األدوات محلول أالنين (N 0) محلول (0 N) NaOH محلول ( N) HCl ماء مقطر محاليل منظمة ph= 4 ph=7, سحاحة مدرجة قمع زجاجي ماصة 0mL, ml, ml جهاز الpHmètre خطوات العمل: ضبط الجهاز : نغسل مسرى قياس ال ph بالماء المقطر ثم نغمسه داخل البيشر رقم الذي يحتوي على المحلول المنظم ذو ( 7= )ph نشغل الجهاز و نضبط القيمة على 7= ph باستعمال الزر المناسب على الجهاز نطفئ الجهاز ننزع المسرى نغسله بالماء المقطر ثم نغمسه داخل البيشر رقم الذي يحتوي على المحلول المنظم ذو) 4 = ph (,نشغل الجهاز و نضبط القيمة على = 4 ph نطفئ الجهاز ننزع المسرى و نغسله بالماء المقطر 0

4 (0 N) NaOH المعايرة: نمأل السحاحة بمحلول بواسطة الماصة و اإلجاصة الماصة نأخذ 40 ml من محلول األالنين و نضعه نغمس مسرى قياس ال ph نشغل الجهاز داخل البيشر نضيفmL 4 من ( N) HCl 0) (N NaOH بحجوم معلومة و ندون قيم ال ph الموافقة لكل إضافة حتى يساوي في جدول نسحح محلول الحصول علىpH النتائج: نمأل 0 الجدول التالي : V NaOH (ml) ph 0 6 طريقة الحساب: ph i = pka + pka تعيين ph i األالنين حسابيا : تعيين ph i األالنين بيانيا: نرسم المنحنى ) NaOH ph= f( V ph E pka phi E pka V E / V E V E / V E = V E V (NaOH) (ml) 4

5 خالل المعايرة لدينا: *عند < V < V equi 0 الثنائية الموجودة في المحلول هي: + H N COO و + H N COOH V E/ = V E نعين pka عند نصف التكافؤ األول : باإلسقاط نتحصل على ph = pka ph = ph i H N *عند V equi لدينا أيون ثنائي القطب COO *عند V equi < V < V equi الثنائية الموجودة في المحلول هي + H N COO H N و COO H V E/ = V E + V E نعين pka عند نصف التكافؤ الثاني: باإلسقاط نتحصل على ph = pka 5

6 النشاط العملي رقم 0: الكشف عن مكونات مزيج من األحماض األمينية بطريقة الكروماتوغرافيا الورقية تذكير: تفاعل األحماض األمينية مع النينهيدرين: المرحلة( ) : النينهيدرين مؤكسد قوي يؤدي عن طريق تفاعل نزع مجموعة األمين التأكسدية oxydative) ( désamination لألحماض األمينية إلى تشكيل نينهيدرين مرجعة وألدهيد و تحرير النشادر NH وغاز CO وفقا التفاعل اآلتي: + COOH H + O + CO + NH نينهيدرين مرجعة NH حمض أم ي ني نينهيدرين المرحلة )0( : يتفاعل غاز NH مع النينهيدرين المرجعة و جزيء آخر من النينهيدرين ليعطي مركب ازرق بنفسجي يدعى أرجوان الرومان Pourpre de uhemann يستغل هذا التفاعل في الفصل الكروماتوغرافي والمعايرات التلوينية لألحماض األمينية H + NH + H O OH أرجوان الرومان الهدف:ون البنفسجي تتناسب مع نوع األحماض األمينية ما عدا مع البرولين يكون اللون اصفر 6

