ا ا ي casei L57 الخلاصة رباب عم ارن جامعة بابل / كلیة العلوم زه ارء محمد عبد علي تم د ارسة تاثیر ارشح بكتریا المعامل بالح اررة (٨٠ م) وغیر المعامل وبینت النتاي ج تباین تاثیر انواع بكتریا كذلك.H pylori على البكتریا الممرضة ضد بكتریا تم د ارسة قابلیة التعزیز الحیوي لبكتریا casei L57 اظهرت النتاي ج قدرة البكتریا على تثبیط الاصابة ببكتریا.H pylori و شفاء الانسجة المتضررة و معالجة القرحة المعدیة. Abstract The effects of bacterial supernatant of treated with 80ºC and without were studied and the results showed variable effects on pathogenic bacteria H. pylori. The probiotic study of casei L 57 against was done. The result appeared that L. casei have ability to inhibit H. pylori infection and healing the damaged tissue and treated or reduced peptic ulcer. المقدمة تمیزت بكتریا ال با همیتها الطبیة اذ وجد انها تلعب دو ار مهما في تعزیز صحة الانسان فقد اجریت العدید من البحوث في هذا المجال ودرس تا ثیر انواعها المختلفة على عدد من الاخماج التي تسببها البكتریا كذلك بعض الطفیلیات فضلا عن تا ثیرها على الاو ارم السرطانیة وتحفیزها للمناعة. بین العالم ان البكتریا تقوم بحرف التوازن البكتیري نحو الاتجاة المفید للانسان Kiani Bifidobacterium المتواجدة بصورة طبیعیة في تمتلك صفة المعزز الحیوي أمعاء الا شخاص الا صحاء. (Probiotic) الهضم و اضط اربات الجهاز الهضمي والمصابین بقرحة المعدة هي بكتریا حلزونیة سالبة لصبغة غ ارم) اذ وجد مثل بكتریا ال وال تم الاستفادة من كون ال اذ استعملت في علاج المرضى المصابین بسوء )Peptic ulcer Sgouras المصاحب لوجود بكتریا اخت ازل بكتریا H. pylori اذ لاحظوا اخت ازل نسبة وجود بكتریا H. pylori في المعدة مقارنة بمجموعة السیطرة غیر المعاملة وفي د ارسة اخرى استنتج Fujimura وجماعته (٢٠٠٦) ان بكتریا H. pylori تكبح نمو L. gasseri OLI2716 في المعدة من خلال تناول اللبن الحاوي علیها ولها دور في تقلیل حدة الاثار الجانبیة للادویة المستعملة في العلاج. اظهرت نتاي ج د ارسة عن بكتریا L. reuteri ATCC55730 المعزولة من البشر ان لها القدرة على اخت ارق الطبقة المخاطیة للجهاز الهضمي والنمو وبالتالي تنافس بكتریا.H pylori سطح الخلایا الطلاي یة للمعدة وتقلل الاثار الجانبیة الناتجة عن العلاج بالادویة ایضا (2008. یهدف البحث د ارسة تا ثیر بكتریا بالتعزیز الحیوي. المواد وط اري ق العمل التضاد البكتیري وتمنعها من اللاتصاق على (Francavilla et al. على البكتریا الممرضة H. pylori Antagonism التضاد بین ١- ارشح العصیات اللبنیة غیر المعامل بالح اررة والبكتریا الممرضة اجري التضاد بین بكتریا العصویات اللبنیة الحیة الفتیة وpylori Helicobacter حسب مایلي ودورها ٢٧٠١
