<4D F736F F D20C7E1C8CDCB20C7E1CBC7E3E420DAD4D1>

النسخ

1 مجلة علوم الرافدين المجلد 16 العدد 8 خاص بعلوم الحياة ص تحييد المحتوى البلازميدي في جرثومة erratia marcescens باستخدام درجة الحرارة العالية وباستخدام الاكردين البرتقالي واليوريا بيداء غانم محمد فرع الاحياء المجهرية كلية الطب البيطري جامعة الموصل (تاريخ الاستلام 2004/12/11 تاريخ القبول 2005/3/1) الملخص تم اجراء الدراسة الحالية على خمسة عزلات من جرثومة. marcescens المعزولة من حالات الانتان الدموي والتي تم الحصول عليها من مستشفى السلام في باستخدام الصفات الزرعية والكيمياحياتية فضلا عن استخدام نظام الموصل. شخصت العزلات الجرثومية.API20E اختبرت مقاومة الجراثيم للمضادات الحيوية الكلورامفنيكول التتراسايكلين الامبسلين الارثرومايسين والجنتامايسين اجريت عملية تحييد المحتوى البلازميدي باستخدام درجة الحرارة 45 م وتركيز 40 مايكروغرام/مل من الاكردين البرتقالي وتركيز 100 مايكروغرام/مل من اليوريا. وعند تنمية جراثيم. marcescens عند درجة حرارة مي وية 45 م ظهرت مستعمرات جرثومية محيدة حساسة للمضادات الحيوية المستخدمة وبنسب %94-40 عدا المضاد الحيوي الارثرومايسين واظهر اختبار تحييد المقاومة للمضادات الحيوية باستخدام الاكردين البرتقالي وبتركيز الحيوية وبمدى 40 مايكروغرام/مل فقد اظهرت النتاي ج فقدان المقاومة للمضادات %92-10 عدا الارثرومايسين اما بالنسبة لعامل اليوريا فقد اظهرت النتاي ج فقدان المقاومة للمضادات الحيوية وبنسبة والكلورامفنيكول وعند تركيز 100 مايكروغرام/مل. %93-10 للمضادات الحيوية قيد الدراسة عدا المضادين الامبسلين Curing of erratia marcescens Plasmid by High Temperature and by Acridine Orange and Urea Bayda Gh. Mohammad Department of Microbiology College of Veterinary Medicine Mosul University ABTACT The present study was conducted on five isolates of. marcescens from septicemic patients in Al-alam Hospital in Mosul. Isolates were identified by using cultural and biochemical characteristics as well as the Api 20E system esistance of the isolates to Chloramphenicol, Tetracycline, Ampicillin, Erythromycin and Gentamycin 191

2 192 بيداء غانم محمد was checked. Curing the Isolates of their plasmids was performed by using high temperature (45 c), acridine orange (40 µg/ml) and urea (100 µg/ml). When. marcescens isolates were grown at 45 C cured and sensitive bacterial colonies were observed at a frequency of 10 94%. These, however, were resistant to Erythromycin. Treating the isolates with Acridine orange cured them of all them resistance except Erythromycin at 10 92%.Urea treatment cured their of all resistance phenotypes except Ampicline and Chloramphenicol, also at a frequency of 10 93%. المقدمة اصبحت جرثومة erratia marcescens ذات اهمية متزايدة في امراض عدوى المستشفيات وفي العقود الماضية اظهرت زيادة في مقاومتها للمضادات الحيوية مثل الجنتامايسين والسيفالوسبورينات ولوحظ مبكرا وبشكل خاص في حالات الوباء ان المقاومة في هذه الجرثومة مشفرة على البلازميد (1981 McNeill,.