Molecular detection of Proteus mirabilis using PCR technique among urinary tract infection patients

النسخ

1 Iraqi Journal of Biotechnology, 2014,Vol.13, No.2, Molecular detection of Proteus mirabilis using PCR technique among urinary tract infection patients Munther Adnan 1 Ismail Hussein Aziz 2 Mahdi Saber Al-Deresawi 3 1 Msc student in Genetic Engineering and Biotechnology Institute / University of Baghdad 2 Genetic Engineering and Biotechnology Institute / University of Baghdad 3 Biology Department, College of Science, University of Wasit Abstract: The study included isolation and diagnosis of bacteria Proteus mirabilis from patients suffering from urinary tract infection (UTI) with different types (simple and complicated cases) and from clinical urinary tract infected patients. Isolated of bacteria from (UTI) infected patients and from patient urinary tract catheter which was used in complicated cases and from defective urinary tract patients. Three hundred and ten (310) samples from (UTI) patients in different hospitals of Baghdad and Al-Kut. From period 1/1/2013 to 1/8/2013. The results observe (218) positive isolates for bacteriological exam and by the biochemical tests and Api appear Proteus spp (17.88 %) and P. mirabilis ( 92.3%) but P. vulgaris(7.7) %. PCR by used specific primer (16SrRNA) for detected genus Proteus and to differentiate it from other enterobacteria used (UreR) primer to detect the genome which was controlled for urease enzyme production. The results of primer UreR observe 36 isolates were positive. Results of the Nitrogen bases sequence of the PCR technology of the samples in this study revealed consistency reaching up to 98 % with the Nitrogen bases sequence of the UreR gene present in the P. mirabilis strain of the WHO. This study presented high specificity and sensitivity for the diagnosis of P. mirabilis using the PCR technology which is cheaper and faster than the conventional methods currently used in the hospitals and laboratories. Key word: Proteus mirabilis, urinary, 16srRNA.

2 Iraqi Journal of Biotechnology 36 التشخيص الجزيئي لبكتيريا Proteus mirabilis باستخدام تقنية التفاعل السمسمي البممري بين المرضى المصابين بالتهاب المسالك البولية 1 منذر عدنان خمف 2 أسماعيل حسين عزيز 3 مهدي صبر لعيبي 1 طالب د ارسات عميا/ معيد اليندسة الو ارثية والتقنيات األحيائية /جامعة بغداد 2 معيد اليندسة الو ارثية والتقنيات األحيائية /جامعة بغداد 3 كمية العمو / جامعة واسط الخالصة: تضمنت ىذه الد ارسة عزؿ وتشخيص لبكتريا Proteus mirabilis مف مرضى يعانوف مف التيابات في المسالؾ البولية عمى مختمؼ انواعيا ( البسيطة والمعقدة( ومف انابيب القسطرة البولية التي تستخد في حاالت االلتيابات المعقدة والتشوىات الخمقية في اعضاء الجياز البولي.ت جمع )310( عينة أد ارر لمرضى يعانوف مف التيابات المسالؾ البولية مف مستشفيات مختمفة لمدينتي بغداد والكوت لممدة مف الى أظيرت النتائج وجود )218( عزلة كانت موجبة لمفحص البكتريولوجي,وعند اكماؿ تشخيص العزالت البكتيرية السالبة لصبغة ك ار بالطرؽ الكيموحيوية واستخدا انظمة Api التشخيصية أظيرت بكتريا. Proteus spp نسبة عزؿ )%17.88( وبمغت نسبة عزؿ ( P. mirabilis )%92,30 اما نسبة عزؿ P. vulgaris فكانت ( %7.7.) المتقمبات استخد تفاعؿ سمسمة البممرة )PCR( باستعماؿ بادئات نوعية (16SrRNA( )specific primer) لمكشؼ عف وجود جنس Proteus spp وتمييزىا عف البكتريا المعوية باقي بادئات أستخدا وكذلؾ urer وأظير تنتائج التشخيص الو ارثي بآستعماؿ بوادئ متخصصة لمجيف.)ureR( نوعية متخصصة الجينات وجود عف لمكشؼ الخاص بيذه الد ارسة عف وجود 36 عينة أعطت نتائج موجبة لعينات األد ارر كذلؾ سجمت نتائج د ارسة تسمسؿ القواعد النتروجينية لنواتج تقنية PCR لمعينات قيد الد