م Journal of Babylon University/Pure and Applied Sciences/ No.(8)/ Vol.(21): 2013.١.٢ زرعت بكتریا العصیات اللبنیة في وسط ال زرعت بكتریا الاختبار على وسط الاكار المغذي الاطباق لمدة ٣٠ دقیقة. MRS الساي ل وحضنت لمدة ١٨ ساعة بدرجة ٣٧ م. (Nutrient agar) بواسطة ال Cotton swab وتركت.٣.٤.٥ تم عمل حفر بواسطة الثاقب الفلیني (قطر الحفرة ٥ ملم). وضع 50 l من ارشح بكتریا العصیات اللبنیة في الحفر. حضنت الاطباق بدرجة ح اررة ٣٧ م لمدة ٢٤ ساعة بعدها تم ملاحظة وجود او عدم وجود مناطق خالیة من نمو البكتریا الممرضة حول الحفر الحاویة على ارشح بكتریا العصیات اللبنیة.(Salih.,2003 ) -٢ التضاد بین ارشح بكتریا العصیات اللبنیة المعاملة بالح اررة و البكتریا الممرضة تم اج ارء هذه التجربة حسب الخطوات التالیة ( لمدة ساعة ثم اجري لها طرد ١) تم معاملة العصیات اللبنیة الفتیة المزروعة في الوسط الساي ل بالح اررة (٨٠ مركزي بسرعة (٦٠٠٠ دورة/ الدقیقة) ثم اخذ ال ارشح. ٢) زرعت بكتریا الاختبار على وسط الاكار المغذي ) agar ( Nutrient بواسطة ال Cotton swab وتركت الاطباق لمدة ٣٠ دقیقة. ٣) تم عمل حفر بواسطة الثاقب الفلیني (قطر الحفرة ٥ ملم). (٤ وضع 50 l من ارشح بكتریا العصیات اللبنیة المعاملة بالح اررة في الحفر. ٥) حضنت الاطباق بدرجة ح اررة ٣٧ م لمدة ٢٤ ساعة بعدها تم ملاحظة وجود او عدم وجود مناطق خالیة من نمو البكتریا الممرضة حول الحفر الحاویة على ارشح بكتریا العصیات اللبنیة المعاملة بالح اررة التعزیز الحیوي Probiotic.(Salih.,2003 تم اج ارء هذه التجربة باستخدام الفي ارن المختبریة البیضاء بعمر سبعة اسابیع ومعدل وزنها ٢٣ غم. صممت التجربة بتوزیع ٣٠ فا ر على ٥ مجامیع شملت كل مجموعة ٦ في ارن. اعطیت الحیوانات ٣ جرع اسبوعیا كما مبین في الجدول ادناه اذ تم تجویع وتعطیش كافة المجامیع لمدة ١٨ ساعة ثم اعطاء جمیع الحیوانات ٢٥٠ مایكرولیتر من محلول بیكاربونات الصودیوم بتركیز (Salih.,2003 ٠.١ مولاري ) نصف ساعة تم اعطاء المجموعة الاولى : ١٠٠ مایكرولیتر من دارئ الفوسفات. عن طریق الفم وخلال المجموعة الثانیة و الثالثة: تم اعطاي ها ١٠٠ مایكرولیتر من عالق بكتریا ال casei في دارئ الفوسفات. المجموعة ال اربعة والخامسة: تم اعطاي ها ١٠٠ مایكرولیتر من عالق بكتریا ال Helicobacter pylori في دارئ الفوسفات. بعد ثلاثة اسابیع تم اعطاء المجموعة الثانیة في دارئ الفوسفات casei في دارئ الفوسفات..بینما تم اعطاء المجموعة ال اربعة ١٠٠ مایكرولیتر من عالق بكتریا ال ١٠٠ مایكرولیتر من عالق بكتریا ال بعد كل ثلاث جرع تم تشریح حیوان من كل مجموعة واخذ اعضاء الجهاز الهضمي ) المعدة الامعاء الدقیقة والامعاء الغلیظة ( اذ اخذ جزء صغیر من كل عضو ووضع في وسط ال RUT واخذ جزء اخر وتم استعماله لعزل البكتریا منه ووضع الجزء الباقي في فورمالین ١٠% ثم تم تحضیر مقاطع نسیجیة وتصبیغ الانسجة وملاحظة التغی ارت الحاصلة في انسجة مجامیع الاختبار (Sgouras et al.,.2004) ٢٧٠٢