7 الهدف : الكشف على األحماض األمينية في مزيج بالفصل الكروماتوغرافي المبدأ: الكروماتوغرافيا الورقية هي تقنية مستعملة بكثرة من أجل فصل األحماض األمينية وتعتمد على اختالف هجرة المكونات بين طور ثابت هو الورق و طور متحرك عبارة عادة عن مزيج من المذيبات العضوية 7 يوضع المزيج المراد فصله على الورق الكروماتوغرافي ( ورق Wathman أو ورق السيليلوز( ثم يغمس طرفه في المذيب بعد مدة يصعد المذيب و يجرف معه مكونات وعاء الفصل الكروماتوغرافي الخليط لتنتقل على مسافات مختلفة حسب نوع كل مكون و قابليته للذوبان في المذيب المستعمل 0 المواد و األدوات الالزمة : المواد مذيب مساعد على الهجرة يتكون من: 70 ml بوتانول 8 ml حمض الخل الثلجي ml ماء مقطر محلول العينة محاليل مائية لألحماض األمينية الشاهدة ( أالنين برولين لوسين ( كاشف: نينهيدرين 0 g وماء مقطر 0 ml األدوات أنابيب شعرية أو أنابيب باستور وعاء الفصل الكروماتوغرافي مجفف الشعر ورق الترشيح مالحظة : يتم تحضير محاليل األحماض األمينية بكميات قليلة جدا كما يمكن االحتفاظ بها في الثالجة يحضر الكاشف حديثا ويحفظ في قارورة زجاجية ملونة في الدرجة 4 C 0 خطوات العمل: وضع المذيب داخل وعاء الفصل يكون قبل ساعة من بداية التجربة وأن ال يكون مستوى المذيب أعلى من الخط المرسوم على الورقة قطع الورقة بعرض أقل من عرض وعاء الفصل رسم خط البداية في أسفل الورقة بقلم الرصاص يبعد عن الحافة ب cm أخذ محاليل األحماض األمينية الشاهدة و محلول العينة بأنابيب شعرية مختلفة وضع قطرات المحاليل الشاهدة والعينة في أماكنها المخصصة تفصلها مسافات محددة على خط البداية جفف القطرة بعد وضعها مباشرة حتى ال تتسع في كل مرة مع تكرار العملية لعدة مرات ضع الورقة داخل وعاء الفصل وأتركها لمدة كافية لحدوث الهجرة جفف الورقة داخل المدخنة رشها بالكاشف ثم جفف بمجفف الشعر حتى ظهور بقع ملونة

8 مراحل الكروماتوغرافيا الورق الكروماتوغرافي خط البداية ماصة باستور وضع أول قطرة وعاء الفصل المذيب التجفيف وضع قطرة أخرى هجرة المذيب الكروماتوغرام 0 النتائج: األحماض األمينية الشاهدة المعلومة M مزيج األحماض األمينية لمحلول العينة l l في المثال الموجود في الكروماتوغرام بعد رش ورقة الكروماتوغرافيا بكاشف النينهيدرين و تجفيفها داخل المجفف تظهر بقع ملونة باألزرق البنفسجي األحماض األمينية الشاهدة المعلومة M مزيج األحماض األمينية لمحلول العينة يتضح من الكروماتوغرام أن المزيج M يحتوي على الحمضين األمينين و و خط النهاية d خط البداية l l 4 المزيجM 4 8

9 النشاط العملي رقم 0: الكشف عن و البروتينات األحماض األمينية العطرية تذكير: األحماض األمينية العطرية: االسم الرمز الصيغة الكيميائية COOH Phe Phénylalanine فنيل أالنين NH HO COOH Tyr Tyrosine تيروزين NH NH COOH Trp Tryptophane تريبتوفان NH الرابطة الببتيدية: تنتج من اتحاد حمضين أمينيين على األقل بإزاحة جزيء ماء فترتبط الوظيفة الحمضية للحمض األميني األول مع الوظيفة األمينية للحمض األميني الثاني وتتكون الرابطة الببتيدية و المركب المتكون في هذه الحالة هو ثنائي الببتيد O H N C OH O H O O H + N C H N C N C + H O H OH OH بيبتيدية رابطة بيبتيد ثنائي أميني حمض 0 أميني حمض التركيب البنائي األولي للبروتينات: ينتج التركيب البنائي األولي للبروتين عن تسلسل مجموعة من األحماض األمينية مرتبطة بروابط ببتيدية ( سبق التعرف عليها في خواص األحماض األمينية( : H N ( n) COOH 0 n 9

10 الهدف: الكشف عن البروتينات والكشف على األحماض األمينية العطرية المبدأ: أوال : نكشف عن البروتينات بالكشف عن الروابط الببتيدية بطريقة بيوري : عند إضافة محلول كبريتات النحاس ) 4 (CuSO في وسط قاعدي ) (OH إلى محلول بروتيني يتشكل معقد بين أيون النحاس Cu + و الروابط الببتيدية للبروتين وظهور لون أزرق بنفسجي ثانيا : نكشف عن األحماض األمينية العطرية في هذا البروتين و ذلك بطريقة كزانثوبروتييك: عند إضافة حمض األزوت المركز) ) HNO إلى محلول بروتيني يتشكل مركب أزوتي ذو لون أصفر بسبب دخول زمرة النيترو في الحلقة العطرية و يتحول اللون إلى البرتقالي عند إضافة هيدروكسيد األمونيوم المركزة NH 4 OH 0