ارسة تطابقا يصؿ الػػى )% 98( مع تسمسؿ القواعد النتروجينية لجيف urer الموجودة في عزلة P.mirabilis العائدة لمنظمة الصحة العالمية WHO المقدمة يعد التياب المسالؾ البولية مف المشاكؿ الصعبة الواسعة االنتشار في العال والذي يصاب بيا مالييف مف االشخاص سنويا وتعد النساء اكثر ميال مف الرجاؿ لالصابة بيذا المرض. إذ يأتي بالمرتبة الثانية بعد التيابات المسالؾ التنفسية اذ يتعرض الذكور واالناث لالصابة بيذا المرض والسيما وأنو يعد مف المسببات الرئيسة لوفاة االطفاؿ الرضع )1( تعد بكتريا P.mirabilis مف الكائنات المجيرية االنتيازية التابعة لمعائمة المعوية لما تسببو مف مشاكؿ صحية لالنساف و الحيواف عمى حد سواء) 2 (, اذ إنيا تسبب خمج الجياز اليضمي والجياز التناسمي و تأتي االىمية الطبية ليذه البكتريا بعد Escherichia coli بكتريا و بكتريا Klebsiella pneumonia لما تسببو مف مشاكؿ صحية و اصابات مرضية لمجياز التناسمي و الجياز اليضمي و االجيزة االخرى )3(. تسبب بكتريا البولية والسيما Proteus بصورة رئيسة خمج المسالؾ النوع P.mirabilis وعمى الرغ مف ذلؾ فانيا تأتي بعد بكتريا.E coli المسالؾ البولية في أحداث خمج )4(. تسبب ىذه البكتريا خمج المسالؾ البولية لممرضى ال ارقديف في المستشفيات و

3 Iraqi Journal of Biotechnology 37 المستخدميف لمقثط ارلبولي و لمدد طويمة و كذلؾ االشخاص الذيف يعانوف مف مشاكؿ وظيفية و تشريحية غير طبيعية لممسمؾ البولي )5(, وأف قدرة ىذه البكتريا عمى االستيطاف في المسمؾ البولي يعود الى أمكانية تخميؽ زوائد بروتينية تسمى الخمؿ تساعد الخاليا عمى االلتصاؽ بالخاليا الطالئية البولية و الطالئية الكموية )6( الض اروة Virulance factors ىي انتاج اليوريز.اف مف اى عوامؿ لبكتريا P.mirabilis urease ػ إنتاج الييمواليسيف Haemolysinػ القابمية عمى االلتصاؽ بالخاليا الطالئية ػ الحركة بشكؿ امواج ( االنثياؿ ) بواسطة االسواط Swarming ػ إنتاج Flagella البكتريوسيف المعروؼ بػProticine )7(. تيدؼ ىذه الد ارسة الى استخدا تقنية التفاعؿ المتسمسؿ الجؿ التحري عف اجناس المتقمبات المسببة اللتياب المسالؾ البولية. المواد وط ارئق العمل جمع العينات المرضية جمعت عينات اإلد ارر ) 310 عينة ) لممدة مف كانوف الثاني التيابات مف لمدينة قبؿ أب لغاية المسالؾ اطباء بغداد/ 2013 البولية مختصيف مدينة التخصصية, مستشفى حماية ومف الزى ارء مستشفى الطفؿ مستشفيات,المختب ارت مختمفة مف الذيف ومف مرضى ت يعانوف تشخيصي مستشفيات الطب )مستشفى بغداد التعميمية لمدينة التعميمي, مستشفى البتوؿ المتعمقةبالمريض استمارة في معقمةحج مف لموالدة( وسجمت العمروالجنس خاصة,وأستخد مف مسبقا مختمفة الج ارحات التعميمي,مستشفى لمدينة الطب(, 50 ممميمتروقدت الكوت )مستشفى الك ارمة التعميمي, المعمومات أوام ارض ليذاالغرض عينة أخذ أخرى قناني االد ارر الوسطي.زرعت مباشرة بعد أخذ العينة لغرض التشخيص )8( زرع األد اررCulture Urine زرعت عينات األد ارربطريقة التخطيط )باستخدا ناقؿ زرعي قياسي معق ) عمى الوسط األنمائي آكار الد والوسط التفريقي اكارماكونكي,حضنت األطباؽ في درجة 37 لمدة ساعة, بعدىا ت تشخيص المستعم ارت مظيريا اعتماداعمى الصفات الشكمية ليا,مف حيث شكؿ وحج ولوف تمؾ المستعم ارت, واختيرت العزالت التي اعطت ظاىرة األنثياؿ فضال" عمى ارئحة تشبو ارئحة السمؾ عمى وسط اكا ارلد, اماعمى وسط الماكونكي ت األعتماد عمى الموف الشاحب لممستعم ارت لكونياغيرمخمرة لسك ارلالكتوزfermenter, Non Lactose نقمت العزالت المختارة الى وسط أكارماكونكي جديد )9(. تشخيص العزالت التشخيص االولي شخصت العزالت مظيريا وكذلؾ كيموحيويا. إذ شخصت العزالت مبدئيا اعتمادا عمى الصفات الشكمية لممستعم ارت عمى وسط الماكونكي, ومالحظة ظاىرة األنثياؿ Swarming عمى وسط اكار الد. كذلؾ شخصت اعتمادا عمى الصفات الشكمية تحت المجير إذ استخدمت صبغة غ ار stain( )gram وفؽ محاليميا الوصؼ بالمصدر.)10( االختبا ارت الكيموحيوية اختبار حساسية العزالت البكتيرية لممضادات الحيوية اجري فحص الحساسية لممضادات الحيوية بطريقة صب اإلطباؽ باستعماؿ الوسط الزرعي أكارمولمر ىنتوف, وقد اختبر حساسية البكتيريا المشخصة اتجاه 11 نوعا مف المضادات الحيوية )11(.