(John and ان ميكانيكيات المقاومة لبعض المضادات الحيوية من قبل جرثومة. marcescens وخاصة للمضاد الحيوي Carbapenems تتضمن فقدان النفاذية للغشاء الخارجي وانتاج انزيمات محللة لحلقة β-lactam وقابلية التحلل هذه تا تي نتيجة انتاج جزيي ة صنف β-metalloenzymes والمتمثلة ب IMP-1 في هذه الجرثومة (2000 al., (Queenan, et وقد وجد ان المقاومة المتعددة للمضادات الحيوية في السلالات الممرضة لجرثومية. marcescens والمسببة لاصابات عدوى المستشفيات تعزى الى بلازميد يتوسط انزيم β lactamase الفعال ضد مضادات Cephalosporins واسعة الطيف (1977 Pieard, (Goullet and. وتشخص جرثومة erratia ضمن عاي لة الجراثيم المعوية والتي تمتلك البلازميدات المقاومة للعقارات ومنها البلازميدات الحاملة للمورثات المسو ولة عن مقاومة المضادات الحيوية والتي يطلق عليها عوامل والتي وجدت في جراثيم متعددة (1972.(ichmond, ويمكن ان تفقد الخلايا الجرثومية البلازميدات تلقاي يا ولكن بترددات واطي ة وهذه الظاهرة تسمى التحييد التلقاي ي حيث بالامكان زيادة تردد فقدان البلازميدات عند تعرض الخلايا ا لى مركبات تحشر نفسها بين قواعد DNA وبشكل خاص الاكردينات مثل البروفلافين والاكردين البرتقالي وبروميد الاثيديوم وباستخدام مادة odium Dodesyl ulphate كما يمكن حذف البلازميدات عن طريق نمو السلالات الجرثومية بوجود اليوريا وعند درجات حرارية عالية.(Mickelsen et al., 1985) في البحث الحالي تم اختيار بعض العوامل الكيمياي ية وهي الاكردين البرتقالي واليوريا كما تم استخدام درجة حرارة 45 م لاحداث التحييد في عزلات جرثومة.erratia marcescens

3 193 تحييد المحتوى البلازميدي في جرثومة المواد وطراي ق العمل العزلات الجرثومية: تم الحصول على خمسة عزلات من جرثومة erratia marcescens من مستشفى السلام في الموصل والمعزولة من حالات الانتان الدموي. شخصت العزلات باستخدام الصفات المجهرية والزرعية والكيمياحياتية فضلا عن استخدام تقنية API20E للتشخيص التا كيدي لهذه العزلات (1997.(Atlas, الاختبارات الكيمياحياتية: اختبار الاندول اختبار المثيل الاحمر اختبار الفوكس بروسكور.(Quinn et al., 1999) اختبار تحلل الجيلاتين اختبار المقاومة للمضادات الحيوية : اختبرت مقاومة العزلات الجرثومية للمضادات الحيوية المستخدمة في الدراسة الحالية عند تراكيزها النهاي ية مايكروغرام/مل وهي الكلورامفنيكول Cm 10 التتراسايكلين Tc 15 الامبسلين Amp 50 الارثرومايسين E 15 الجنتامايسين Gm 10 باستخدام طريقة الاطباق المتبعة من قبل.(asool et al., 2003) تحيد البلازميدات باستخدام درجة الحرارة : تم تلقيح 5 مل من وسط المرق المغذي بمستعمرة مفردة من جرثومة erratia marcescens الحاوية على بلازميدات المقاومة للمضادات الحيوية المستخدمة في الدراسة الحالية حضنت المزرعة الجرثومية لمدة 24 ساعة عند درجة حرارة 37 م. بعد انتهاء فترة التحضين اخذ 0.1 مل من المزرعة الجرثومية واضيف ا لى 10 مل من وسط المرق المغذي وحضن الوسط الغذاي ي الملقح عند درجة حرارة 45 م ولمدة 24 ساعة (2000 al., (Motallebi et لكل عزلة على حدا فضلا عن ذلك فقد اخذ 0.1 مل من المزرعة الجرثومية 5 مل واضيف ا لى 10 مل من وسط المرق المغذي وحضنت المزرعة عند درجة حرارة 37 م لمدة 24 ساعة لاستخدامه كنموذج سيطرة لملاحظة التحييد التلقاي ي. خففت المزارع الجرثومية بعد انتهاء فترة التحضين ا لى التخفيف السادس باستخدام المحلول الملحي الفسلجي ومن ثم نشر 0.1 مل من التخافيف الثلاثة الاخيرة على اطباق الاكار المغذي لاستخدامها كاطباق ري يسة حضنت الاطباق الري يسة عند درجة حرارة 37 م لمدة 24 ساعة. ثم نقل 100 مستعمرة من هذه الاطباق ا لى اطباق من الاكار المغذي الحاوي على المضادات الحيوية قيد الدراسة وحضنت الاطباق عند درجة حرارة 37 م لمدة 24 ساعة ثم سجلت النتاي ج في اليوم التالي.