جدول (١) طریقة التجریع للحیوانات المستعملة في التجربة. ٦ ٥ المجامیع نوع المواد المجرعه الاسابیع ٤ ٣ ٢ ١ ٢٥٠ مایكرولیتر بیكاربونات الصودیوم بتركیز ٠.١ مولاري ١٠٠ مایكرولیتر من دارئ الفوسفات الاولى (سیطره) ٢٥٠ مایكرولیتر بیكاربونات الصودیوم بتركیز ٠.١ مولاري الثانیه ١٠٠ مایكرولیتر من دارئ الفوسفات ٢٥٠ مایكرولیتر بیكاربونات الصودیوم بتركیز ٠.١ مولاري الثالثه ١٠٠ مایكرولیتر من دارئ الفوسفات ٢٥٠ مایكرولیتر بیكاربونات الصودیوم بتركیز ٠.١ مولاري ال اربعه ١٠٠ مایكرولیتر من دارئ الفوسفات ٢٥٠ مایكرولیتر بیكاربونات الصودیوم بتركیز ٠.١ مولاري الخامسه ١٠٠ مایكرولیتر من دارئ الفوسفات : تم اعطاء المادة بالتركیز المذكور. : X لم یتم اعطاء الحیوانات هذه المادة ٢٧٠٣
م Journal of Babylon University/Pure and Applied Sciences/ No.(8)/ Vol.(21): 2013 ٣-٢-١٠- تحضیر المقاطع النسیجیة وتصبیغها تحضیر المقاطع النسیجیة التثبیت :Fiation تغمر الانسجة (المعدة والامعاء الدقیقة والامعاء الغلیظة) بعد غسلها بمحلول الملح الفسلجي بالفورمالین بتركیز (١٠%). ا ازلة الماء Dehydration: : مررت الانسجة بسلسلة من تخافیف الكحولات ) ٧٠% لمدة لیلة كاملة ٩٠% لمدة ٢٠ دقیقة ثم ١٠٠%) لمدة ٢٠ دقیقة. الترویق :Clearing تنقل الانسجة الى ال ازیلین لمدة ١٥ دقیقة. توضع المقاطع بعدها في سلسلة تخافیف من الكحولات التنازلیة (١٠٠%- ٩٠%- الى ٥٠%). التحمیل : Impregnation وضعت الانسجة بعد اخ ارجها من ال ازیلین في خلیط من ال ازیلین وشمع البا ارفین.(١:١) الطمر : Embedding تطمر الانسجة في شمع البا ارفین الذاي ب (٥٦ على الانسجة. ( لغرض عمل مكعبات الشمع الحاوي التقطیع : Cutting تقطع مكعبات الشمع بعد تشذیبها الى مقاطع بسمك 5 m وتوضع على ش اري ح زجاجیة نظیفة (Salih.,2003) التصبیغ Staining تم ا ازلة الشمع من المقاطع النسیجیة بوضعها في ال ازیلین لمدة خمس دقاي ق. امررت المقاطع النسیجیة في سلسلة من الكحولات (١٠٠%- ٩٠%- الى ٥٠%). وضعت المقاطع بصبغة الهیماتوكسلین لمده ٥ دقاي ق بعدها تغسل بماء عادي لمده ٥ دقاي ق او اقل حتى یصبح لون المقاطع ازرق. تم نقل المقاطع الى كحول محمض ١% (١% HCl و ٧٠% كحول) لمدة ٥-١٠ ثواني ثم تغسل لمدة ٥ دقاي ق او اقل حتى یصبح لون المقاطع ازرق. صبغت المقاطع بصبغة الایوسین (١%) لمدة ١٠ دقاي ق ثم تغسل بماء الحنفیة لمدة (١-٥) دقاي ق. تم ا ازلة الماء ال ازي د بالكحول ثم ثبتت المقاطع النسیجیة بال (Salih.,2003) DPX تم فحص المقاطع النسیجیة وملاحظة التغی ارت الحاصلة فیها ثم تم تصویرها النتاي ج والمناقشة التضاد البكتیري :Antagonisim تم اختبار تا ثیر بكتریا ال المعزولة من المصادر المختلفة على البكتریا الممرضة. اظهرت النتاي ج با ن ارشح البكتریا غیر المعامل بالح اررة وال ارشح المعامل بالح اررة بدرجة ٨٠ م لمدة ساعة الحاوي على