4 Iraqi Journal of Biotechnology 38 التشخيص باستعمال نظام Api- 20E أجريت فحوصات كيموحيوية باستخدا نظا Api- 20E وذلؾ لغرض تشخيص البكتريا المعزولة عمى إنيا بكتريا المتقمبات. استخالص الحمض النووي DNA تمت عممية آستخالص الحمض النووي DNA مف الخاليا البكتيرية المعػمقة بمحموؿ مرؽ نقيع القمب والدماغ مف عينات االد ارر وحسب ما ورد في )12( بأستخدا عدة االستخالص المجيزة مف شركة.Geneaid البوادئ المستخدمة في تفاعل البممرة استخدمت بوادئ متخصصة لمكشؼ عف الجيف 16.ureR )13( وكذلؾ الجيف S rrna أوال : بادئ المتخصص بالجيف 16 S rrna البادئ التسلسل طول البادئ حجم التضخيم 101bp 26bp 24bp 5-GGAAACGGTGGCTAATACCGCATAAT-3-5-GGAAACGGTGGCTAATACCGCATAAT-3 Forward Reverse ثانيا بادئ المتخصص بالجين urer البادئ Forward التسلسل 5-GGTGAGATTTGTATTAATGG-3 bpطول البادئ 20 bp حجم التضخيم ATAATCTGGAAGATGACGAG-3 Reverse الترحيل الكهربائي )Electrophoresis ) أجري الترحيؿ الكيربائي لمتحري عف الدنا البكتيري بعد عممية اإلستخالص أو لمكشؼ عف ناتج تفاعؿ PCR ناتج اليال تفاعؿ DNA بوجود PCR %1 قياسي لتمييز حج حزمة عمى ىال اإلكاروز.حضر لمتحري عف الدنا البكتيري اإلستخالصو 2 %لمكشؼ عف ناتج تفاعؿ بعد عممية PCR عمى وفؽ ماذكره Sambrookوجماعتو )47( وذلؾ بإذابة 4 او 2 غ ار مف األكاروز في 100 مميمتر مف محػػموؿ دارىء المحضرمسػػبقا, TBE (1x) 2 سػخف األكاروز الى درجة الغمياف لحيف إكماؿ ذوباف اليال بعدىا ترؾ ليػبرد بدرجػػة 50 مئوية ث أضيؼ مقدار مايكروليترمف صػػبغة بروميد االثيػػديػو بتركػػيز نيائي 0.5 مايكػػروغ ار/مميمتر. صػػب ىال األكػػاروز بيدوء في الصػػفيحة لمنع حدوث فقاعات ىوائية وترؾ ليتصػػمب لمدة 30,TBE بحيث يغطي سػػطح اليػػال. النتائج أظيرت النتائج وجود ىذه البكتريا في مجموع دقيقة ممئ الحوض بدارئ 6< 54; كانت النتائج موزعة كاآلتي: ;54 أعطت عينة مف عينة موجبة لمزرع البكتريولوجي. و عينة )% :3.65 ( موجبة لمزرع البكتريولوجي, منيا نتيجة موجبة 449 عينة )%86.54( موجبة عند األطفاؿ و 435 عينة موجبة عند البالغيف );:.79 %(. مف بيف النتائج الموجبة الزرع كانت )% 4:.;;(6< حالة إصابة ببكتريا. Proteus, spp كاف منيا )%89.41( 55 حالة إصابة عند األطفاؿ و: 4 البالغيف )%76.8;( حالة إصابة عند اما توزيعيا حسب الجنس فكاف 48 )%6;.79( حالة إصابة عند الذكور و 57 حالة

5 Iraqi Journal of Biotechnology 39 إصابة عند اإلناث )%94.86( )جدوؿ رق- 4 (.اما بقية العزالت فكانت تعود ألجناس بكتيرية أخرى وت إىماليا. شػػكمت بكتريػػػا Proteus mirabilis فػػػي ىػػػذه الد ارسػػة النػػوع األكثػػر شػػيوعا إذ بمغػػت )69()5.63> %( عزلة مػف )>6( حالػة إصػابة ببكتريػا Proteus spp. مقارنػة بػالنوع. Pالػذي vulgaris كانػت نسػبة عزلو تبمغ ):.: %( شكؿ رق )1 (. جدول )1( توزيع بكتريا spp. Proteusحسب العمر و الجنس في المرضى المصابين بالتهاب المسالك البولية الجنس الذكور االناث المجموع % % العدد % العدد العدد العمر ; ; 9 أطفال اقل