4 194 بيداء غانم محمد تحييد البلازميدات باستخدام الاكردين البرتقالي : عوملت عزلات جرثومة. marcescens بالاكردين البرتقالي بحسب طريقة al.,1970) (Grindley et حيث لقح 5 مل من وسط المرق المغذي بمستعمرة مفردة من جرثومة. marcescens ثم حضنت عند درجة 37 م لمدة 7 ساعات بالحاضنة الهزازة بعدها لقح 10 مل من وسط المرق المغذي الحاوي على الاكردين البرتقالي بتركيز 40 مايكروغرام/مل باضافة 0.1 مل من المزرعة الجرثومية 5 مل ثم حضن الوسط الملقح عند درجة 37 م لمدة 24 ساعة بعد انتهاء فترة التحضين خففت المزارع الجرثومية ا لى التخفيف السادس باستخدام المحلول الملحي الفسلجي نشر 0.1 مل من كل تخفيف على اوساط من الاكار المغذي (الاطباق الري يسة) حضنت الاطباق الري يسة عند درجة 37 م لمدة 24 ساعة. بعدها تم نقل 100 مستعمرة ا لى اطباق من الاكار المغذي الحاوي على المضادات الحيوية قيد الدراسة وحضنت الاطباق عند درجة 37 م لمدة 24 ساعة ولوحظت النتاي ج. تحييد البلازميدات باستخدام اليوريا اتبعت طريقة (1970,. al (Tomoeda et اذ لقح 5 مل من وسط المرق المغذي بمستعمرة من جرثومة. marcescens وحضن عند درجة 37 م لمدة 24 ساعة. اخذ 0.1 مل من المزرعة الجرثومية واضيف ا لى 5 مل من وسط المرق المغذي الحاوي على 100 مايكروغرام/مل من اليوريا حضن الوسط بدرجة 37 م لمدة 24 ساعة بعد انتهاء فترة التحضين خففت المزارع الجرثومية الى التخفيف السادس باستخدام المحلول الملحي الفسلجي ومن ثم نشر 0.1 مل من التخافيف الثلاثة الاخيرة على اوساط من الاكار المغذي لاستخدامها كاطباق ري يسة وحضنت بدرجة 37 م لمدة 24 ساعة تم نقل 100 مستعمرة من هذه الاطباق ا لى اطباق من الاكار المغذي الحاوي على المضادات الحيوية قيد الدراسة وحضنت عند درجة 37 م لمدة 24 ساعة وقري ت النتاي ج. النتاي ج والمناقشة تشخيص العزلات الجرثومية: اظهرت نتاي ج التشخيص با ن الجرثومة عصوية سالبة الصبغة لكرام ذات مستعمرات بعضها حمراء والبعض الاخر برتقالي لانتاجها الصبغات عند نموها على وسط اكار الماكونكي اذ ان الجرثومة غير مخمرة لسكر اللاكتوز واظهرت نفس الالوان عند نموها على وسط الاكار المغذي كما اثبتت جميع الاختبارات الكيماحياتية واختبار API20E عاي دية العزلات قيد الدراسة ا لى النوع erratia. marcescens

5 195 تحييد المحتوى البلازميدي في جرثومة مقاومة المضادات الحيوية: تم اجراء فحص الحساسية للعزلات الجرثومية قيد الدراسة لعدد من المضادات الحيوية ويوضح الجدول (1) نتاي ج هذا الفحص. الجدول 1: يبين مقاومة عزلات erratia marcescens للمضادات الحيوية المستخدمة. مقاومة الجراثيم للمضادات الحيوية عند تراكيزها النهاي ية (مايكروغرام/مل) G 10 E 15 Amp 50 Tc 15 Cm 10 رقم العزلة : مقاومة للمضاد الحيوي. : حساسة للمضاد الحيوي. يتضح من الجدول (1) اختلاف العزلات الجرثومية في الدراسة الحالية في مقاومتها للمضادات الحيوية قيد الدراسة ولكن جميعها كانت مقاومة للمضادين الامبسلين والجنتامايسين. ولم يحدث تحييد تلقاي ي للمضادات الحيوية في العزلات المدروسة في البحث الحالي. التحييد باستخدام الحرارة: تم تنمية العزلات الجرثومية في درجة حرارة 37 م ولم يحدث تحييد تلقاي ي فضلا عن عدم حدوث تحييد عند درجة 42 م في حين كان للحرارة وبدرجة اعلى تا ثيرا كبيرا على البلازميدات الحاملة للمورثات المسو ولة عن مقاومة المضادات الحيوية المستخدمة بحيث فقدت معظم العزلات الجرثومية مقاومتها للمضادات الحيوية وعند درجة 45 م وكما موضح في الجدول (2). كما اظهرت العزلات الجرثومية المدروسة عند درجة 47 م حساسية لجميع المضادات الحيوية قيد الدراسة.