منتجات البكتریا مثل البكتریوسینات (هي بروتینات مقاومة للح اررة وقاتلة لانواع البكتریا غیر المنتجة لها والقریبة من الناحیة التصنیفیة ( ومواد الایض الثانوي المقاومة للح اررة قد تباین في تثبیط نمو البكتریا الممرضة المستعملة في التجربة (شكل ١) وجد كل من Veckman وجماعتة (٢٠٠٤) با ن ارشح بكتریا حامض اللاكتیك غیر المعامل بالح اررة یثبط نمو بكتریا Streptococcus (probiotic) من هذا نستنتج با ن تناول الالبان او الاغذیة الحاویة على البكتریة المعززه للصحة. pyogens له اهمیة في تقلیل خطر الالتهابات والاخماج الناتجة عن هذه الاجناس البكتیریة الممرضة كما نستنتج با ن ٢٧٠٤
ج- ال ارشح المعامل بالح اررة كان اكثر كفاءة في تثبیط البكتریا الممرضة مقارنة مع ال ارشح غیر المعامل وذلك قد یعود الى احتمال تا ثر البكتریوسینات على انواع البكتریا الممرضة. قطر التثبیط (ملم) (١) شكل تاثیر ارشح البكتریا المعامل وغیر المعامل بالح اررة المعزولة من الفم والالبان والمهبل على بكتریا.H pylori - التعزیز الحیوي Probiotics تمتلك بكتریا ال قابلیة تثبیط بكتریا pylori).h) على النمو واصابة الانسجة كما ان لها القدرة على اعادة اصلاح الانسجة المتضررة التي تسببها بكتریا.H pylori تم اعطاء الفي ارن عالق بكتریا H. pylori لمدة ثلاثة اسابیع لغرض اصابتها بقرحة المعدة وبعد تشریح الفي ارن لوحظ ان امعاء الفي ارن المعاملة بالبكتریا قد انتفخت بینما بقیت امعاء حیوانات السیطرة وكذلك حیوانات المجموعة الثالثة طبیعیة شكل یلاحظ في الشكل( 2 - أ) بینما یلاحظ في (2) ب) (٢- اذ ان كل من الامعاء الدقیقة المشار الیها بالسهم و القولون ذات حجم وشكل طبیعیان ان الامعاء الدقیقة والقولون قد انتفخا وهذه احدى اع ارض الاصابة ببكتریا H. pylori, في حین الشكل( ٢ ( فیوضح عودة الحجم والشكل الطبیعي لهذه الاعضاء بعد المعالجة ببكتریا اما على المستوى النسیجي فقد اظهرت النتاي ج ان اعطاء عالق بكتریا ال.H pylori للفي ارن ادى الى حصول فرط في نمو الخلایا المبطنة للاعضاء ب - الشكل (٣ (المعدة و الامعاء الدقیقة و القولون) كما مبین في ( التي تمثل مقطع نسیجي مستعرض ما خوذ من فا ر بعد اعطاي ه عشر جرع من عالق بكتریا.H pylori لمدة ثلاثة اسابیع) حصول زیادة مفرطة في الخلایا الطلاي یة المبطنة للمعدة و وجود عدد من الخلایا الالتهابیة كبیرة ( Inflammatory cells) و الشكل - ب) (٤- ج) و (٤ یكون النسیج غیر طبیعي اذ ان الطبقة المخاطیة في القولون والزغابات في القولون قد حصل نمو غیر طبیعي في خلایاها فا زداد حجمها بصورة یبین الشكل (٤- د). یظهر في الشكلین (٥- ب)و یبین عودة النسیج في منطقة القولون الى شكلة الطبیعي بعد العلاج ببكتریا ال (٥- ج) نمو خلایا الزغابات بصورة غیر طبیعیة مما ادى الى زیادة حجمها كما یلاحظ حدوث فقدان في طبقة الخلایا الطلاي یة السطحیة المحیطة بنسیج الامعاء الدقیقة الشكل (٥- د) في نسیج الامعاء الدقیقة عودة النسیج الى الحالة الطبیعیة الحصول علیها مطابقة لما وجده عدد من الباحثین اذ وجد (بعد المعالجة). Fujimura وجماعتة (٢٠٠٦) تكبح نمو بكتریاpylori.H بینما یوضح ان النتاي ج التي تم ان بكتریا التي تستعمر المعدة والامعاء والقولون. كما استنتج Wang ٢٧٠٥