من 31 سنة 76.8; 4: ; < بالغين اكبر من 31 سنة 433 6< ; المجموع API20E وجاءت النتائج مكممة لنتائج الفحوصات الكيموحيوية. التشخيص الو ارثي استخالص الحامض النووي DNA استخمص الحامض النووي DNA مف عزالت بكتيريا.P mirabilis بآستعماؿ عدة اإلستخالص المجيزة مف شركة.Geneied نميت العزالت أوال عمى وسط أكار الماكونكي لتنشيط العزالت والحصوؿ عمى غ ازرة بالنمو ث لقح وسط مرؽ نقيع القمب والدماغ بيذه العزالت إذ تنمى العزالت الم ارد استخالص المحتوى الو ارثي منيا مدة 57 ساعة ويستعمؿ كػػوسط مغذ إلنواع البكتيريا جميعيا دوف شروط وكانت نتائج اإلستخالص جيدة. تشخيص األنواع التابعة لجنس spp. Proteus ت تشخيص >6 عزلو تابعة إلى جنس Proteus باالعتماد عمى االختبا ارت الكيموحيوية التي أشار ليا Collee وجماعتو )48(, كانت 69 عزلة عائدة لمنوع P.mirabilis وبنسبة عزؿ % 5.6> و 6 عزلة عائدة لمنوع.P vulgaris وبنسبة عزؿ ( :.: %( مف بيف مجموع البكتريا السالبة لمموف ك ار و المسببة لخمج المسالؾ البولية. أذ تميز النوع P.mirabilis بكونو سالب الختبار االندوؿ وغير مخمر لسكر المالتوز ومنتج لمػ Ornithine decarboxylase بينما النوع. Pتميز vulgaris بكونو موجب الختبار االندوؿ ومخمر لسكر المالتوز وغير منتج لمػ Ornithine decarboxylase نظام التشخيص 20E( Analytic )API Profile Index 20 Enterobacteriaceae لتأكيد التشخيص لعزالت P.mirabilis والكتماؿ االختبا ارت الكيموحيوية الميمة استخدمت نظا

6 Iraqi Journal of Biotechnology 40 استعممت خاليا البكتيريا المعمقة في محموؿ مرؽ نقيع القمب والدماغ المعزولة مف عينات األد ارر لمرضى مصابيف بألتيابات المسالؾ البولية وطردت مركزيا بسرعة عالية )8333 دورة بالدقيقة( لمدة 8 دقائؽ لترسيب خاليا البكتيريا وأستكممت بعدىا خطوات األستخالص وكانت نتائج االستخالص جيدة وبتركيز ونقاوة عالييف, أذ ت اروح تركيز الحمض النووي DNA بيف نانوغ ار/مايكرولتر ونقاوة تت اروح بيف 4.8- ;.4 اعتمادا عمى ق ارءة االمتصاص لألشعة فوؽ البنفسجية باستخدا جيازdrop.Nano أظيرت نتائج الترحيؿ وجود حز الحمض النووي )DNA( المستخمصة ذات حدة ووضوح عالييف مما يدؿ عمى التركيز والنقاوة العالييف ويبيف الشكؿ )1( حز الحامض النووي.DNA الشكل )1(: الترحيل الكهربائي لممحتوى الو ارثي المستخمص بآستعمال هالم األكاروز %3 )54 دقيقة 7 فولت\سم(. )مسار رقم الحامض النووي DNA المستخمص من عزالت البكتيريا( التشخيص بتقنية تفاعل السمسة المتعددة تعد طريقة تشخيص البكتيريا بواسطة تقنية PCR مف الطرؽ الميمة وذلؾ بسبب تضخي )DNA( المستخمص مف خاليا يكتيرية خالؿ ساعة وتعد ىذه الطريقة مف أسرع الطرؽ مقارنة بالطرؽ السابقة )49(. شخصت البكتيريا بواسطة تفاعؿ PCR ذلؾ بآستخدا بادئ الجيف 49sRNA وبادئ الجيف urer ويتكوف مزيج التفاعؿ ليما كما في الجدوليف) 6 5 ( إذ تت إضافة البادئ األمامي و البادئ العكسي وDNA و الماء المقطر الخالي مف االيونات الى الحفر الموجود في عدة AccuPower PCR Premix الحاوية عمى المكونات المبينة في الجدوؿ ( 4(.