11 0 المواد و األدوات الالزمة : أنابيب اختبار ماصات المواد األدوات ml,ml,5ml بيشر مصباح بنزن محلول (40%) NaOH أو (0%) NH 4 OH محلول كبريتاتت النحاس %) CuSO 4 ( حمض النتريك المركز محلول حمض أميني ) Gly( محلول بروتيني ( زالل البيض( محلول ماء مقطر خليط من حمضين أمينيين )AlaGly( حمام مائي 0 طريقة العمل: التجربة )( : الكشف عن البروتينات بطريقة بيوري ml من محلول NaOH بحذر و على الجدار الداخلي لألنبوب + بعض قطرات من محلول CuSO 4 ml محلولPhe ml زالل البيض Gly محلول ml التجربة )0( : الكشف عن األحماض األمينية العطرية في البروتينات )تفاعل كزانتوبروتيك( HNO ml ml من محلول زالل البيض حمام مائي قطرات NH 4 OH بعد تبريد األنبوب الراسب الناتج أعد التجربة مع الغليسين ومع الفنيل األالنين

12 الغليسين الفنيل أالنين زالل البيض 0 النتائج: دون نتائج االختبارين في جدول كاشف بيوري كاشف كزانتوبروتيك األسئلة: ماذا تستنتج من التجربة )( علل إجابتك أكتب صيغة معقد النحاس مع ثالثي الببتيد التالي : ValLysTyr ماذا تستنتج من التجربة )( أكتب معادلة تفاعل الفنيل أالنين مع HNO 6

13 wohlgemuth النشاط العملي رقم 0: تقدير نشاط األميالز بطريقة تذكير: اإلنزيمات: هي مواد بروتينية بسيطة أو مركبة تنتجها الخاليا الحية تلعب دور وسائط بيوكيميائية متخصصة ( عوامل محفزة للتفاعالت ) تسرع و تحفز التفاعالت البيوكيميائية ومن خواصها: تشترك بالتفاعل ولكن تركيبها الكيميائي بعد التفاعل يبقى ثابتا )غالبا(أي ال تستهلك تدخل في التفاعل بكميات ضئيلة جدا تقلل من طاقة التنشيط الالزمة لحدوث التفاعل تصن ف اإلنزيمات حسب نوع التفاعل المحف ز و كذلك حسب المادة التي تؤثر عليها إلى ستة مجموعات: إنزيمات األكسدة و اإلرجاع اإلنزيمات الناقلة إنزيمات التحل ل المائي اإلنزيمات النازعة إنزيمات التماكب )اإليزوميراز( إنزيمات الربط )الليغاز( األميالز: األميالز من إنزيمات التحلل المائي تفرزه المعثكلة )البنكرياس( في الدم كما نجده أيضا في إفرازات الغدد اللعابية وهو يتكون من α أميالز وβ أميالز يحف ز إنزيم األميالز التحليل المائي للنشا مائيا فينتج في البداية الدكسترينات ثم المالتوز و الغلوكوز + أم ي الز أم ي الز غ لوك وز + مال توز دي ك س تري نات ماء ن شاء

14 الهدف: تقدير نشاط إنزيم األميالز 0 المبدأ: يتم تقدير نشاط األميالز بتقدير اختفاء المادة المتفاعلة وهي تحلل النشا إلى مالتوز وغلوكوز: amylase n (C 6 H 0 O 5 ) + n H O n (C H O ) + n (C 6 H O 6 ) النشا الجلوكوز المالتوز نمدد كمية من األميالز بطريقة التخفيفات المتسلسلة نكشف عن مراحل تحلل النشاء باستعمال ماء اليود نعبر عن النتائج المتحصل عليها بوحدة wohlgemuth وهي أكبر تخفيف )أصغر كمية من اإلنزيم ) تقوم بتحليل كمية معينة من النشا )mg( خالل دقيقة و عند درجة الحرارة 7 C المواد و األدوات الالزمة : 0 المواد األدوات حمام مائي ماء فزيولوجي )محلول كلور الصوديوم أنابيب اختبار )9 g/l( NaCl محرار اللعاب ( أو مصل الدم( ماصات 5mL ml مطبوخ النشاء ( g/l ) ماء اليود 0 طريقة العمل: نحضر أنابيب اختبار : نرقمها من )9 g/l ( NaCl من محلول ml : نضع في كل أنبوب نضيف إلى األنبوب رقم )( : ml من اللعاب ( أو مصل الدم( و نرج جيدا ml من األنبوب رقم )( و نضعها في األنبوب رقم )( و نرج جيدا نأخذ ml من األنبوب رقم )( و نضعها في األنبوب رقم )( و نرج جيدا و نستمر بهذه نأخذ الطريقة حتى األنبوب رقم )( كما هو الحال في الرسم: 4

15 نضيف لكل أنبوب ml من مطبوخ النشا و نرج جيدا األنابيب نضع األنابيب في حمام مائي درجة حرارته 7 C لمدة دقيقة نخرج األنابيب و نضيف قطرة من ماء اليود في كل أنبوب ابتداء من األنبوب رقم ثم نسجل يظهر فيه اللون األزرق أول أنبوب لم : جدول 0 التخفيفات المتسلسلة و النتائج التجريبية رقم األنبوب )9 g/l( NaCl ( ml) / التخفيفات النشا ( )g/l ( ml) نتيجة الكشف اليود بماء 6 طريقة تقدير نشاط األميالز: يقدر نشاط األميالز كما يلي: كمية األميالز توافق كمية معينة من النشاء )mg( الموجودة في التخفيف نأخذ األنبوب رقم )(: التخفيف = g ( (النشا 000 ml 0 mg 000 ml w = w mg ml األنبوب رقم )( يمثل وحدتين )wohl( wohlgemuth منه : نشاط األميالز = 0 مقلوب التخفيف مالحظة : تتراوح كمية األميالز في مصل دم شخص سليم ما بين 0 وحدة wohl األسئلة: أكمل الجدول أعاله 0 ماذا تستنتج بعد الكشف عن وجود النشاء في األنابيب المدروسة ما هو األنبوب الذي يمثل أكبر تخفيف قدر نشاط اإلنزيم في اللعاب ما هي العوامل المؤثرة على نشاط اإلنزيم 7 5

16 النشاط العملي رقم 05: تقدير ألبومين البيض بالطريقة اللونية )استعمال كاشف بيوري( مفهوم القياس اللوني: تتمثل في تعيين تركيز عنصر ما في محلول بتحويله إلى مركب ملون بواسطة الكواشف المناسبة بحيث تتناسب شدة اللون وكثافته مع تركيز المادة التي نقوم بقياسها, وتقاس شدة اللون بواسطة جهاز القياس اللوني )colorimètre( أو بواسطة جهاز القياس الطيفي )الضوئي( )spectrophotomètre( تركيب أجهزة القياس الطيفي )الضوئي(:يمكن اختصار مكونات أجهزة القياس الضوئي فيما يلي: مصدر الضوء )مصباح تنغستين مصدر للضوء العادي أو مصباح هيدروجيني مصدر لألشعة فوق البنفسجية( فتحة لتوجيه الضوء منشور زجاجى أو عاكس مشتت للضوء في حالة القياس الضوئي )مرشحات ضوئية في حالة القياس اللوني( منتقى موجة واحدة 0 خلية االمتصاص Cuvette 0 مسجل 6

17 )Transmission( نظام القراءة على المسجل القراءة على تدريج ومؤشر الجهاز: يوجد تدريجان لنظام القراءة أحدهما يقرأ النفاذية و اآلخر االمتصاص )Absorbance( و العالقة عكسية بينهما القراءة الرقمية : تكون على عداد رقمي يتم ضبطه مسبقا من خالل لوحة التحكم بالجهاز لتحديد نظام القراءة :Lambert كمية الضوء الممتص يعتمد على سمك المحلول الملون أو مسار الضوء خالل المحلول قوانين امتصاص الضوء: : Beer أوال قانون لمبار ثانيا قانون بير ثالثا قانون بير لمبار كمية الضوء الممتص تعتمد على لون المحلول Lambert Beer ينص القانون على وجود ارتباط لوغاريتمي بين امتصاص الضوء خالل المادة وحاصل ضرب االمتصاصية المولية ε والمسافة التي يقطعها الضوء خالل المادة )طول المسلك( l والتركيز C للمادة الماصة A = log I 0 /I = c l M) cm ) معامل االمتصاص وهو ثابت عند طول موجة محددة = (M) تركيز المادة المراد معايرتها = C طول الخلية ( المسافة التي يقطعها الضوء في العينة(( cm ) = l = coefficient d extinction molaire à une longueur d onde donnée (M cm ) C = concentration de la substance absorbante (M) l = parcours optique يجب تحديد طول الموجة المخصص للقراءة )يكون الضوء الساقط أحادي اللون( ضرورة ضبط الصفر الجهاز باستعمال المحلول الشاهد )Blanc( 7 يجب وضع الخلية في الجهاز بصورة صحيحة يجب أن يكون وسط االمتصاص موزعا بتجانس في الحجم الكلي مع مراعاة أن ال يقل المحلول في الخلية عن الحد األدنى للقراءة ml( ( وعدم وجود أي فقعات بها 0 غلق مكان وضع الخلية عند القراءة

18 الهدف: 0 المبدأ: تعطي البروتينات تعيين تركيز بروتين األلبومين في زالل البيض باستغالل خواصه الفيزيائية والكيميائية مع أيونات النحاس )Cu + ( في وسط قاعدي )كاشف بيوري ) مركب ملون أزرق بنفسجي و شدة اللون تتناسب طردا مع التركيز وتقاس بواسطة جهاز القياس اللوني أو بواسطة جهاز القياس سرعة ظهور التلون وشدته تتوقف على: تركيز )Cu + ( درجة الحرارة الضوئي وقاعدية الوسط )لذا من الضروري استعمال كاشف خاص مثل كاشف )Gornall طبيعة الببتيد أو البروتين )الكثافة اللونية تتناسب طردا مع عدد الروابط الببتيدية ) 0 المواد و األدوات الالزمة : المواد محلول ألبومين قياسي 0 g/l زالل بيض كاشف Gornall محلول فزيولوجي األدوات جهاز القياس اللوني )سبكتروفوتومتر( حمام مائي كبريتات النحاس تركيب كاشف :Gornall أنابيب اختبار 5g = (CUSO 4,5H O) طرطرات الصوديوم و البوتاسيوم = 6g 0g = g NaOH = KI ماء مقطر L تركيب المحلول الفزيولوجي: 0 طريقة العمل: 0 محلول كلور الصوديوم 9g/L ضبط جهاز القياس اللوني:) انشاء المنحنى القياسي( انطالقا من محلول قياسي لأللبومين ذو تركيز معلوم 0 g/l و الماء الفزيولوجي حضر في 0 أنابيب بتراكيز تتراوح من g/l) 0) mg ألبومين في األنبوب وفقا للجدول اآلتي: 5 محاليل قياسية رقم األنبوب المحلول القياسي 0 g/l الماء الفزيولوجي) ml ( كاشف )ml( Gornall كمية األلبومين )mg( 8

19 أ أكمل الجدول أمزج محتوى كل أنبوب جيدا أترك األنابيب لمدة دقيقة في مكان مظلم اقرأ الكثافة الضوئية في موجة طولها 0 نانومتر ضد األنبوب الشاهد )( و دون النتائج في الجدول )( 00 معايرة بروتينات زالل البيض: تحضير محلول زالل البيض: زن زالل بيضة ب المعايرة: ذوبه في L محلول فزيولوجي )وليكن المحلول ) S االختبار : ضع في أنبوب اختبار 4mL + من محلول زالل البيض ml ( أو )A D أترك األنبوب لمدة دقيقة في الظالم تقرأ الكثافة اللونية ضد الشاهد ولتكن القيمة االختبار : اتبع نفس مراحل االختبار ولتكن القيمة المقروءة 0 النتائج التجريبية: ( أو )A D دون النتائج في الجدول) ( على النحو التالي: من كاشف Gornall 0 رقم األنبوب المحلول القياسي 0 g/l محلول زالل البيض )ml( الماء الفزيولوجي) ml ( كاشف )ml( Gornall كمية األلبومين )mg( q E الكثافة الضوئية عند موجة 0 نانومتر) D ) االختبار االختبار أرسم المنحنى القياسي ) E D = f q) )أو الكثافة الضوئية بداللة التركيز( على ورق مليمترية استنتج تركيز العينة E أحسب تركيز البروتين g/l في محلول زالل البيض ثم استنتج كمية البروتين في 00g من زالل البيض 0 إذا علمت أن متوسط تركيب زالل البيض هو: 85% 9% 0% 08% 0% ماء بروتينات لبيدات غلوسيدات أمالح معدنية هل كمية البروتين مطابقة للنتائج المحصل عليها 9

20 نموذج للنتائج: النتائج المحصل عليها: 0 رقم األنبوب االختبار االختبار المحلول القياسي 0 g/l محلول زالل البيض )ml( الماء الفزيولوجي) ml ( كاشف )ml( Gornall كمية األلبومين )mg( q E الكثافة الضوئية عند موجة 0 نانومتر) D ) A(0 ) المنحنى القياسي: A q (mg) T = ( g/l ) تركيز البروتين: q E V E = ml V E االختبار األول : g/l T = 46 االختبار الثاني : g/l T = 46 معدل التركيز : g/l T m = ( 4 ± 0 ) نسبة البروتينات : كمية زالل البيض : g m = ( من البروتينات ) g 4 P % (من زالل البيض) g 00 g P= 6 % كمية البروتين مطابقة للنتائج المحصل عليها 0