Journal of Babylon University/Pure and Applied Sciences/ No.(8)/ Vol.(21): 2013 وجماعتة (٢٠٠٤) ان الاستهلاك المنتظم لللبن الحاوي على بكتریا الاصابة ببكتریا. H.pylori توصل الباحث یؤدي الى تقلیل خطر.L وجماعتة (٢٠٠٤) ان الفي ارن المعاملة ببكتریا Sgouras casei اظهرت انخفاض في مستوى استیطان ال H.pylori في الجهاز الهضمي مقارنة مع مجموعة السیطرة التي لم تعامل بال. من هذا یتضح ان تناول الالبان بصورة منتظمة یساعد على تقلیل خطر الاصابة بام ارض الجهاز الهضمي وعسر الهضم وبالتالي المحافظة على صحة الجهاز الهضمي. ب أ القولون ج الامعاء الدقیقة شكل (٢) شكل الامعاء في مجموعة السیطرة و بعد معاملة الفي ران بكل من بكتریا H.pylori. (أ ( و مجموعة السیطرة. (ب) بعد المعاملة بال H.pylori لمدة ثلاث اسابیع. (ج) بعد المعاملة بال لمدة ثلاث اسابیع. ٢٧٠٦
أ( أ ب خلایا التھابیة ج ( شكل (٣) یوضح التغی ارت النسیجیة في المعدة مقطع مستعرض في معدة ما خوذة من مجموعة حیوانات السیطرة. (ب) مقطع مستعرض في معدة فا ر تم اعطاي ه عالق بكتریا ال.H pylori معدة فا ر تم اعطاي ه عالق بكتریا ال الحیة لمدة ثلاث اسابیع. صورت المقاطع على القوة الخلایا المؤشرة بالسهم هي الخلایا الالتهابیة.(ج) مقطع مستعرض في H. pylori ثم بعد ثلاثة اسابیع تم معالجتة با عطاءعالق بكتریا ال تم استعمال صبغة الایوسین هیماتوكسلسن في التصبیغ. وقد ٢٧٠٧
Journal of Babylon University/Pure and Applied Sciences/ No.(8)/ Vol.(21): 2013 أ ب ج د شكل (٤) مقاطع نسیجیة لمنطقة القولون. ) أ) مقطع مستعرض ما خوذ من مجموعة حیوانات السیطرة. (ب وج) مقطع مستعرض في قولون فا ر تم اعطاي ه عالق بكتریا ال.H pylori قولون فا ر تم اعطاي ه عالق بكتریا ال یلاحظ الزیادة الكبیرة H. pylori الحیة. في الخلایا الالتهابیة. (ء) مقطع مستعرض في ثم بعد ثلاثة اسابیع تم معالجتة باعطاء عالق بكتریا ال تم تصبیغ المقاطع بصبغة الایوسین الهیماتوكسلین وصورت على القوة 10X ٢٧٠٨
أ ب ج د شكل (٥ ( مقاطع مستعرضة في الامعاء الدقیقة. ) أ) مقطع مستعرض ما خوذ من مجموعة حیوانات السیطرة. (ب وج) مقطع مستعرض في الامعاء الدقیقة لفا ر تم اعطاي ه عالق بكتریا ال.H pylori یلاحظ الزیادة الكبیرة الحاصلة في حجم الزغابات وكذلك زیادة الخلایا الالتهابیة وحصول تحطم في بعض الاماكن في الزغابة. (ء) مقطع مستعرض في الامعاء الدقیقة لفا ر تم اعطاي ه عالق بكتریا ال H. pylori الحیة یلاحظ رجوع ثم بعد ثلاثة اسابیع تم معالجتة باعطاء عالق بكتریا ال النسیج الى وضعة الطبیعي. تم تصبیغ المقاطع بصبغة الایوسین الهیماتوكسلین وصورت على القوة 10X ٢٧٠٩