7 Iraqi Journal of Biotechnology 41 جدول )2( مزيج التفاعل الخاص لتشخيص الجينrRNA 16S المكونات الحجم بالمايكرولتر 0.75 البادئ األمامي 0.75 البادئ العكسي 1.5 DNA 17 ماء مقطر خالي مف األيونات 20 الحجم النهائي جدول ( 3( مزيج التفاعل الخاص لتشخيص الجين. urer بالمايكرولتر الحجم المكونات 0.75 البادئ األمامي 0.75 البادئ العكسي 1.5 DNA 17 ماء مقطر خالي مف األيونات الحجم النهائي 20 جدول )4( محتويات عدةPremix AccuPower PCR المواد الحجم 1.5 µm MgCl µm dntp (datp, dgtp, dctp, dttp ) 1 U Taq DNA polymerase 30µM KCl 10 µm Tric-HCl (ph 9.0) ):4(. كما يستخد كجيف تفريقي ألنواع البكتيريا في الفحوصات السريرية الطبية ); 4 (.أجريت تفاعالت الكوثرة لعزالت sspproteus لتحديد جينات 16sRNAالمسؤوؿ عف تشخيص وتمييز جنس المتقمبات Proteus عف باقي البكتيريا المعوية. باستعماؿ بادئات نوعية تستيدؼ جينات 16sRNA بيدؼ التشخيص الدقيؽ لعزالت Proteus عمى ىذا التشخيص الو ارثي لبكتيريا sspproteus بواسطة الجين 16sRNA ىي تقنية متخصصة تمتمؾ حساسية عالية ويعتمد تشخيص كثير مف أجناس البكتيريا عمى الجيف 16sRNA ويستخد ىذا الجيف لمد ارسات التفريقية بيف أنواع البكتيريا باألضاقة الى المايتوكوندريا

8 Iraqi Journal of Biotechnology 42 ألجيف, والمجيزة مف قبؿ شركة Bioneer,.)Korea) ت تحديد الظروؼ المثمى لمتفاعؿ بعد إج ارء عدد مف التجارب لغرض الوصوؿ إلى الظروؼ المثمى جدوؿ )5( إذ لوحظ إف أفضؿ تركيز DNA template كاف 58 ng/ μl لذا اعتمد الدرجة 93 مئوية والتي أعطت أفضؿ النتائج في عدة تجارب وعند مقارنة حج ناتج التجارب مع DNA القياسي بالترحيؿ الكيربائي كاف الحج تقريبا )434,)bp الشكؿ- 5(. ضبطت الظروؼ المثمى لتنفيذ تقنية PCR لمجيف 16sRNA )الجدوؿ- 8 (. جدول )5( الظروف المثمى لتشخيص ألجين 16sRNA التسمسل المرحمة درجة الحرارة المئوية الوقت عدد الدورات 8 95 DNAمرحمة المسخ االولي دقائؽ دورة واحدة DNAمسخ ثانية 2 دورة 40 ثانية االلتحا 3 ثانية االستطالة 4 دورة واحدة دقائؽ مرحمة االستطالة النيائية 5 جدول )6( الظروف المثمى لتشخيص ألجين urer التسمسل المرحمة درجة الحرارة المئوية الوقت عدد الدورات DNA مرحمة المسخ األولي دورة واحدة دقائؽ DNAمسخ ثانية دقيقة دورة االلتحا 3 4 االستطالة ثانية مرحمة االستطالة النيائية دقائؽ دورة واحدة 500 bp 101 bp 400 bp 300 bp 200 bp 100 bp شكل )2( ترحيل كهربائي لناتج كوثرة لجينsRNA16 عمى هالم االكاروز بنسبة % 3.4 لمدة ساعة وبفرق جهد % 77 فولت

9 Iraqi Journal of Biotechnology 43 التشخيص الو ارثي لبكتيريا.P mirabilis بواسطة الجين urer يعد جيف البكتيريا urer جيف مي في عممية تشخيص ىذه.)8( أعتبر الباحث Zhang أف جيف )46( في تشخيص النوع urer وجماعتو جيف متخصص بشكؿ دقيؽ P. mirabilis وىو المسئوؿ عف انتاج أنزي اليوريز وىو موجود في النوع P. mirabilis ت التحري عف جينات urer والمسؤوؿ عف إف ارز اليوريز مف عزالت بكتريا والمعزولة مف حاالت التياب المسالؾ البولية ولمختمؼ األعمار, واستعمؿ بادئات نوعية مخصصة,بعد عدة تجارب ت تحديد أفضؿ تركيز وكاف بحدود 58 نانوغ ار / مايكرولتر. واستعممت الدرجات( ( مئوية حددت ىذه الظروؼ باالعتماد عمى أفضؿ النتائج التي ظيرت, وكاف أفضؿ وىج تحت األشعة فوؽ البنفسجية أفضؿ حز منفردة متخصصة لناتج التفاعؿ عند درجة الح اررة 58 مئوية, وت االعتماد عميو إلعطاء نتيجة موجبة بالنسبة لمكشؼ عف جينات,ureR وذلؾ مقارنة النتائج مع حج DNA القياسي بالترحيؿ الكيربائي إذ كاف مقارب لػ bp) ) 558 كما في الشكؿ )3(. شكل ( 3 ) ترحيل كهربائي لناتج كوثرة لجين urer عمى هالم االكاروز بنسبة % 3.4 لمدة ساعة وبفرق جهد % 77 فولت تسمسل جين urer ت معرفة تسمسؿ القواعد النتروجينية لجيف urer في) )43 عينة(, إذ ت إرساؿ )83( مايكروليتر لكؿ عينة مف ناتج تفاعؿ لجيف PCR urer الى شركة مع البادئ الخاص Macrogen الجنوبية وبعد الحصوؿ عمى النتائج جميعيا مع تسمسؿ القواعد النتروجينية لجيف في كوريا وقورنت النتائج urer الموجود في قاعدة البيانات العالمية بالرق http: NCBI Reference Sequence N2-JH لخصت نتائج تحميؿ تسمسؿ الجيف urer في الجدوؿ )5( وأظيرت أنو كاف ىناؾ )5( طفرة في )43( عينات مف الجيف, urer إذ كانت النسبة المئوية لمطف ارت (percentage of mutations) ىي ( 53 )% العينات المدروسة. وتبيف أف ىناؾ طفرة واحػػػدة في العينتيف رق )3;- 3:( اف ىذا التغاير في مكاف ونوع الطفرة قد يؤدي إلى اختالؼ تأثير ىذه الطفرة. وبعض ىػػػذه الطف ارت تؤدي إلى تغي ارت فػػػي الشف ارت الػػػو ارثية ومػػػػف ث تغير في األحماض األمينية عػػػند الترجمة التي تعد أى األسباب التي ازدت مف مقاومة ىذا الجيف)> 4 (.