6 196 بيداء غانم محمد الجدول 2: يبين ازالة المقاومة للمضادات الحيوية في جرثومة erratia marcescens باستخدام درجة حرارة 45 م. النسبة المي وية لتحييد البلازميدات الحاملة للمورثات المسو ولة عن مقاومة المضادات الحيوية عند تراكيزها النهاي ية (مايكروغرام/مل) باستخدام درجة حرارة 45 م. رقم العزلة G 10 E 15 Amp 50 Tc 15 Cm : مقاومة للمضاد الحيوي. : حساسة للمضاد الحيوي. * : الارقام تشير ا لى النسبة المي وية للتحييد. نلاحظ من الجدول (2) ان استخدام درجة الحرارة كمحيد لم يتمكن من احداث تحييد لمورثات المقاومة للارثرومايسين وجاء هذا متفقا مع (2002 (Mustafa, بدراستها لتا ثير بعض العوامل الفيزياوية والكيمياوية لتحييد بلازميدات المقاومة في جرثومة Proteus mirabilis وقد يعزى سبب ذلك ا لى ان المورثات المسو ولة عن مقاومة هذا المضاد واقعة على نوع اخر من البلازميدات. ويلاحظ من الجدول حدوث تحييد في العزلات الجرثومية للمضاد الحيوي Cm و Tc و Amp و G وتا تي هذه النتيجة متفقة مع نتيجة الباحثة (حامد 2001) التي اوضحت بها ا لى ان استخدام درجة الحرارة اكثر من 37 م كمحيد ادى ا لى تحييد لمقاومة Cm و Tc و Amp في عدد من عزلات جرثومة.taph. aureus ان حدوث التحييد لمقاومة المضادات الحيوية المستخدمة عند درجة حرارة 45 م قد يعود ا لى ان تضاعف بلازميدات الحاملة لمورثات مقاومة المضادات الحيوية هذه يكون حساسا للحرارة وقد تعزى الحساسية للحرارة ا لى بعض الميكانيكيات المحتملة مثل فقدان بعض التفاعلات منها Protein-Protein ا و DNA- Protein ا و فقدان ارتباطات مختلفة لمستقبلات البروتينات خلال هذا المدى الحراري والذي يقود ا لى تثبيط انتقال الجين ا و عدم استقراره (2000 al.,.(herburne et التحييد باستخدام الاكردين البرتقالي: تم الحصول على جراثيم محيدة عند التركيز في الجدول (3). 40 مايكروغرام/مل من الاكردين البرتقالي وكما مبين

7 197 تحييد المحتوى البلازميدي في جرثومة الجدول 3: ازالة المقاومة للمضادات الحيوية في جرثومة erratia marcescens باستخدام الاكردين البرتقالي عند تركيز 40 مايكروغرام/مل. النسبة المي وية لتحييد البلازميدات الحاملة للمورثات المسو ولة عن مقاومة المضادات الحيوية عند تراكيزها النهاي ية (مايكروغرام/مل) باستخدام الاكردين البرتقالي. رقم العزلة G 10 E 15 Amp 50 Tc 15 Cm : مقاومة للمضاد الحيوي. : حساسة للمضاد الحيوي. * : الارقام تشير ا لى النسبة المي وية للتحييد. ومن ملاحظة نتاي ج الجدول (3) يتضح انه لا يوجد تحييد للمضاد الحيوي ارثرومايسين باستخدام الاكردين البرتقالي وتتفق هذه النتيجة مع النتيجة التي توصلت اليها (2002 (Mustafa, ويلاحظ وجود تحييد للمضادات