Journal of Babylon University/Pure and Applied Sciences/ No.(8)/ Vol.(21): 2013 Reference Amin, M.; Jorfi, M.; Khosravi, A.D.; Samarbafzadeh, A.R. and Sheikh, F. (2009). Isolation and identification of casei and plantarum from plants by PCR and detection of their antibacterial activity. J. Bio. Sci. 9(8): 810-814. Anas, M.; Eddine, H.J. and Mebrouk, K. (2008). Antimicrobial activity of species isolated from Algerian raw Goat's milk against Staphylococcus aureus. world J. Dairy food Sci. 3(2): 39-49. Francavilla, R.; Lionetti, E.; Castellaneta, S.P.; Magista, A.M.; Maurogiovanni, G.; Bucci, N.; Canio, A.D.; Indrio, F.; Cavallo, L.; Ierardi, E. and Miniello, V. L. (2008). Inhibition of infection in humans by reuteri ATCC 55730 and effect on eradication therapy :A Pilot study. J. comp.helicobacter. 13: 127-134. Fujimura, S.; Kato, S.; Oda, M.; Miyahara, M.; Ito, Y. Kimura, K.; Kawamura, T.; Ohnuma, M.; Tateno, H. and Watanabe, A. (2006). Detection of gasseri OLL2716 strain administered with yogurt drink in gastric mucus layer in humans. Soci. Appl. Microbiol. 43: 578-581. Kiani, L. (2006). Bugs in our guts- not all bacteria are bad :How probiotics keep us healthy. CSA Discovery Guides. Salih, S.M. (2003). Serological study, Pathogenicity trial for preparing vaccine from locally isolated. Ph.D. thesis, University of Tikrit. Medical Microbiology. Iraq. Sgouras, D.; Maragkoudakis, P.; Petraki, K.; Martinez- Gonzalez, B.; Eriotou, E.; Michopoulos, S.; Kalantzopoulos, G.; Tsakalidou, E. and Mentis, A. (2004). In vitro and in vivo inhibition of by casei strain Shirota. Am. Soci. Microbiol. 70(1): 518-526. Tejada Simon, M.V.; Lee, J. H.; Ustunol, Z. and Pestka,J.J. (1999). Ingestion of yogurt containing acidophilus and Bifidobacterium to potentiate Immunoglobulin A responses to Cholera toin in mice. J. Dairy sci. 82: 649 660. Todorov, S.D. and Dicks, L.M.T. (2007). Bacteriocin production by pentosus ST712BZ isolate from boza. Brazil. J. Microbiol. 38: 166-172. Veckman, V.; Miettinen, M.; Pirhonen, J.; Siren, J.; Matikainen, S. and Julkunen, I. (2004). Streptococcus pyogenes and rhamnosus differentially induce maturation and production of Th1-type cytokines and chemokines in human monocyte-derived dendritic cells. J. Leukocyte Biology. 75: 1-8. Wang, T.T. and Lee, B. H. (1997). Plasmids in. Criti. Rev. Biotech. 17( 3): 227-272. ٢٧١٠