10 Iraqi Journal of Biotechnology 44 جدول )7(: انوأع الطف ارت في تسمسل الجينureR في بكتيريا. Pالمعزولة mirabilis من المرضى Sample Number 70 Mutation Site 11 Codon Number 4 Wild type Codon seq TAG Mutant type Codon seq TGA Mutant type InsertionG 80 Total samples 10 2 sample mutant 17 6 GAG AGA InsertionA تأثير الطف ارت Effect of mutations يبيف الجدوؿ أف ىناؾ % 53 طفرة نوع Insertion مما قد يؤدي إلى التأثير في النمط الظاىري لكونيا تؤدي إلى تبديؿ في األحماض األمينية ومف ث في البروتيف. نوع الطف ارت ونسبتها المئوية كشؼ تحميؿ التركيب الو ارثي لجيف urer بواسطة التسمسؿ أف ىناؾ تغيي ارت و ارثية. وأظيػػػرت البيانات المػػوجودة فػػي الجدوؿ) 8( أف ىناؾ ( 3%( طفرة استبداؿ )substitution و) 3% ( طف ارت حذؼ Insertion و) 53%( طف ارت غرس )Deletion( جدول ( 8 ) : يمثل عدد الطف ارت ونسبتها الموية Type of mutations Number of mutation % Substitution 0 0 Deletion 0 0 Insertion 2 20 Total المناقشة أظيرت نتائج ىذه الد ارسة اف );54( عينة %( و المأخوذة مف )643( مريض قد )3.65: أعطت نتيجة موجبة, و تفؽ ىذه النتيجة مع نتائج )53(, وجماعتو Younis د ارسات كؿ مف Kumamoto و جماعتو )54( وكذلؾ تتفؽ مع Al-Taai )55( نتائج د ارسات محميو لكؿ مف >6 ت تشخيص )56(. Almarjani و و) 53 ( باالعتماد عمى Proteus عزلو تابعة إلى جنس Collee االختبا ارت الكيموحيوية التي أشار ليا كانت 69 وجماعتو )48( و Holt وجماعتو )57(, عزلة عائدة لمنوع P.mirabilis وبنسبة عزؿ ( %) 92.3 و 6 عزلة عائدة لمنوع.P vulgaris وبنسبة عزؿ ( 7.7 %( مف بيف مجموع البكتريا السالبة لمموف ك ار و المسببة لخمج المسالؾ البولية. أذ تميز النوع Pبكونو.mirabilis سالب الختبار االندوؿ وغير مخمر لسكر المالتوز ومنتج لمػ Ornithine P لتأكيد التشخيص لعزالت decarboxylase.mirabilis والكماؿ االختبا ارت الكيموحيوية الميمة استخدمت نظا. API 20E,)58( ) 59 (,أظيرت نتائج التشخيص المظيري و البايوكيمياوي اف نسبة عزؿ بكتريا جنسsppProteus ىي );;.:4 %( و ىذا يتفؽ مع نتائج Al-Taai)55( ولكنيا بنفس الوقت ال تتفؽ مع النتائج التي توصؿ ألييا الباحث

11 Iraqi Journal of Biotechnology 45 Khurana وجماعتو )5:( والباحث Mehr وجماعتو );5( وربما يعود ذلؾ إلى اختالؼ العتر الجينية الموجودة في دوؿ مختمفة مف العال. أوضحت الد ارسة الحالية إف معظ عزالت بكتيريا.P mirabilis حساسيتيا الى المضادات Norfloxacin و Ciprofloxacin و Meropenem, Amikacin تتفؽ ىذه النتيجة مع ما توصؿ أليو Singh وجماعتو )5344( في اليند وكذلؾ مع Raka وجماعتو )>5( أف مضاد Ciprofloxacin ىو األفضؿ في عالج التيابات المسالؾ البولية. اظيرت النتائج اف الدرجة 60 مئوية والتي أعطت أفضؿ النتائج في عدة تجارب وعند مقارنة حج ناتج التجارب مع DNA القياسي بالترحيؿ الكيربائي كاف الحج تقريبا bp) 101) وىذه النتيجة مطابقة مع نتائجZhangوجماعتو )46( باالعتماد عمى الجيف 16sRNA. وىذا مطابؽ ما أعتمده الباحثوف Limanskiĭ وجماعتو )63( و Mansy وجماعتو )64( و Takeuchi وجماعتو )65( عمى تشخيص بكتيريا.P mirabilis بواسطة الجيف 16sRNAوكذلؾ اعتمدالباحث Mollet وجماعتو )66( التسمسؿ الجيني 16sRNA في تشخيص بكتيريا.P mirabilis مف الحاالت السريرية )67( عف في حيف وجد الباحث Yang وجماعتو اف التسمسؿ الجيني 16sRNA ىو المسئوؿ المقاومة التي تمتمكيا بكتيريا.P mirabilis ضد المضادات الحيوية مف مجموعة المينوكاليكوسيد, وجماعتو عمى كذلؾ شخص الباحث Rothman )67( بكتيريا. Pباالعتماد mirabilis الجيف 16sRNA مف حاالت مرضية بوجود البكتيريا في الدمأشار الباحث Zhang وجماعتو )46( أنو يمكف االعتماد عمى جيف urer في تشخيص ىذا النوع مف البكتيريا حتى مف العينات المأخوذة بشكؿ مباشر مف الطبيعة وىذه العممية ربما تحتاج أقؿ مف ثالث ساعات. يعد جيف urer أفضؿ وأكثر تخصص مف جيف uerc في تشخيص.P mirabilis حتى لو كاف عدد البكتيريا قميؿ في العينة )68(,)65( بينما الحظ الباحثاف النوع تخصصا. Hagi وجماعتو )69(,):6( أف تشخيص.P mirabilis بواسطة الجيف urer أكثر وخالصة