الحيوية الاخرى المستخدمة في الدراسة الحالية باستخدام الاكردين البرتقالي اذ لوحظ فقدان المقاومة لاكثر من مضاد حيوي واحد للسلالات المدروسة وتتفق هذه النتيجة مع نتيجة erratia والتي اشار فيها ا لى فقدان المقاومة لاكثر من مضاد حيوي واحد في (Traub et al., (1976 marcescens المعزولة من حالات عدوى المستشفيات. ان التحييد الذي ظهر في بعض العزلات الجرثومية قيد الدراسة لمقاومة عدد من المضادات الحيوية قد يعود ا لى عدد من العوامل منها ما يتعلق بالخلية الجرثومية نفسها وبنفاذية الغشاء الخلوي فيها لمادة الاكردين البرتقالي وتمكن هذه المادة من ايقاف تضاعف البلازميدات الحاملة المقاومة للمضادات الحيوية ومنها ما يتعلق بالحالة التي يوجد بها ال DNA البلازميدي وعدد نسخه (1977 (King, وقد يعزى الاختلاف في النسب المي وية للتحييد في العزلات الخمسة قيد الدراسة الى اختلاف مصدر العينة اذان العينات كانت من حالات انتان دموي ولكن من اشخاص مختلفين وباعمار مختلفة. التحييد باستخدام اليوريا: تم الحصول على عدد قليل من السلالات الجرثومية المحيدة باستخدام اليوريا كعامل محيد لجراثيم erratia marcescens قيد الدراسة وكما موضح في الجدول (4).

8 198 بيداء غانم محمد الجدول 4: يبين ازالة المقاومة للمضادات الحيوية في جرثومة erratia marcescens باستخدام مادة اليوريا. النسبة المي وية لتحييد البلازميدات الحاملة للمورثات المسو ولة عن مقاومة المضادات الحيوية عند تراكيزها النهاي ية (مايكروغرام/مل) باستخدام اليوريا. رقم العزلة G 10 E 15 Amp 50 Tc 15 Cm يتضح من الجدول (4) عدم حدوث تحييد للمضاد الحيوي الكلورامفنيكول والامبسلين باستخدام اليوريا كعامل محيد وجاءت هذه النتيجة متفقة مع (2002 (Mustafa, في ان سلالات.P mirabilis المعزولة لم تظهر تحييد بمورثات المقاومة للمضاد الحيوي الامبسلين ولكنها اختلفت عن دراسة (2002, (Mustafa بحدوث تحييد بمورثات المقاومة للمضاد الحيوي ارثرومايسين فضلا عن حدوث تحييد في المضادات الحيوية التتراسايكلين والجنتامايسين. ان ا لية التحييد بواسطة اليوريا ربما تعود ا لى حدوث تغيير في فعالية الانزيمات المسو ولة عن تضاعف ال DNA وبالتالي توقف البلازميدات عن تضاعفها وهذه الا لية ربما تعتمد على كون اليوريا مادة مغيرة لطبيعة البروتين ا و ربما تعتمد على حدوث الطفرة المو دية ا لى تكوين انزم غير فعال ) 1970 al.,.(tomoeda et عند مقارنة العوامل المستخدمة لعملية التحييد للجرثومة قيد الدراسة نلاحظ ان مادة الاكردين البرتقالي اكثر فعالية في احداث التحييد من العوامل الاخرى وهذا ما اثبتته معظم الدراسات (حامد.(2001 المصادر العربية حامد نوار طلال ازالة مقاومة الجرثومة taphylococcus aureus المعزولة من حالات مرضية مختلفة في الانسان للمضادات الحيوية باستخدام مواد كيمياوية وعوامل فيزياوية. رسالة ماجستير جامعة الموصل. المصادر الا جنبية Atlas,.M., Handbook of Microbiological Media, 2 nd ed., Parks, L.C. Company, CC Press. Goullet, P. and Pieard, B., An epidemiological study of erratia marcescens isolates from nosocomial infections by enzyme electrophoresis. J. Med. Microbiol., Vol.46, pp

9 199 تحييد المحتوى البلازميدي في جرثومة Grindley, J.N., Grindey, N.D.F. and Anderson, E.., Acridine treatment of F + and Hfr strains of Escherichia coli K12 carrying a neomycin kanamycin resistance determinant. Genet. es. Camb., Vol.15, pp John, F.J. and McNeill, F.W tudy of erratia marcescens containing aplasmid coding for gentamicin resistance in nosocomal infection. J. Infect Dis., Vol.143, pp King,.C., Handbook of Genetics: Bacteria, Bacteriophages and Fungi. Vol. 1, Plenum Press, London. Mickelsen, P.A., Plorde, J.J., Gordon, K.P., Hargiss, C., MuClure, J., choenknecht, F.D., Condie, F., Tenover, F.C. and Tompkins, L.., Instability of antibiotics resistance in a strain of taphylococcus epidermidis isolated from an outbreak of prosthetic valve endocarditis. J. Infect. Dis., Vol.152, pp Microbiology.Mosby publishing company, UA, pp.209. Motallebi, M., Zamani, M.. and affar, B., erological and biochemical characteristics virulence plasmid of Yersinia enterocolitica isolates from chicken in the Islamic epublic of Iran. Eastern Mediterranean Health Journal, Vol.6, pp Mustafa, D.N., Curing of plasmid DNA content in bacteria Proteus mirabilis isolated from various clinical cases in human by using chemical substances and physical agents. M.c. Thesis, Univ. Mosul, Iraq. Queenan, A.M., Viera, C.T., Gold, H.., Carmeli, Y., Eliopoulos, G.M., Moellering,.C., Quinn, P.J., Medeiros, A.A. and Bush, K., ME type carbapenem hydrolyzing class A β-lactamases from geographically divers erratia marcescens strains. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, Vol.44, pp Quinn, P.J., Carter, M.E., Marky, B. and Carter, G..., Clinical veterinary Microbiology, Mosby Publishing Company, UA, pp.209. asool,.a., Ahmad, A., Khan,. and Wahab, A., Plasmid borne antibiotic resistance factors among indigenous Klebsiella. Pak. J. Bot., Vol.35, pp ichmond, M.H., ome environmental consequences of the use of antibiotics, or what goes up must come down. J. Appl. Bacteriol., Vol.35, pp herburne, C.K., Lawley, T.D., Gilmour, M.W., Blattner, F.., Burland, V., Grotbeck, E., ose, D.J. and Taylor, D.F., The complete DNA sequence and analysis of 27, a large IncHI plasmid from almonella typhi that is temperature sensitive for transfer. Nucleic Acid esearch, Vol.28, pp Tomoeda, M., Kokubu, M., Nabata, H. and Minamikawa, M., Elimination of sex factor in Escherichia coli by urea. J. Bacteriol., Vol.104, pp Traub, W.H., Kleber, I., Puhler, A. and Burkardt, H.J., Characterization of a nosocomially significant, multiple drug resistant strain of erratia marcerscens. Chemotherapy, Vol.22, pp