الد ارسة ىي إمكانية االعتماد عمى تقنية PCR لجينات srna49 تشخيص بكتريا و urer في.P mirabilis وبالتالي اختصار الوقت والكمفة وىذا ما تصبو إليو د ارسات الو ارثة الجزيئية بالنسبة لتشخيص االحياء المجيرية. References 1. Delzell efever, M.L., Urinary tract infection during pregnancy. The American Academy of family physicians, Feb Penner, J. L. (1984) Genus XI Proteus In: Bergey s Manual of Systematic Bacteriology. (Kreig, N. R. and Holt, J. G., eds.). William and Wilkins Baltimore, MD. P Chown, A. W.; Taylor, P. R.; Yoshikaw, T. T. and Guze, L. B. (1979).Anosocomial outbreak of infection due to multiply resistant Proteus mirabilis: role of intestinal colinization as amajor reservoir. J. Infect. Dis. 130: Ramakrishnan, K. and Scheid, D.C. (2005). Diagnosis and Management of acute pyelonephritis in adults.american family physician.71(5): Mobley, H.L.T.; Island, M.D.; &Hausinger, R.P.(1995). Molecular Biology of Microbial Ureases.Microbiological Reviews. 59(3): Wray, S. K.; Hull, S. I.; Cook, R. G.; Barrish, J. and Hull, R. A. (1986). Identification and characterization of auroepithelial cell adhesion from

12 Iraqi Journal of Biotechnology 46 auropathogenic isolate of Proteus mirabilis. Infect. Immun. 54(1): Zunino, P.; Piccini, C. &Legnani-Fajard, C. (1999) Growth, Cellular Differentiation and Virulance Factor Expression By Proteus mirabilis In Vitro And In Vivo. J. Med. Microbiol. 48: Rajehwari,H. ; Nagaveni,S.; Oli, A. and Chandrakanth,K. (2010) Multiple Antibiotic Resistance and Esbl Producing Klebsiella pneumonia isolated from clinical Urine Samples. 5(1): Liaw, S.J., Lai, H.C.; Ho, S.W.; Luh, K.T.& Wang, W.B. (2003) Role of RsmA in the regulation of swarming motility and virulence factor expression in Proteus mirabilis. Journal of Med. Microbiol. 52: Goldman, E. and Lorrence, H. G.(2009) Practical Handbook of microbiology. 2 nd ed. Printed in the USA. 11. CLSI.(2006) Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria that Grow Aerobically; Approved Standard M7-A7. Wayne, PA: Clinical and Laboratory Standards Institute 12. Santos, C.; Texeira, F.; Vicente, A. and Astoifi-Filho, S. ( 2003 ) Detection of C. trachomatis in endocervical smears of sexually active women in Manaus-AM, Brazil, by PCR. Braz. J. Infect. Dis., Brazil. 7: Zhang, W., Niu, Z. Yin, K. and Liu, P. (2012) Quick identification and quantification of Proteus mirabilis by polymerase chain reaction (PCR) assays. Ann Microbiol, DOI /s x 14. Sambrook, J.; Fritsch, E. and Maniatis, T. (1989) Molecular cloning and laboratory manual 2 nd ed. Cold spring Harbour laboratories, New York. 15. Collee, J.G.; Miles, R.S. and Watt, B. (1996).Practical Medical Microbiology. Churchill. Living Stone, London 16. Winfiela, M. D. and Groisman E. A. (2003) Phenotype difference between Salmonilla and Eschcerichia coli resulting from the disparate regulation of homologous genes. PNAS.101: Kolbert, CP; Persing, DH (1999) Ribosomal DNA sequencing as a tool for identification of bacterial pathogens.current Opinion in Microbiology 2 (3): Weisburg WG, Barns SM, Pelletier DA, Lane DJ (1991). "16S ribosomal DNA amplification for phylogenetic study".j Bacteriol 173 (2): Chaudhary, N. K. and Murthy, S. M. (2013) Extended ExpectrumBetalactamases in Uropathogen. Asian J Pharm Clin Res, Vol 6, Issue 3, 2013, Younis, D., Mustafa, K. and Yahia, M. (2009) Role of Some Pathogenic Bacteria in Urinary Tract Infection in Mosul City.Al-TtaqaniJ. ISSN: X Year: 2009 V: 22 Issue: 2 Yu, F., Pan, J. Ding, B., 21. Kumamato, Y., Tsukamoto, T., Hirose, T., Yokoo, A. & Takahashi, T. (1997) Comparative Studies on Activities of Antimicrobial Agents Against Causative Organisms, Isolated From Patients With U.T.I s. 11 Backgrounds of Patients.Japn. J. Antibiotic. 50: AL-Taai, H. R. R. (2005) Bacteriological, Biochemical and Molecular Study of proteus mirabilis Isolated from Urinary Tract Infections in some Hospitals of Baghdad City. PhD thesis, AL- MustansiriyaUniv, 180 p 23. Almarjani, M.F.(2000) Multiple antimicrobial resistance and some virulence factors of Proteus mirabilis isolated from urinary tract infection and study of their plasmid content. M.Sc. thesis Al- Mustansiriya Univ. (In Arabic). 24. Holt, J.G.; Krieg, N.R.; Sneath, P.H.A.; Staley, J.A.; & Williams, S.T. (1994) Bergy, s Manual of Derminative Bacteriology. (9 th ) ed. Williams and Wilkins 25. Turton,J.F.;Hatice, B.; Siu,L.K.; Mary,E.K. and Tyrone,L.P. (2008) Evaluation of amultiplex PCR for detection of serotypes K1,K2and k5 in Klabsillasp.and comparison of isolates within these serotypes. FemsMicrobiolLett 284, York, M.K.; Brooks, G.F. and Fiss, E.H.(1992). Evaluation of the auto SCANW/A rapid system for Identification and Susceptibility testing of gram negative fermentative bacilli. J. Clin. Microbiol.;30(11): Mehr, S.S.; Powell, C.V.; Curtis, N.(2004) Cephalosporin resistant urinary tract infections in young children. J. Paediatr. Child.Health. Jan-Feb. 40(1-2): Microbiol. 24: Khurana, S.; Taneja, N.; Sharma, M. (2002). Extended-spectrum beta-lactamase mediated resistance in urinary tract isolates

13 Iraqi Journal of Biotechnology 47 of family Enterobacteriaceae. Indian J.Med.Res. Oct.116: Singh, V., Chauhan, P. K.,Kanta, R., Puri, A. andgarg, B.R. (2011) Antimicrobial sensitivity and resistance pattern of bacteria causing UTI infection in pregnant women, J. of Pharmacy Research 2011,4(7), Limanskiĭ A, Minukhin V, Limanskaia O, Pavlenko N, Mishina M,Tsygenenko A (2005) Species-specific detection of Proteus vulgarisand Proteus mirabilis by the polymerase chain reaction. ZhMikrobiolEpidemiolImmunobiol 3: Mansy MSM, Fadl AA, Ashour MSE, Khan MI (1999) Amplificationof Proteus mirabilis chromosomal DNA using the polymerasechain reaction. Mol Cell Probe 13: Takeuchi H, Yamamoto S, Terai A, Kurazono H, Takeda Y, Okada Y,Yoshida O (1996) Detection of Proteus mirabilis urease gene inurinary calculi by polymerase chain reaction. Int J Urol 3: Mollet C, Drancourt M, Raoult D. (1997) rpobsequence analysis as a novel basis for bacterial identification. MolMicrobiol 1997; 26(5): Rothman, R. E. Maulik, M. D., Gabor D., Guillermo M., Charlotte A. G., Tarik W., and Thomas C. (2002) Detection of Bacteremia in Emergency Department Patients at Risk for Infective Endocarditis Using Universal 16S rrna Primers in a Decontaminated PCR Assay. J. Infect. Dis. 2002;186: Huang HS, Chen J, Teng LJ, Lai MK (1999) Use of polymerase chain reaction to detect Proteus mirabilis and Ureaplasmaurealyticum in urinary calculi. J Formos Med Assoc 98: Hickman, F. W.; Farmer, J. J. D.; Steigerwalt, A. G. and Brenner, D. J. (1982) Identification of Proteus penneri sp. Nov., formerly known as Proteus vulgarisindole negative or as Proteus vulgaris biogroup1. J. Clin. Microbiol.15: Naas, T.; Benaoudia, F.; Massuard, S. &Nordman, P. (2000) Integron-located VEB-1 extended- spectrum β -Lactamase gene in a proteus mirabilis clinical isolate from Vietnam. J. Antimicrob. Chemoth. 46: